식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성

요약

발기인 식 분석은 유전자 규정의 이해 및 대상 유전자의 spatiotemporal 식 개선에 중요 한. 여기 우리는 식별, 격리, 식물 발기인을 복제 하는 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성을 설명합니다.

초록

업스트림 시퀀스 시퀀스를 코딩 하는 유전자의 발기인 시퀀스도 불린다. 발기인의 식 패턴을 공부 하는 것은 유전자 규정과 spatiotemporal 식 패턴 대상 유전자의 이해에 매우 중요 한입니다. 다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 이 연구에서 우리는 유전자 변형 털 뿌리에 Phaseolus vulgaris 의 rhizobial 공생 특정 결 절 개시 (NIN) 발기인의 spatiotemporal 식 패턴 조사. 식물 게놈 데이터베이스와 식별, 분석 도구를 사용 하 여 격리, 그리고 복제 공상 기자 transcriptional 퓨전에 P. vulgaris 닌 발기인 β-glucuronidase (거 스) 거 스 enhanced::GFP. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris Agrobacterium rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 10 ~ 12 일에 ≥2 cm 털 뿌리를 생성합니다. 다음으로, 우리 Rhizobium 접종 후 접종의 정기적으로 털 뿌리에 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가. GUS 활동에 의해 묘사 된 우리의 결과 표시 닌 발기인 nodulation의 과정에서 활동적 이었다. 함께, 현재 프로토콜 식별, 격리, 복제, 그리고 일반적인 콩 털이 뿌리에서 식물 발기인을 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.

서론

발기인은 관심사의 유전자의 표현 규제 이해에 중요 한 역할을 하는 중요 한 분자 생물학적 도구. 프로모터는 상류에 있는 DNA 순서는 번역의 개시 코 돈 유전자의 순서 그리고 그들이 유전자;의 중앙 규제 정보 따라서, 그들의 올바른 주석 및 특성화는 유전자 기능을 이해 하는 중요 한. 식 패턴에 따라 공장 발기인 구성, 조직, 또는 개발 단계 관련 및 유도할 수 있는¹으로 분류 됩니다. Transcriptomic 기술, 컴퓨터 모델링, 개선 및 다양 한 식물 종에 대 한 게놈 시퀀스의 수를 증가의 가용성 발기인 시퀀스²의 대규모 예측을 촉진 했습니다.

다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 다른 모델 식물 달리 일반적인 콩 콩과 식물 (P. vulgaris) 유전자의 기능 특성의 안정적인 유전자 변환에 대 한 sp. Phaseolus 완강히 특성상 주로 장애가. 일시적인 변환 시스템 빠른 유전자 기능 분석 연구³에 대 한 대체 역할을 합니다. 콩과 공생 연구, 콩과 식물 호스트 공장 및 rhizobial 박테리아 사이의 상호 작용 발기인 연구 및 결 절 특정 유전자의 기능 분석에 대 한 가장 온순한 모델 시스템 중 하나입니다. 지금까지,이 공생에 관련 된 여러 가지 콩과 발기인 되었습니다 특징, 즉, 개자리속 truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, 로터스 나무 키 클 롭 스, UBQ⁶, VAG1⁷, 글리신 최대 PT5 ⁸, Exo70J⁹, P. vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, 토르¹⁵, 등. Cis 요소 직접 영향을 미치는 유전자 규칙. 녹음 방송 요인 ENBP1A의 초기 nodulin VfENOD12, Cis 규제 지역 (bp −692)에 한다이 얼 faba¹⁶의 결 절 primordia에서 취재 원 유전자의 표현을 용이 하 게 한다. Cis 규제 지역의 교체 (−48 bp −161) 결 절 특정 발기인의 leghemoglobin GLB3는 분리와 발기인 δ-p35S 및 δ-pNOS, 결 절 특이성의 손실 귀착되 었 다 잘리고 발기인 활동^{17 감소} .

이전 보고서 표시 녹음 방송 요인 닌 루트 머리 세포에 rhizobial 감염의 개시에 필요한 고도 결 절 organogenesis L. 나무¹⁸에 대 한 필수적 이다. 현재 연구에서 우리는 식별, 격리, 복제 및 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 우리 P. vulgaris 의 rhizobial 공생 전용 닌 발기인을 선택 하 고 공상 기자 거 스 enhanced::GFP transcriptional 퓨전에 복제. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris A. rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 2 주 미만에 털이 뿌리를 생성합니다. 마지막으로, 우리는 거 스 얼룩에 의해 식민지 rhizobia 루트 혹에서 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가.

여기에 설명 된 절차는 콩과 식물 식물의 nodulation 및 mycorrhization¹¹ 의 연구 뿐만 아니라 뿌리¹⁹에서 발기인 식 패턴의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.

