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방법 논문

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

2018년 4월 9일

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

이 논문에서

요약

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

초록

Enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC) O157:H7는 foodborne 병원 체는 causesdiarrhea, 출혈 성 대 장 염 (HS), 그리고 hemolytic 신부전 증후군 (HUS), 인간의 창 자 장관에 식민지. EHEC 식민 vivo에서 의 상세한 메커니즘 연구를 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민 동물 모델에 필수적 이다. 여기 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민지 생활 호스트에서 EHEC에 발광 표현 플라스 미드를 변형 하 여 마우스 EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 동물 생물 발광 표시 EHEC로 주사는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템으로 탐지 하 여 쥐에서 강렬한 발광 신호를 보여줍니다. 후 1, 2 일 게시 감염, 발광 신호 수 여전히 감지할 수 감염 된 동물에서 EHEC 호스트에 적어도 2 일 동안 식민지 건의 하. 우리는 또한 이러한 발광 EHEC ex vivo 이미지에서 맹에 콜론, 특히 마우스 소장을 찾아 보여줍니다. 이 마우스 EHEC 식민 모델 EHEC 식민 메커니즘의 현재 정보를 도구 될 수 있습니다.

서론

EHEC O157:H7 설사1, HS2에서3, 오염 된 물 이나 음식을 통해도 급성 신부전4 원인 병원 체 이다. EHEC 병원 성 enterobacterium 이며 인간1의 위장을 colonizes. EHEC 먼저 호스트 창 자 상피 준수 때 그들은 유형 III 분 비 시스템 (T3SS) 분자 주사기는 연결을 유도 하 고 적용을 이후에 병 변 (A/E) effacing 역할을 통해 호스트 세포에 주입 식민 요인 접착 (식민)5. 이 유전자는 A/E 병 변 형성에 관여 enterocyte 항목 (리) pathogenicity 섬5의 소재 시로 인코딩됩니다.

생물 발광은 빛 생산 화학 반응, 어떤 luciferase catalyzes 보이는 빛6를 생성 하는 기판 소. 이 효소 과정은 종종 산소 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)6의 존재를 필요로 한다. 생물 발광 영상 (BLI) 연구원 시각화 및 호스트 병원 체 상호 작용의 양자화에에서 있습니다 라이브 동물7. 씨 수 있습니다 그들은 이주와 다른 조직7; 침략 발광 박테리아에 따라 살아있는 동물에서 세균 감염 사이클 특성을 이 감염의 동적 진행을 보여준다. 또한, 동물에서 세균 부하는 관련이 발광 신호8; 따라서, 그것은 간단 하 고 직접적인 방법으로 실험 동물의 병 적인 상태를 추정 하는 편리한 표시기입니다.

여기에 사용 되는 플라스 미드 포함 luciferase 오 페론, luxCDABE, 박테리아 자체 luciferase 기판7,9인코딩하는 Photorhabdus luminescens 에서. 이 luciferase 표현 플라스 미드 박테리아로 변형 하 여 살아있는 동물에서 이러한 발광 박테리아를 관찰 하 여 식민과 감염 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 전반적으로, 씨 및 생물 발광 표시 된 박테리아 세균 숫자 및 위치, 항생제/치료 치료와 감염/식민지6, 에 세균성 유전자 발현 세균 생존 능력을 감시 하는 연구자 수 7. 수많은 병원 성 박테리아는 감염에서 감염 주기 및/또는 유전자 표현 검토 하 luxCDABE 오 페론 표현 보고 되었습니다. Uropathogenic 대장균10, EHEC8,11,,1213, enteropathogenic를 포함 하 여 이러한 박테리아 대장균 (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, 살 모 넬 라 typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, 비 브리 오 cholerae20, 문서화 되었습니다.

