식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성

요약

발기인 식 분석은 유전자 규정의 이해 및 대상 유전자의 spatiotemporal 식 개선에 중요 한. 여기 우리는 식별, 격리, 식물 발기인을 복제 하는 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성을 설명합니다.

초록

업스트림 시퀀스 시퀀스를 코딩 하는 유전자의 발기인 시퀀스도 불린다. 발기인의 식 패턴을 공부 하는 것은 유전자 규정과 spatiotemporal 식 패턴 대상 유전자의 이해에 매우 중요 한입니다. 다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 이 연구에서 우리는 유전자 변형 털 뿌리에 Phaseolus vulgaris 의 rhizobial 공생 특정 결 절 개시 (NIN) 발기인의 spatiotemporal 식 패턴 조사. 식물 게놈 데이터베이스와 식별, 분석 도구를 사용 하 여 격리, 그리고 복제 공상 기자 transcriptional 퓨전에 P. vulgaris 닌 발기인 β-glucuronidase (거 스) 거 스 enhanced::GFP. 또한,이 프로토콜 P. vulgaris Agrobacterium rhizogenes 유도 털 뿌리를 사용 하 여 유전자 변환의 신속 하 고 다양 한 시스템을 설명 합니다. 이 시스템은 변환 후 10 ~ 12 일에 ≥2 cm 털 뿌리를 생성합니다. 다음으로, 우리 Rhizobium 접종 후 접종의 정기적으로 털 뿌리에 닌 발기인의 spatiotemporal 식 평가. GUS 활동에 의해 묘사 된 우리의 결과 표시 닌 발기인 nodulation의 과정에서 활동적 이었다. 함께, 현재 프로토콜 식별, 격리, 복제, 그리고 일반적인 콩 털이 뿌리에서 식물 발기인을 특성화 하는 방법을 보여 줍니다. 또한,이 프로토콜은 비 전문 실험실에서 사용 하기 쉬운입니다.

서론

발기인은 관심사의 유전자의 표현 규제 이해에 중요 한 역할을 하는 중요 한 분자 생물학적 도구. 프로모터는 상류에 있는 DNA 순서는 번역의 개시 코 돈 유전자의 순서 그리고 그들이 유전자;의 중앙 규제 정보 따라서, 그들의 올바른 주석 및 특성화는 유전자 기능을 이해 하는 중요 한. 식 패턴에 따라 공장 발기인 구성, 조직, 또는 개발 단계 관련 및 유도할 수 있는¹으로 분류 됩니다. Transcriptomic 기술, 컴퓨터 모델링, 개선 및 다양 한 식물 종에 대 한 게놈 시퀀스의 수를 증가의 가용성 발기인 시퀀스²의 대규모 예측을 촉진 했습니다.

다른 한편으로, 그것은 또한 발기인 평가 도구와, 효율적으로, 신속 하 고 재현할 수 있는 유전자 변환 기술을 확립에 중요 한. 다른 모델 식물 달리 일반적인 콩 콩과 식물 (P. vulgaris) 유전자의 기능 특성의 안정적인 유전자 변환에 대 한 sp. Phaseolus 완강히 특성상 주로 장애가. 일시적인 변환 시스템 빠른 유전자 기능 분석 연구³에 대 한 대체 역할을 합니다. 콩과 공생 연구, 콩과 식물 호스트 공장 및 rhizo....

프로토콜

1. 식별, 격리 및 피 Vulgaris 닌 발기인의 복제

1. 관심사의 유전자의 발기인 순서를 식별 합니다. 일부의 게놈 데이터베이스와 분석 도구 Phytozome, 합 식물, NCBI, 등 A 콩과 발기인 P. vulgaris 닌 (PvNIN; 식물에 사용할 수 있는 Phvul.009G115800)는이 연구²⁰에 사용 되었다.
2. 디자인 oligos 게이트웨이 또는 벡터 시스템에 따라 복제 하는 전통적인 제한 효소 사용 (그림 1A).
   참고: 표준 (25-35 bp), desalted 뇌관 작업 괜 찮 아 요. 발기인과 유전자 사이의 측면 역 올리고 시퀀스는 좋습니다.
3. 갓 격리 P. vulgaris 에서 PvNIN 발기인 지역 (또는 관심사의 유전자의 발기인 지구)를 증폭 발기인 특정 올리고 세트를 사용 하 여 게놈 DNA. 높은 중 합 효소를 사용 하 여 다음 PCR 조건: 95 ° C 5 분; 30 사이클 (95 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30 초, 1 분에 72 ° C); 그리고 5 분 동안 72 ° C입니다.
4. 7 x 10 cm 젤 트레이에 ....

결과

이 연구의 목적은 결 절-특정 P. vulgaris 닌 spatiotemporal 식 패턴을 평가 했다. 이렇게 하려면 700 bp 지역 상류 닌 유전자의 번역 개시 코 돈에의 선정 되었다 고 그림 1A에서처럼 oligos의 집합 설계 되었습니다. 높은 중 합 효소를 사용 하 여, 닌 발기인 조각 증폭 되었다, (그림 1B), 절연 그리고에 transcriptional 퓨전을 생성 하는 게이트웨이 접근 방식을 통해 대상 바이너리 벡터 pBGWFS7.0 (그림 1C)에 복제 합니다 공상 취재 원 거 스 강화 된 GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP) PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP 벡터 구조는 일반적으로 독립적인 복제품의 수백을 생성합니다. 유전자 관련 .......

토론

유전자의 기능 분석, 동안 유전자 식 패턴의 연구 vivo에서유전자의 공간과 일시적인 규칙 이해에 중요 한 역할을 하고있다. 진 식 패턴을 공부 하는 잘 알려진 방법 관심, 유전자 프로모터 영역을 복제 하는 것입니다 형광 표식 유전자 (GFP, RFP, 등) 등 β-glucuronidase 리포터 유전자를 업스트림. 여기, 우리는 루트 결 절 공생 (RNS) 특정 유전자의, RNS 동안 P. vulgaris spatio 시간적 식 패턴을 공부 하 닌 발기인 영역을 선택 했습니다. 선택한 발기인 순서 GFP::GUS 기자 발기인 식 벡터에 게이트웨이 메서드를 사용 하 여 업스트림 복제 되어 있다.

우리 털이 루트 시스템의 공생 특정 promotor의 식을 묘사 했다 P. vulgaris. 털이 루트 시스템은 유전자의 기능적 특성에 대 한 널리 이용 되는, 포함 한 RNAi 중재 아래, 소성 제정 유전자의, 발기인 식 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT, CCC CAA AAT GGT, AAT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT, AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
시약
pENTR/D-TOPO 클로닝 키트	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II 효소 믹스	인비트로젠	11791100
pBGWFS7.0	식물 시스템 생물학	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink 퀵 젤 추출 키트	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen
인증 분자 생물학 Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 화학적 유능 대장	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
트립톤	Sigma-Aldrich	T7293-250G
효모 추출물	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
세균 한천	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
카나마이신 설페이	트 Sigma-Aldrich	60615-25G
스펙티노마이신 설페이	트 Sigma-Aldrich	PHR1441
에틸 알코올	Sigma-Aldrich	E7023
세균 펩톤	Sigma-Aldrich	P0556
염화	칼슘시그마 알드리치	C1016
날리 딕 산	시그마 알드리치	N8878
황산 마그네슘	시그마 알드리치	M7506
겔 로딩 용액	시그마 알드리치	G7654
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22mL 유리관	Thomas Scientific	45048-16150

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