프로토콜

1. 식별, 격리 및 피 Vulgaris 닌 발기인의 복제

1. 관심사의 유전자의 발기인 순서를 식별 합니다. 일부의 게놈 데이터베이스와 분석 도구 Phytozome, 합 식물, NCBI, 등 A 콩과 발기인 P. vulgaris 닌 (PvNIN; 식물에 사용할 수 있는 Phvul.009G115800)는이 연구²⁰에 사용 되었다.
2. 디자인 oligos 게이트웨이 또는 벡터 시스템에 따라 복제 하는 전통적인 제한 효소 사용 (그림 1A).
   참고: 표준 (25-35 bp), desalted 뇌관 작업 괜 찮 아 요. 발기인과 유전자 사이의 측면 역 올리고 시퀀스는 좋습니다.
3. 갓 격리 P. vulgaris 에서 PvNIN 발기인 지역 (또는 관심사의 유전자의 발기인 지구)를 증폭 발기인 특정 올리고 세트를 사용 하 여 게놈 DNA. 높은 중 합 효소를 사용 하 여 다음 PCR 조건: 95 ° C 5 분; 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30 초, 1 분에 72 ° C); 그리고 5 분 동안 72 ° C입니다.
4. 7 x 10 cm 젤 트레이에 60 V 1 %agarose 젤에 증폭된 한 파편을 실행 하 고 해당 amplicon elute (700 bp, 그림 1B) 및 제조업체의 지침에 따라 pENTR/D-이동 벡터에 클론.
5. 2 µ L 유능한 대장균 으로 반응의 변환 lysogeny 형제 (파운드) 50mg/L 대 (Kan50)와 보완에 제조업체의 지침과 변환 혼합물의 플레이트 150 µ L를 사용 하 여 셀. 밤새 37 ° C에서 도금된 세포 성장.
6. 선택 3-6 식민지 문화 그들 파운드 매체 포함 하는 Kan50에서에서 하룻밤. 플라스 미드의 선택 방법을 사용 하 여 DNA를 분리 하 고 벡터 특정 M13 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해 플라스 미드 분석. PCR, 플라스 미드, oligos의 오후 0 3의 사용 100 ng에 대 한 10 X PCR 버퍼, 0.5 U Taq DNA 중 합 효소, 그리고 dNTPs 10 m m.
7. 사용 하는 PCR 증폭 다음과; 3 분;에 대 한 95 ° C 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30에 대 한 s, 75 72 ° C s); 그리고 7 분에 대 한 72 ° C 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 시각화. 올바른 삽입 324 bp 밴드 (그림 1C) 밴드 1024 혈압과 삽입 지 없이 벡터에 있는지 확인 합니다.
8. LR 반응 항목 벡터 (pENTR/D-이동-PvNIN)와 대상 벡터 pBGWFS7.0²¹ 제조업체의 지침에 따라 상업 효소 혼합을 사용 하 여 수행 합니다.
9. 유능한 대장균 으로 LR 반응의 2 µ L 변환 파운드 100 mg/L spectinomycin (Spe100)의 보충에 제조업체의 지침과 접시 150 µ L의 변환에 설명 된 대로 표준 기술을 사용 하 여 셀. 밤새 37 ° C에서 도금된 세포 성장.
10. 5 식민지 약을 선택 하 고 Spe100를 포함 하는 파운드 매체에 하룻밤 문화. 선택 방법을 사용 하 여 DNA 플라스 미드를 분리 하 고 발기인 특정 oligos를 사용 하 여 PCR에 의해 플라스 미드 분석.
11. 1.3 단계에서 PCR 상태를 사용 합니다. 증폭을 확인 하는 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 시각화 합니다. Amplicons는 700 혈압.
12. 긍정적인 플라스 미드 pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (그림 1D) 삽입의 진위를 확인 하기 위해 발기인 특정 oligos와 시퀀스.
13. 그러나 A. rhizogenes 긴장 K599 (, A. rhizogenes 의 다른 변종 사용할 수 있습니다)에 플라스 미드를 변환. 다음 설정으로 1mm 베트에 electroporate 및 electrocompetent 세포의 50 µ L를 플라스 미드 준비의 2 µ L를 추가: 1.8 kV, 25 µ F, 및 200 Ω.
14. 셀에 복구 ~ SOC 매체의 500 µ L 2 h. 접시 파운드 Spe100에 28 ° C에서 흔들어와 28 ° C에서 2 일 동안 성장.
15. 1.7 단계에서 언급 한 대로 식민지 심사를 수행 하 고 단계 1.3에서 PCR 조건을 사용 하 여. 긍정적인 복제품에서 글리세롤 주식을 확인 하 고-80 ° C에 저장
16. A. rhizogenes 문화 은닉 부정적인 컨트롤로 빈 pBGWFS7.0 벡터를 사용 합니다.