몇 가지 실험 모델 EHEC 식민 생체 외에서 그리고 vivo에서21,,2223의 연구를 촉진 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 공부 하기는 EHEC 식민 vivo에서, 적당 한 동물 모델의 부족 및 따라서 내용의 결과 소수 있다. EHEC 식민 메커니즘에는 vivo에서의 연구를 촉진 하기 위하여 관찰 하 고 계량 비-침략 적 방법에서 살아있는 동물에서 EHEC 식민 동물 모델을 구축 하는 귀중 한입니다.

이 원고는 EHEC 식민 생활 호스트에 시간이 지남에 따라 모니터 발광 표현 시스템을 사용 하는 마우스-EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 마우스는 intragastrically 생물 발광 표시 EHEC로 접종 하 고 발광 신호는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템13와 쥐에서 발견 되. 마우스 감염 생물 발광 표시 EHEC 2 일 게시 감염 후 2 일 게시 감염 호스트 창에 그 박테리아 식민지는 제안 후 그들의 내장에서 중요 한 발광 신호를 보여주었다. 이미지 데이터 비보 전 이 식민은 맹 쥐의 콜론에서 구체적으로 보여주었다. 이 마우스 EHEC 모델을 사용 하 여 발광 EHEC 식민 검출 될 수 있다 살아있는 호스트에는 vivo에서 이미징 시스템에서 더 이해를 증진 수 있습니다 장의 박테리아 식민지의 상세한 메커니즘을 연구 하 여 EHEC 유도 생리와 병리학 변화입니다.

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프로토콜

주의: EHEC O157:H7는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 질병 통제 및 예방 (CDC) biosafety 지시 (https://www.cdc.gov/)를 위한 센터에 따르면. 따라서, 모든 실험 절차 관련 된 EHEC BSL-2 시설에서 수행 되어야 합니다. 실험을 수행 하는 동안 실험실 코트와 장갑 착용. 인증된 biosafety 내각 (BSC)에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 실험 절차 전후 실험 벤치를 소독. 모든 악기 또는 장비 연락처 (또는 잠재적으로 연락처) EHEC 70% 에탄올 이나 표 백제로 소독 되어야 한다. 신중 하 게 오염 된 (또는 잠재적으로 오염 된) 폐기물은 밀봉 하 고 압력가 이어야 한다. 필요한 경우 마스크, 눈 보호, 이중 장갑 또는 죄수 복을 착용. 6 주 된 C57BL/6 여성 마우스 구입 하 고 실험실 동물 센터의 국립 쳉 쿵 대학 (NCKU)에서 유지 했다. 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 NCKU (승인 번호 104-039)에 의해 승인 되었다.

