Method Article

Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용

DOI:

10.3791/56122

⸱

July 19th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 2Diagnostic Systems Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 3Microscopy Innovations LLC

In This Article

Summary

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이 프로토콜은 BSL-2, -3 또는 -4 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 음성 염색 바이러스 샘플을 제공합니다. 여기에는 투과 전자 현미경 그리드를 보호하고 생체 내에서 난기류 환경에서 사용자가보다 쉽게 ​​취급 할 수있게 해주는 혁신적인 가공 캡슐의 사용이 포함됩니다.

Abstract

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Transmission electron microscopy (TEM)는 나노 미터 해상도의 바이러스 및 기타 미생물 병원체의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 대부분의 생물학적 물질은 전자를 산란시켜 이미지를 생성 할 수있는 조밀 한 요소를 포함하지 않습니다. 따라서 시료 주위에 짙은 중금속 염을 포함하는 음성 염색이 필요합니다. TEM 하에서 현탁액에서 바이러스를 가시화하기 위해서는 나노 미터 두께의 투명한 표면으로 코팅 된 작은 그리드에 적용해야합니다. 크기가 작고 부서지기 쉽기 때문에이 그리드는 취급하기가 어렵고 기류로 쉽게 움직일 수 있습니다. 얇은 표면은 쉽게 손상되어 이미지를 어렵게하거나 불가능하게 만듭니다. 감염성 바이러스는 생물 안전성 캐비닛 (BSC)에서 처리해야하며 일부는 생물학적 환경 실험실 환경이 필요합니다. 특히 생물 안전성 수준 (BSL) -3 및 -4로 바이러스를 염색하는 것은 이러한 환경이 더욱 난기류이며 기술자가 필요하기 때문에 특히 어려움o 손재주를 감소시키는 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.

이 연구에서 우리는 생물학적 성취에서 음성 염색 바이러스를 돕기위한 새로운 장치를 평가했습니다. 이 장치는 전문 피펫 팁으로 작동하는 캡슐입니다. 그리드가 캡슐에로드되면 사용자는 간단하게 캡슐에 시약을 흡인하여 캡슐화 된 그리드에 바이러스와 얼룩을 전달하여 그리드의 사용자 처리를 제거합니다. 이 기술은 BSL-3 또는 -4 생체 적합에 사용하기 위해 특별히 설계되었지만 바이러스의 음성 염색을 용이하게하여 모든 실험실 환경에서 시료 준비를 쉽게 할 수 있습니다. 이 같은 방법은 나노 입자, 거대 분자 및 유사한 표본의 음성 스테인드 TEM 표본을 준비하는 데에도 적용 할 수 있습니다.

Introduction

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투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM)은 전통적인 광학 현미경 1 , 2 , 3 , 4 로 볼 수 없을 정도로 작은 생물 표본의 형태 및 초 미세 구조를 관찰하는 데 효과적인 도구입니다. TEM은 매우 얇은 표본을 통해 전자를 쏘아 전자가 빛보다 훨씬 짧은 파장을 가지므로 고해상도 이미지를 생성합니다. 전자를 구부리거나 차 단하는 샘플의 영역은 어둡게 보이고 전자 발광 인 영역은 흰색으로 보입니다.

전자 밀도가 낮 으면 전자를 산란시킬 수 없으므로 TEM 하에서 바이러스를보기가 어렵습니다. 음성 염색은 대조를 만들고 TEM으로 바이러스를 관찰하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법입니다. 최초의 음성 염색 절차는 Hall (1955)과 Huxley (1957)가 관찰 한 실험을 바탕으로 1959 년 Brenner와 Horne에 의해 제안되었다전자 밀도가 높은 물질에 잠길 때 역으로 대조되는 생물학적 구조의 출현 5 . 네거티....

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Protocol

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1. 바이러스 샘플 작업 전에 BSL-2 환경에서의 실험 준비

  1. Formvar 및 탄소 코팅 TEM 구리 격자 (일반적으로 200-400 메쉬)를 준비하거나 구매하십시오.
  2. 코팅 TEM 그리드를 캡슐에 넣습니다.
    1. 이 과정을 쉽게 수행하려면 확대 된 렌즈를 사용하십시오. 하나 또는 두 개의 그리드가 각 캡슐에 삽입 될 수 있습니다. 원하는 경우이 단계를 없애기 위해 사전로드 된 캡슐을 구입할 수 있습니다.
  3. 삽입 된 TEM 코팅 그리드가있는 캡슐을 다른 소모품 및 시약과 함께 바이러스가 부식 될 생물 부착으로 옮깁니다.