2. A. Rhizogenes 는 일반 콩의 털이 뿌리 변형

1. 콩 (P. vulgaris cv. 흑인 Jamapa) 씨앗 (약 20)을 살 균 하십시오 1 분 96% 에탄올의 50 ml에서 및 에탄올; 삭제 층 류 두건에 지속적인 혼합과 10 분 동안 20% 표 백제 (염소) 50 mL를 추가 합니다. 표 백제를 제거 하 고 3 번 초과 살 균 물에 씻어.
   참고: 다른 P. vulgaris cultivars 털이 루트 유도 사용할 수 있습니다.
2. 브 로튼 적신 멸 균 필터 종이에 소독된 씨앗을 발 아 & Dilworth (B & D) 솔루션²² (표 1) 28 ° c.에 어둠 속에서 2 일 동안
3. 변환 하기 전에 하루 준비 다음.
   1. A. rhizogenes 문화 (준비 단계 1.13 1.14) 이진 벡터 은닉의 150 µ L을 고체 파운드 Spe100에 streak 하룻밤 28 ° C에서 성장 하 고.
   2. B 15 mL 튜브를 채우기 & D 솔루션 및 바꾸기 두 배 층이 된 알루미늄 호 일 나사 모자. B의 10 mL를 포함 하는 22 cm 유리 튜브에 이것을 조립 & D 솔루션 (그림 2C) 및 고압 그것.
4. 변화의 날, 층 류 두건에 다음 메 마른 재료 조립: 2.2 단계에서 씨앗, 단계 2.3.1, 2.3.2 단계에서 튜브, 살 균 두 배 증류수 (10 mL), 펫 및 피 펫 팁, 살 균 겸 문화 접시를 출 아 했다 그리고 3 mL 주사기입니다.
5. 구부러진된 200 µ L 팁을 사용 하 여 microcentrifuge 튜브로 접시에서 A. rhizogenes 세포를 긁어와 이중 살 균 물의 1 mL에서 resuspend. 마찬가지로, 벡터 제어 셀 별도로 준비 합니다.
   1. Resuspend을 부드럽게 세포를 혼합. 와 동 하지 마십시오.
6. 단계의 2.3.2 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 튜브의 알루미늄 호 일에 3mm 구멍을 확인 합니다.
7. 주사기와 2.5 단계에서 세포 (발기인 또는 벡터 제어)를 수집 하 고 약간 찌르는 바늘 팁 (그림 2G) 세균된 씨의 hypocotyls.
   참고: 바늘 침투 (4-6 시간) 혈관 조직 다는 것을 확인 하 고 작은 주사 (~ 5 µ L)는 hypocotyl 주위에 다른 위치에서 상처에 셀의 삭제.
8. 신중 하 게 B를 포함 하는 15 mL 튜브의 3 m m 구멍에 삽입 된 묘 목의 뿌리를 삽입 & D 솔루션. 유리 튜브 22 mL에 전체 설치를 반환 하 고 습도 유지 하기 위해 그들을 봉인.
9. 16 h 빛: 8 28 ° C 유지 성장 챔버에 튜브를 품 어 h 어두운 photoperiod.
   참고: 3-4 일 후 부 화, 식물 성장 22 mL 유리 튜브의 가장자리에.

이 단계에서 모자를 제거 하 고 그림2에서와 같이 줄기 주위 parafilm으로 가장자리를 밀봉 합니다.

5-7 일, 부상 사이트에서 굳은 살을 관찰 하 고 찾아 ~ 2 cm 털 뿌리 변환 후 10-12 일.
참고: 그것은 B를 유지 하는 것이 중요 & 플라스틱 및 유리 튜브에 끊임없이 D 솔루션.

2 주 후, 털 뿌리 아래 2 cm 줄기를 절단 하 여 기본 루트를 제거 하 고 살 균 질 석 포함 하는 남 비로 기본 뿌리를 이식 합니다. 성장 챔버 (16 빛: 8 시 28 ° C에서 어두운)에 식물을 유지 하 고 B와 관개 & D 솔루션.