1. Bioluciferase 표시 된 EHEC 박테리아 생성

  1. 믹스 50 ng deoxyribonucleic 산 (DNA), 1 μ 각 10 μ M의 앞으로 반전 뇌관, 2 μ 2.5 m m deoxynucleotides (dNTPs), 2 μ 버퍼, 0.2 μ DNA 중 합 효소, 및 살 균 이중 증 류 물 (ddH2O) 증폭 20 μ의 최종 볼륨을 x 10에 반대로 대 카세트, nptII 유전자24 DNA 템플렛 pBSL18024, 국가 유관 프로젝트 (NBRP)에서 구입 하는 것입니다. PCR 조건 표 1 에 나열 되 고 뇌관 순서는 표 2에서 사용할 수 있습니다.
  2. PCR 제품 상업적 복제 벡터 키트 다음을 위하여 프로토콜 ( 재료의 표참조).
  3. NsiI 와 SmaI 에 의해 클로닝 벡터에서 nptII 유전자 단편을 삭제할 및 pAKlux29 대 내성 플라스 미드를 만드는 NsiI ScaI 에 의해 소화 되어, pBBR1MCS4로 복제 pWF27813.
  4. LuxCDABE 오 페론 luciferase 플라스 미드9, pAKlux2, SpeI-HF 와 ScaI 및 복제에 의해 표현에서 삭제할 SpeI HF 와 SmaI 소화 대를 생성 하는 pWF278 저항 및 luciferase 플라스 미드, pWF27913를 표현.
    참고: 플라스 미드 추출 및 삭제 조각 purifications, 상업 플라스 미드 추출 및 젤 추출 키트를 각각 사용 합니다. 효소 소화에 대 한 100 ng DNA, 1 μ 10 x 버퍼, 각 선택 된 제한 효소, 그리고 살 균 ddH2O 10 μ의 총 볼륨의 1 μ를 혼합 하 고 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어.
  5. 2500 V 4 ms와 electroporation에 의해 대장균 O157:H7 EDL933 유능한 세포에 pWF279 플라스 미드를 변환.
  6. 1 시간 동안 37 ° C에서 1 mL Luria Bertani (파운드) 매체에 변형 된 박테리아 세포를 품 어.
  7. 16-18 h 37 ° C에서 대의 50 µ g/mL으로 보충 한 파운드 천 배지에 박테리아 접시
  8. vivo에서 이미징 기계 다음 날 여 접시의 발광 신호를 확인 하십시오. 접시에서 단일 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 16-18 h 37 ° C에서 50 µ g/mL 대 보충에 문화.
  9. Diluting 하 여 세균성 주식 매체를 준비 살 균 ddH2O 30% 글리세롤 솔루션 100% 글리세롤.
  10. 대 방지 고정 나사 모자 cryovial에 세균성 주식으로-80 ° c.에서 박테리아 문화 및 30% 글리세롤 용액의 1:1 비율로 luciferase 플라스 미드를 은닉 하는 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아 글리세롤의 최종 농도 15%입니다.

2. 발광 EHEC 박테리아 준비 구두 접종에 대 한

참고: EHEC 준비 및 마우스 구강에 대 한 실험 절차의 타임 라인 순서도 그림 1 실험 준비에 도움을 제공.

  1. 은닉 luciferase 플라스 미드-80 ° C 주식에서 50 µ g/mL 대와 파운드 한 천 배지 위에 행진 대장균 O157:H7 EDL933 박테리아. 16-18 h 37 ° c.에 대 한 박테리아를 성장
  2. 16-18 h 220 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 50 µ g/mL 대와 3 mL 파운드 매체에 문화와 하룻밤 플레이트에서 단일 식민지를 선택 하십시오.
  3. Subculture 박테리아 (1: 100 희석) 대 (50 µ g/mL)으로 200 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 2.5-3 h에 대 한 파운드 국물 포함. (예를 들어, 추가 2 mL 하룻밤 배양 보충 대 (50 µ g/mL)와 200 mL 파운드 매체에 박테리아).
  4. 2.5-3 h에 대 한 박테리아를 품 어 및 600에서 광학 밀도 값 측정 값까지 nm (OD600) 0.9 ~ 1 사이입니다. 세균성 세포 수는 약 108 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 밀도 / mL.
  5. 8000 x g 30 분, 4 ° c.에서 다시 교양된 박테리아 원심
  6. 박테리아의 펠 릿을 교 반 하지 않고는 상쾌한을 삭제 하 고 부드러운 동요에 의해 100 mL 0.9% 메 마른 정상적인 염 분으로 펠 릿을 세척.
  7. 한 번 2.5-2.6 단계를 반복 합니다.
  8. 세척 후 원심 8000 x g 30 분, 4 ° C에서 세균성 문화 하 고는 상쾌한 부드럽게 삭제.
  9. 응축은 펠 릿에 100 0.9% 살 균 일반 식 염 수와 함께. 예를 들어, 200 mL 박테리아 centrifuged는 펠 릿을 중단 2 mL 정상적인 염 분을 추가 합니다.
  10. 10 직렬 희석25통해 집중된 박테리아를 도금 하 여 박테리아 CFU (그것은 약 109 CFU/100 μ 응축 후에 있어야 정상적인 염 분)을 확인 합니다.

