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방법 논문

Intratracheal 접종의 Fischer 344 쥐 Francisella tularensis 와

6.6K 조회수

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DOI:

10.3791/56123

⸱

2017년 9월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1South Texas Center for Emerging Infectious Diseases, University of Texas San Antonio, 2Midwestern University

이 논문에서

요약

이 프로토콜 설명으로 Fischer 344 쥐의 예방 접종 intratracheal Francisella tularensis. 이 이렇게 모방이 잠재적인 biothreat 에이전트에 인간의 폐 노출 백신과 폐 tularemia에 대 한 치료 효능을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

폐 감염 박테리아 Francisella tularensis 심각 하 고 잠재적으로 치명적인 질병, tularemia, 인간에서 발생할 수 있습니다. 인 간에 대 한 승인된 tularemia 백신의 현재 부족, 연구는 적절 한 동물 모델을 활용 하 여 백신 개발에 집중 된다. Fischer 344 쥐 인간의 F. tularensis 감염 민감성을 반영 하 고 따라서 tularemia 백신 개발을 위한 매력적인 모델 하는 모델로 떠오르고 있다. F. tularensis 와 Fischer 344 쥐의 Intratracheal 접종 모방 인간에서 폐 노출 합니다. 쥐 기관지에 성공적인 배달 폐 배달을 위해 중요 하다. 조명으로 후 두 경 제대로 마 취 쥐;의 기관을 넣어야 하는 데 사용 됩니다. 기관 내에서 정확한 위치 호흡을 감지 하는 간단한 장치에 의해 결정 됩니다. 삽 관 법, 따라 F. tularensis 문화는 주사기를 통해 측정 된 복용량에 전달 됩니다. 이 기술은 표준화 백신 효능 평가 하 쥐 기관지 내 F. tularensis 의 폐 전달 합니다.

서론

F. tularensis (피트) 인간의 질병의 원인 tularemia. 박테리아는 폐 경로 통해 획득 하는 경우는 높은 사망률 및 사망1폐 렴 성 tularemia을이 끈다. F. tularensis aerosolized 형태와 관련 된 위험으로 인해 biothreat 에이전트 간주 됩니다 그리고 현재 미국에서 인간 사용을 위해 승인 없는 백신 집중 노력 백신 및 치료 대책이 세균성 biothreat의 불법 사용에 대 한 인간의 인구를 보호 하기 위해 폐 렴 성 tularemia 개발 진행 현재입니다.

Tularemia 연구의 많은 마우스 모델의 F. tularensis 감염, 생쥐의 극단적인 감도 및 시 약의 보급에 집중 했다. 그러나, 쥐가 모델2백신 효능을 입증의 어려움으로 인해 백신 개발에 대 한 어려운 모델을 입증 했다. 최근, Fischer 344 쥐 tularemia 백신 개발3모델로 개발 되었습니다. 다양 한 F. tularensis 종에 Fischer 344 쥐의 감도 인간의 감도4, 모방 및 쥐 보호 될 수 있다 F. tularensis 폐 문제에 대 한 예방 접종에 의해 보호 하기 위해 알려진 라이브 백신 긴장으로 인간5,,67. Fischer 344 쥐 인간의 F. tularensis 감염의 일부 기능 모델, 폐 F. tularensis 으로부터 보호 하는 백신의 개발에 대 한 매우 유용한 모델 수 있습니다 노출.

효과적인 백신 F. tularensis폐 노출에 대 한 인간을 보호 하기 위해 필요 합니다. 무기 F. tularensis 에서 대부분 폐 노출 aerosolized 박테리아 폐8에 흡입 될 것 이다. 그러나, F. tularensis 의 어로 졸 생성 위험 하 고 복잡 하며 전문된 장비 및 포함. 대체 경로 아마도 더 쥐에서 폐 노출의 여러 실험실에 대 한 적응력이 부족 한 전문된 장비는 intratracheal 접종6통해. 이 기술은 마 취 쥐의 기관지 내 카 테 터의 올바른 배치에 대 한 후 두 경을 사용합니다. 기도, 식도, 보다는 오히려 내의 배치는 폐에서 공기를 시각화 하는 간단한 장치에 의해 확인 됩니다. F. tularensis 는 이후 주사기, 카 테 터는 박테리아의 폐 전달 되도록에 공기의 도입 선행으로 관리 하 여 카 테 터를 통해 폐로 전달. Jemski5 이전 그 F. tularensis intranasal 노선을 통해 Fischer 344 쥐에 주사 수 없습니다 수 교양 폐에서 3 일 후 접종까지 보고, 쥐에서 그 intranasal 접종을 나타내는지 않습니다 하는 반면, 하지 직접 전달에서의 결과 폐에 박테리아.

