세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

Nan Zhang; Edward Membreno; Susan Raj; Hongjie Zhang; Liakot A Khan; Verena Gobel

doi:10.3791/56101

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방법 논문

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

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DOI:

10.3791/56101

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2017년 10월 3일

Nan Zhang¹^,² , Edward Membreno¹ , Susan Raj¹ , Hongjie Zhang¹^,³ , Liakot A Khan¹ , Verena Gobel¹

¹Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, ²College of Life Sciences, Jilin University, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau

이 논문에서

요약

C. 선 충 배설 운하 드 노 보 편광 막 속의 시각적 vivo에서 분석에 대 한 고유한 단일 셀 모델입니다. 이 프로토콜 표준 유전 RNAi 및 이미징 접근, 식별 및 분자 단 세포 tubulogenesis, 그리고 꼭대기 막 및 루멘 속 감독의 특성에 대 한 적응의 조합을 설명 합니다.

초록

4 선 충 C. 배설 운하는 좁은 튜브를 거의 동등 하 게 멀리 확장된 세포내 endotubes 구축 하 고 막 및 submembraneous 루멘 안정화와 함께 단일 셀에서 동물의 길이 통해 확장 꼭대기 캐릭터의 골격입니다. 배설 셀 확장의 길이 약 2, 000 번 드 노 보 편광 막 속, 세포내 루멘 morphogenesis vivo에서 평가 대 한 독특한이 모델을 만드는이 운하를 생성 및 단 세포 tubulogenesis입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 표준 라벨, 이득 및 손실-의-기능 유전자 또는 RNA 간섭 (RNAi) 결합 하는 방법을 보여줍니다-, 그리고를 사용 하 여이 모델 기능 분자 수준에서이 프로세스를 분석 하 고 시각적으로 해 부 현미경 접근. 표기 방법의 예를 들어, 프로토콜 tubulogenesis의 실시간 분석을 위한 유전자 변형 동물 형광 성 융해 단백질의 생성을 설명합니다. 유전 접근의 예를 들어, 그것은 함수 이득 낭 성 운하 형을 수정 하도록 설계 된 시각적 RNAi 기반 상호 작용 스크린의 핵심 포인트를 강조 표시 합니다. 특정 방법을 설명 하는 방법: 레이블 및 형광 단백질; 표현 하 여 운하를 시각화 타겟된 RNAi 라이브러리를 구성 하 고 전략을 RNAi 운하 morphogenesis;의 분자 분석에 대 한 심사 시각적으로 고기;의 수정 평가 형광 현미경 검사 법;를 해 부하 여 점수 confocal 현미경 검사 법;에 의해 더 높은 해상도에서 subcellular 운하 구성 요소 특징 그리고 시각적 매개 변수를 측정. 방식은 확인 및 intracellular 루멘 phylogenetically 보존된 과정에 참여 하 고 단 세포 유전자에 대 한 선 충 C. 배설 채널의 활용에 관심이 있는 탐정에 대 한 유용 morphogenesis 튜브.

서론

모든 내부 장기의 튜브, 전송 및 가스, 액체 및 영양분의 교환 및 변화 낭비의 배설물 같은 그들의 여러 가지 기능에 대 한 중요 한 구성 됩니다. 그들의 편광된 캐릭터, 독특한 꼭대기와 lumenal 멤브레인과 이러한 특정 기능, 적응 하 고 결함 그들의 엔도-및 플라즈마 멤브레인 시스템의 속에는 인간의 질병¹^,²의 빈번한 원인이. 튜브는 맥 관 구조와 내부 장기의 대부분은 다세포 이며 intercellularly;는 루멘을 형성 그러나, 침 루멘을 형성, 단 세포 관, 수 예, 나타낼 만큼 인간의 모 세관 침대²의 30-50%. 비록 그들의 microdomains 튜브의 특정 기능 (예를 들어, 꼬마 장 microvilli 대 배설 운하 canaliculi에 따라 다를 수 있습니다 멀티-및 단 세포 튜브의 편광된 막 구성 면에서 유사 하다 선 충; C. 선 충 장 tubulogenesis 종이 동반 참조)³. 편광된 막 속 및 tubulogenesis의 원리는, metazoans 중 보존 하 고 유사한 분자 기계는 그들에 지시