2. 수용성 글루 타르 알데히드와 1 % 오스뮴 테트 록 시드 (Tetroxide Vapour Inactivation)를 이용한 생물학적 성질에서 네가티브 염색을위한 캡슐 방법

  1. biocontainment BSC 내부 피펫에 연결된 캡슐에 바이러스 현탁액 40 μL를 대기음.
    참고 : 피펫은 th에 붙어 있습니다.e 캡슐이 완성 될 때까지 기다린다. 바이러스 준비는 이전의 출판물 14 에 따른다.
  2. 수평 방향으로 ....

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Results

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캡슐 방법은 TEM 이미징을위한 양질의 음성 염색을 생성합니다.

첫째, 수동 액적 법과 자이레 에볼라 바이러스에 대한 캡슐 방법을 모두 사용하여 생성 된 이미지의 품질을 평가했습니다. Ebolaviruses는 Marburg 바이러스와 함께 Filoviridae 가족의 구성원입니다. 에볼라 바이러스는 전형적으로 직경이 80 내지 100 nm이고 길이가 1,000 nm 이상일 수있다. 에볼라 바이러스는 BSL-4 생물학적 환경에서 처리해야합니다. 그림 2 는 수동 물방울 방법과 부정적인 얼룩에 대한 캡슐 방법을 사용하여 생성 된 이미지를 보여줍니다. 그림 2A (수동 액적 법)와 그림 2B (캡.......

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Discussion

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음성 염색은 바이러스, 단백질 복합체 및 나노 입자를 평가하고 크기를 정하는 데 유용한 TEM 기술입니다. 시약에서 네거티브 얼룩으로 수동 그리드 이동에 의한 이들 시편의 액적 준비는 반세기 이상 동안 고전적인 프로토콜이었습니다. 그것은 간단한 과정이지만, 성공적인 완료를 위해 훈련을 통해 얻은 전문 지식이 필요합니다. 탁월한 음성 염색은 여전히 ​​최첨단 기술로 간주되며 많은 TEM 실험실에서 매우 바람직합니다. 캡슐 방법은 수동 액적 법보다 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고 있는데 특히 생물학적 실험실에서 그러합니다. 첫째, 수동 액 적법은 성공적으로 수행되기 전에 상당한 훈련과 경험이 필요하며 간단한 피펫 팅으로 엔벨로프 레벨 기술자가 캡슐 방법을 쉽게 사용할 수 있습니다. 수동 액 적법의 가장 큰 문제점은 BSL-3 및 BSL-4 PPE에서 포셉이있는 TEM 그리드를 성공적으로 다루는 것입니다.o 크게 감소 된 촉감과 손재주. 깨지기 쉬운 코팅 된 TEM 그리드는 포 셉터로 쉽게 손상되거나 구멍이 뚫립니다. 코팅 된 TEM.......

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Disclosures

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이 기사에서 언급 한 의견, 해석, 결론 및 권고 사항은 저자의 것이며 의견이 미 육군이나 국방부에서 반드시지지하는 것은 아닙니다.

Acknowledgements

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정제 된 에볼라 나노 -VLP를 제공 한 Dr. John Carra와 Rowena Schokman, Chikungunya 바이러스를 제공 한 Dr. Rajini Mudhasani 및 Ebolavirus glycoproteins을 발현하는 Murine Leukemia VLP를 제공 한 Dr. Charles (Jason) Shoemaker에 감사드립니다. 여름 인턴쉽 프로그램 (SIP) 및 과학 및 공학 견습 프로그램 (SEAP) 및 실험실 안전 교육을위한 Catherine Wilhelmsen 박사를 지원 한 MAJ Carl Soffler에게도 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Formvar/carbon coated TEM gridsSPI3420C-MB200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g 캡슐EMS85010-01box
mPrep/f 커플러EMS85010-11standard 16/Pk
glutaraldehdydeEMS1632050% 용액, EM grade
Osmium TetroxideEMS191904% 수용액
우라닐 아세테이EMS22400분말
칼륨 포스포텅스텐 산EMS19500분말
여과지Whatman1450-090크기 50
전송 전자 현미경JEOLJEM-1011TEM
트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H.....

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Negative StainingTEM GridsBiocontainmentVirus TEMCapsule MethodElectron MicroscopyGlutaraldehyde FixativeUranyl AcetatePhosphotungstic AcidOsmium Tetroxide

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