F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) 형태의 선택 에이전트 Biosafety 수준 3 (BSL3) 견제 절차, videography 방지 하는 필요 합니다. 그러나, F. novicida (Fn) 선택 에이전트 상태 건강 한 인간, 그것의 avirulence 때문에 면제 이며 Biosafety 수준 2 (BSL2) 조건9,10에서 안전 하 게 이용 될 수 있다. 또한, Fn F. tularensis 폐 노출 intratracheal 접종11,,1213를 통해 전달 하는 경우에 대하여 보호할 수 있는 라이브 감쇠 백신에 대 한 기준 역할을 합니다. 여기에 제시 된 기술은 인간을 위한 모델 쥐를 이용 하 여 폐 경로 통해 발생 하는 감염의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 특수에 어로 졸 생성 장비에 대 한 필요 없이 수행할 수 있습니다. Fn는 여기 촬영 기술을 위해 사용 되었다.

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프로토콜

이 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장에 따라 수행 되었다. 설치류와 관련 된 동물 프로토콜 프로토콜 MU009(RA) 텍사스 대학 샌 안토니오 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다.

1. 카 테 터 준비, 기도 표시기와 F. tularensis Inoculum

  1. 준비 테 (20 G x 2에서)
    1. 잘라 바늘에 무딘 하 고 부드러운 바늘의 팁으로 마무리 갈기 20 G x 2는 로타리 도구.
      참고: 무딘된 바늘의 길이 완전히 무딘된 바늘에 장착 하는 경우 카 테 터 소매에 약 3 mm를 폐지 하는 금속 팁을 허용 해야 합니다. 무딘된 바늘 카 테 터 구조 강성 기도에 카 테 테 르의 배치 허용을 제공 하 고 카 테 테 르 소매에서 튀어나와 무딘된 바늘 팁의 부재 기도에 부상 방지.
    2. 무딘된 바늘과 70% 에탄올을 사용 하 여 카 테 터를 청소 하 고 15 분의 자외선 아래 소독
  2. 준비 기도 표시기
    1. 트림 테 오프닝에 앉아서는 공기 단단한 물개를 형성 하는 팁을 수 있도록 1000 µ L 피 펫 팁.
    2. 200 µ L 졸 장벽 피 펫 팁 및 장소 이전 트림된 1000 µ L 피 펫 팁 내부에서 필터 제거.
    3. 팁 팁 다운 지적 이다 때 필터 1000 µ L 피 펫 팁 안에 자유롭게 이동할 수 있도록.
  3. F. tularensis Inoculum
    1. 37에 적절 한 천 배지에서 하룻밤 성장 F. tularensis 스트레인 ° C. 다쳤어요 약 100 µ L로는 살 균 한 천 배지에서 세균성 잔디의 접종 루프를 사용 하 여 포함 하는 적절 한 액체 성장 매체의 250 mL 삼각 플라스 크 500ml 접종 (Fn에 대 한: tryptic 간장 국물 (TSB) 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충)와 37에서 밤새 흔들어 품 어 ° c.
      참고: F. novicida는 비디오에 사용 되는 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충 tryptic 간장 agar (TSA) 접시에 성장 했다.
    2. 하룻밤 성장된 액체 문화 10 분 동안 실 온에서 4,221 x g에서 원심 및 박테리아 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 제거.
      주의: 따르십시오 기관 ' s biosafety 권장 사항 폐기 상쾌한.
    3. 부드럽게 다시 일시 중지 적절 한 액체 매체의 25 mL와 함께 세균 펠 릿 (Fn: 0.1 %L-시스테인 염 산 일 수화물 보충 하는 TSB) 25 mL 피 펫을 사용 하 여 10% 글리세롤을 포함.
    4. 1 mL 피 펫, 약 병에 500 µ L aliquots에 resuspended 세균성 문화 수를 사용 하 여 드라이 아이스 또는 에타 놀 목욕에서 동결 하 고-80에서 저장 ° c.
    5. 언된 문화 튜브의 titer를 확인 하려면 두 언된 튜브-80 ° C에 저장 된 제거, 얼음에 녹여 및 직렬 희석에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 성장 매체에 도금 하 여 다음을 수행 (Fn: 0.1%를 포함 하는 TSA L-시스테인 염 산 염)입니다. 격판덮개는 37 ° C에서 incubated 24-48 h 및 콜로 니 형성 단위 (CFU) 냉동된 문화 튜브 (두 병의 평균) 내의 세균 세포의 수를 계산 하려면 열거 됩니다.
    6. 녹고 얼음, 냉동된 유리병으로 세균 inoculum을 준비 하 고 10 7 CFU/100 µ L의 최종 농도에 PBS 가진 문화를 희석. inoculum 100 µ L에서 원하는 CFU 보장할 농도에 있어야 한다 (는 inoculum 내 글리세롤의 최종 농도 쥐의 질을 방지 하기 위해 이상 3%, 수 없습니다). -80 ° C에 저장 하는 냉동된 문화 튜브 준비 후 최대 6 개월까지 사용할 수 있습니다.