3. 마우스 EHEC의 구강

  1. 24 h에 대 한 스 물 (5 g/L)와 6 주 된 여성 C57BL/6 쥐를 취급 합니다.
  2. 24 시간 후 gavage 전에 또 다른 24 h에 대 한 일반 식 수로 전환. 24 h에 대 한 일반 물으로 치료 후 쥐 EHEC의 구강에 대 한 준비가.입니다.
  3. 플런저에 다시 당겨 100 μ EHEC 박테리아로 주사기를 채우십시오. 아무 공기 방울이 주사기에는 확인 하십시오. 손가락으로 주사기를 스냅 하 여 거품을 제거 합니다.
  4. 동물을 부드럽게 들어올리고 주의 케이지 위에 그것을 배치 합니다.
  5. 꼬리, 신중 하 게 마우스 잡고 고 동물 케이지의 상단을 그립 하 고 멀리 이동 하려고.
  6. 부드럽게 마우스의 머리를 이동 하지 않도록 엄지와 함께 동물의 앞면과 뒷면 목의 느슨한 피부를 파악 하 여 마우스를 제 지 하십시오.
  7. Gavage 바늘을 삽입 하 고 마우스의 머리는 고정 하 고 수직을 확인 하는 수직 위치에 마우스를 잡아.
  8. 입의 지붕에 따라 마우스 입에 gavage 바늘을 삽입 하 고 식도 및 위를 향해 아래로 이동.
  9. 삽입 된 바늘 절반 또는 2/3 길이 마우스에 때 주사 약 109 CFU 셀을 포함 하는 100 μ EHEC 박테리아.

4입니다. 시각화

  1. 구강, 후 1, 2 일에 발광 신호를 감지 합니다.
  2. 동물의 발광 신호를 검사 하기 전에 2.5% isoflurane 1.5 L/min 산소의 약 실에 그들을 둬서 그들을 anesthetize.
  3. 모든 마우스 의식 및 중지 이동 될 때까지 2-5 분을 기다립니다. 동물 생물 발광의 비보에 탐지에 대 한 준비가 되었습니다.
  4. 검색 및 이미지 동물의 발광 신호는 vivo에서 이미징 시스템. 소프트웨어 작업에 대 한 "데이터 수집" 섹션 5를 참조 하십시오. 이미징 프로세스 동안 모든 동물 2.5% isoflurane 1.5 L/min 산소의 지속적인된 공급을 받고 있다.
    1. 파일을 클릭 > 라이브, 그리고 수동으로 마우스에 집중.
    2. 노출 시간 및 레이저 강도 선택 합니다.
    3. 클릭 취득 > 캡처.
  5. 쥐 자 궁 경부 전위에 의해 안락사는 ex vivo 영상, 감염 된 쥐의 전체 내장 제거 및. Vivo에서 이미징 시스템 내장 9 cm 배양 접시와 이미지에 배치 합니다. 설정 되는 vivo에서 이미징 보기의 필드 A/b.로 설정 되어 제외 하 고 동일 자세한 내용은 "데이터 수집" 섹션 5를 참조 하십시오.
    참고: 자 궁 경부 전위에 대 한 방법: 동물 케이지 그립을 한 손으로 꼬리를 파악 하 여 케이지 위에 마우스를 억제. 두개골의 기지에서 마커 펜 또는 엄지 및 목의 뒤에 대 한 다른 한편의 첫 번째 손가락을 놓습니다. 빨리 머리를 억제 하는 동안 손 또는 개체와 함께 앞으로 밀어 하 고 꼬리를 잡고 손으로 뒤로 당겨.
    밀접 하 게 호흡 검거, 및 아무 심장 박동 확인 확인.

5. 데이터 수집

참고: 데이터 수집에 사용 되는 소프트웨어는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.