3. 발기인 분석: 닌 발기인 식 일반 콩의 Rhizobial 혹

1. 뿌리 혹의 유도, 접종 Rhizobium tropici 또는 Rhizobium etli (일반 콩에 호환 되)는 PY 매체 (0.5 g 펩, 0.3 g 효 모 추출 물) 700 mM CaCl₂ 와 20 mg mL^{− 1} 를 가진 보충의 100 ml nalidixic 산입니다. 300 rpm에서 떨고와 30 ° C 24 h에서 품 어.
   참고: 어떤 특정 항생제 유전자 변형 Rhizobium경우 사용 될 수 있습니다.
2. 실 온에서 2800 x g에서 3 분 동안 원심 분리기에 셀 작은 고 10mm MgSO₄10 mL에 resuspend. 10mm MgSO₄로 희석 하 여 세₆₀₀ 0.6 셀의 OD를 조정 합니다.
3. 문화 (3.2 단계에서 준비) 식물 (모두 발기인 및 벡터 제어) 털이 뿌리에 결 절 성장 유도 하 당 1-2 mL 접종 B 식물을 관개 & D 솔루션 nodulation 홍보 제한 질소 (2mm 알 것₃).
4. 실험 필요에 따라서 다른 시간 지점에서 털이 뿌리를 수집 합니다. 3-5 일 사이 감염 스레드 공부에 대 한 수집 샘플 게시물 접종 (dpi).
   참고: 원시 결 절 및 젊은 혹 수 수에서 공부 6-9 dpi와 10-12 일 dpi, 각각. 마지막으로, 성숙 하 고 기능적인 혹 14-21 dpi, 및 senesced 혹에서 공부 될 수 있다 > 28 dpi.
5. 거 스 (GFP) 리포터 유전자의 활동에 대 한 루트/작은 혹을 처리 합니다. 제퍼슨²³에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라 GUS 활동 분석. GFP 형광 현미경으로 관찰 합니다. GFP 형광 블루 아르곤 이온 레이저 자극 (488 nm), 510에서 540 내보낸된 형광을 수집 nm.

결과

이 연구의 목적은 결 절-특정 P. vulgaris 닌 spatiotemporal 식 패턴을 평가 했다. 이렇게 하려면 700 bp 지역 상류 닌 유전자의 번역 개시 코 돈에의 선정 되었다 고 그림 1A에서처럼 oligos의 집합 설계 되었습니다. 높은 중 합 효소를 사용 하 여, 닌 발기인 조각 증폭 되었다, (그림 1B), 절연 그리고에 transcriptional 퓨전을 생성 하는 게이트웨이 접근 방식을 통해 대상 바이너리 벡터 pBGWFS7.0 (그림 1C)에 복제 합니다 공상 취재 원 거 스 강화 된 GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP) PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP 벡터 구조는 일반적으로 독립적인 복제품의 수백을 생성합니다. 유전자 관련 ...

토론

유전자의 기능 분석, 동안 유전자 식 패턴의 연구 vivo에서유전자의 공간과 일시적인 규칙 이해에 중요 한 역할을 하고있다. 진 식 패턴을 공부 하는 잘 알려진 방법 관심, 유전자 프로모터 영역을 복제 하는 것입니다 형광 표식 유전자 (GFP, RFP, 등) 등 β-glucuronidase 리포터 유전자를 업스트림. 여기, 우리는 루트 결 절 공생 (RNS) 특정 유전자의, RNS 동안 P. vulgaris spatio 시간적 식 패턴을 공부 하 닌 발기인 영역을 선택 했습니다. 선택한 발기인 순서 GFP::GUS 기자 발기인 식 벡터에 게이트웨이 메서드를 사용 하 여 업스트림 복제 되어 있다.

우리 털이 루트 시스템의 공생 특정 promotor의 식을 묘사 했다 P. vulgaris. 털이 루트 시스템은 유전자의 기능적 특성에 대 한 널리 이용 되는, 포함 한 RNAi 중재 아래, 소성 제정 유전자의, 발기인 식 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT, CCC CAA AAT GGT, AAT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT, AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
시약
pENTR/D-TOPO 클로닝 키트	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II 효소 믹스	인비트로젠	11791100
pBGWFS7.0	식물 시스템 생물학	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink 퀵 젤 추출 키트	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen
인증 분자 생물학 Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 화학적 유능 대장	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
트립톤	Sigma-Aldrich	T7293-250G
효모 추출물	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
세균 한천	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
카나마이신 설페이	트 Sigma-Aldrich	60615-25G
스펙티노마이신 설페이	트 Sigma-Aldrich	PHR1441
에틸 알코올	Sigma-Aldrich	E7023
세균 펩톤	Sigma-Aldrich	P0556
염화	칼슘시그마 알드리치	C1016
날리 딕 산	시그마 알드리치	N8878
황산 마그네슘	시그마 알드리치	M7506
겔 로딩 용액	시그마 알드리치	G7654
< 강한> 이름 < / 강한>	< 강한> 회사 < / 강한><	강한>카탈로그 번호	코멘트
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma Sigma	1-14K
Gel 문서화 장치	Carestream	Gel Logic 212 PRO
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식물 생장	챔버 MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
형광 현미경	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
메스 블레이드	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브	Fisher scientific	14-959-53A
22mL 유리관	Thomas Scientific	45048-16150