2. 마 취를 쥐

  1. 제대로 운영 isoflurane 기화 기는 마 취 기계 마 취 실 연결.
  2. 연결 시스템을 청소 하는 가스 마 취 챔버에 튜브를 청소 하는 가스.
  3. 4 L/분에 마 취 기계에 산소 흐름을 엽니다
  4. Isoflurane 기화 기 5%로 설정.
  5. 마 취 약 실에 있는 쥐를 놓습니다.
    참고: 우리는 일반적으로 8-10 주 오래 된 (130-180 g); 사이 쥐 활용 젊은 쥐는 입 구멍의 작은 크기 때문에이 기술을 통해 접종 어렵다.
  6. 마 취의 유도, 자리를 차지 하는 경우 5 %isoflurane 쥐, 2 L/min에 산소 효과를 유지 합니다. 이 대해 3-10 분 걸립니다
  7. 품질 및 호흡 및 심장 박동, 그리고 발가락 꼬 집 음 시험에서 반사 자극에 반응의 속도 의해 마 취의 깊이 결정합니다. 마 취의 이상적인 깊이 각 호흡 사이 1-1.5의 수로 표시 됩니다.

3. Intratracheal 접종

  1. 마 취 약 실에서 쥐를 제거 하 고 쥐 삽 관 법에는 쥐를 dorsally 장소. 쥐의 앞 니 자리에 쥐를 잡으려고 홀더 연결.
    참고: 쥐 절차 동안 자각을 시작, 카 테 터를 제거할 수 있습니다 고 쥐에 마 취의 깊이 비행기를 도달 하는 마 취 챔버.
  2. 지배적인 손을 지원 손 같은 쪽에 넓은 포인트 드레싱 집게 손가락으로 혀를 사용 하 여.
  3. 사용 손 지원 하 고 쥐에 대 한 후 두 경으로 혀를 보안 ' s 낮은 턱 및 기관지와 식도 동물의 시각화. 기도 열리고 쥐 통풍으로 닫습니다.
  4. 삽입 카 테 테 르 바늘-20 게이지 무딘를 포함 하는 단계 1.1, 기관에서에서 준비 하 고. 약간의 저항이 있을 수 있습니다 및 기관지로 삽입 될 수 있습니다 " 울 퉁 불 퉁 " 테 바르고 tracheal 연골 때문. 습기 또는 얕은 호흡, 기도 기도의 시각화를 방지 하는 후두개에 의해 덮여 수 있습니다. 열고 기도 밝히기 연골 플랩 하면 후두개 연골의 가장자리를 부드럽게 만지고.
  5. 제거 하면서 테 테에서 무딘 바늘 기도에 남아 있다.
  6. 쥐를 기관지에 삽입 된 카 테 터 주위 호흡 수를 전달 하는 몇 초 수.
  7. 단단히 여 카 테 터에 기관 표시기 좌석. 졸 방 벽의 운동 테 기도에 올바르게 삽입 하는 것을 나타냅니다.
  8. 동물의 가슴 삽 관 법의 평면에 수직으로 직면 하 고 그런 쥐 삽 관 법 대에 누워 있다 확인 하십시오.
  9. 기관 표시기를 제거 하 고 100 µ L를 제공 (10 7 CFU) F. tularensis 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 포함 된 inoculum의 단단히 석 카 테 터 오프닝에 대 한 팁.
  10. 공기 가득한 1 mL 슬립 팁 투베르쿨린 주사기를 연결 하 고 inoculum 쥐의 폐에 도달 되도록 공기의 300 µ L 제공.
  11. 기도에서 카 테 터를 제거 하 고 수술 플랫폼에서 쥐를 제거.
  12. 자각 하는 감 금 소도 돌아갑니다 쥐를 수 있습니다. 호흡이 정상으로 돌아왔다는 있는지 확인 하십시오.
  13. 결정에 F. tularensis CFU 기도에 inoculum 1.3.5 CFU 확인 단계에서 설명한 대로 배달.
  14. 는 inoculum 대신 100 µ L PBS 가진 unvaccinated (순 진) 동물에 3.1 3.9 단계를 반복.

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결과

쥐에 F. tularensis 의 intratracheal 접종에 체액 반응 UV 활동 되지 않 ㄴ 박테리아에 대 한 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 결정 될 수 있다11위에서 설명한 대로. 사 전체 셀 박테리아 Fischer 344 쥐의 총 면역 글로불린 G (IgG) 응답은 Fn의 감쇠 긴장 평가 게시물-intratracheal 접종 (107 CFU inoculum) 14 일과 하루 28 (그림 1)에서. Mock 접종 쥐 PBS intratracheally를 받았다. 순진한 모의 예방 접종 동물 기준으로 Fn 후 접종에 대 한 혈 청 항 체 titers 증가 intratracheal 백신 효능을 나타냅니다. 낮은 혈 청 반응 잘못 된 intratracheal 배치를 나타낼 수 있습니다.

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토론

Fischer 344 쥐 tularemia 백신 개발3에 대 한 중요 한 모델이 되 고 있다. F. tularensis 폐 경로 통해 노출은 이러한에 어로 졸으로 전달 하는 때문에 F. tularensis의 무기 형태에 대 한 효능을 보여주는 중요 합니다. 쥐의 Intratracheal 접종 생성 장비, 비싼, 크고 복잡 한에 어로 졸에 대 한 필요 없이 F. tularensis 쥐 폐의 노출을 수 있습니다. 또한 F. tularensis 형태의 선택 에이전트를 활용 하 여 모든 실험 BSL3 제약, 일반적으로 심각 하 게 제한 된 공간에서 발생 하는 필요 합니다. 따라서,이 기술은 그 작업 환경 내에서 유 숙 하는 추가 장비의 양을 최소화 합니다.

Fn videography 활용 F. tularensis 긴장 때문에, 모든 기술 BSL2 제약에서 수행 했다...

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공개 사항

저자 공개할 게 없다

감사의 글

이 연구는 계약 HDTRA1-14-C-0116, 방위 위협 감소 기관 (DTRA) 감염 유전체학 (국방부 #W911NF-11-1-0136)에 우수를 위한 센터에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GreenLine 광섬유 블레이드 크기 0Carefusion5-5231-00Macintosh American profile
GreenLight 시스템 후두경 핸들Carefusion4559GSP
Exel International Safelet IV 카테터EXEL INTERNATIONAL26743
슬립 팁 멸균 주사기 1mLBD309659
브로드 포인트 드레싱 엄지 집게써모 사이언티픽76-302
200 μ L 배리어 팁GeneseeScientific24-142
1,000 μ L 피펫 팁Olympus Plastics24-173
Dremel 3000-2/28 로터리 도구 키트Dremel3000228
설치류 삽관 스탠드Braintree ScientificRIS 200
IsofluraneButler ScheinNDC 11695-6776-2
설치류 마취기SurgivetVTC302 Classic T3
설치류 마취실브레인트리 사이언티픽AB 1

참고문헌

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  12. Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639(2012).
  13. Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).

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