  1. 이미지 수집을 위한 소프트웨어 (그림 2)의 수집 컨트롤 패널을 엽니다.
  2. 선택 "발광" "사진,"와 "오버레이 합니다."
  3. "자동"으로 노출 시간 설정 "매체"로 Binning 설정
  4. Ƒ/중지 1로 발광 하 고 8에 대 한 설정 사진. Ƒ/중지 컨트롤 CCD 검출기는 빛의 양을 받았다.
  5. 보기의 이미지를 얻으려고 관심 분야에 따라 필드를 설정 합니다. 옵션 "D"는 5 6 주 된 쥐를 적합 하 고 한 번에 모든 이미지 수 있습니다. "C"는 한 필드에서 3 6 주 된 쥐 이미지 수 있습니다.
  6. 마우스/샘플 영상에 대 한 준비가 되 면, 일단 이미지 수집을 위한 "취득"을 클릭 합니다.
  7. 이미지 데이터 획득을 엽니다.
  8. 도구 팔레트 패널 (그림 3)을 엽니다.
  9. ROI 도구를 선택 합니다. 이미지 (그림 4) 발광 영역 범위 원을 (가장 왼쪽 중 하나)이 좋습니다.
  10. "측정 ROIs" (연필 아이콘) 측정 표면 발광 강도 (그림 3)를 클릭 합니다. 패널의 ROI 측정 및 정량화 값 표시 (그림 5).
  11. 사용 하 여 구성 측정 ROI 측정 패널의 왼쪽에 선택 값/필요한 정보 (그림 6), 그렇지 않으면 "수출"이 데이터 테이블 내보내고.csv 파일 (그림 5)으로 저장을 클릭 합니다.
  12. .Csv 파일에서 발광 강도 정량화로 열 "총 속 (p/s)"의 값을 사용 합니다.

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결과

우리는 생물 발광 표시 EHEC 관리 (~ 109 세균성 세포) 구강에 의해 6 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스. 1 시간 이내 쥐 EHEC의 구두 접종 후 동물 vivo에서 이미징 시스템 그림 7과 같이 발광 신호 위해 시험 되었다. 결과 생물 발광 표시 EHEC와 gavage 쥐에서 강한 발광 신호를 보여주었다. 우리는 2 일 게시물 감염에 신호를 검사합니다. 그림 8A같이 쥐 2 일 EHEC는 2 일에 의해 호스트에 식민지 제안 감염 게시 후에 강렬한 발광 신호를 보여 야생-타입 EHEC EDL933 생물 발광 표시와 주사. 우리는 또한 intragastrically 생물 발광 표시 된 EDL933ΔrfaD (ΔrfaD) 쥐 (그림 8A) 감염. 이...

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토론

그것은 알려졌다 EHEC luciferase 플라스 미드와 변환 호스트 또는 유전자 식 vivo에서8,,1112에 그것의 지역화를 검사 활용 되었습니다. 여기 시연 murine 모델 또한 murine 호스트8에서 EHEC 식민지 시기와 지역화를 검색 하기 위해 보고 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 intragastrically 마우스 EHEC 접종을 관리 하는 방법과 구강에 대 한 발광 박테리아를 신중 하 게 준비 하는 방법의 세부 프로토콜을 제공 합니다. 특히,는 마우스 구강 EHEC (단계 3.7)의에 대 한 마우스 헤드의 위치 때 중요 gavage 바늘 삽입 됩니다. 위치 수직 하지 않으면 그것은 바늘을 통과 하기 어려울 것입니다 그리고 그것은 아마도 마우스를 다칠 수 있습니다. 3.8 단계에...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 인정 하는 치 정 첸에서 학과의 의료 연구, 치 매 의료 센터 (타이난, 대만), 감염 및 국립 쳉 쿵 대학 실험실 동물 센터에서 지원에 마우스에 도움. 이 작품은 과학의 성직자에 의해 지원 하 고 기술 (대부분) CC를 (가장 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005)를 부여 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
셰이커 인큐베이터YIH DERLM-570R박테리아 인큐베이션 
안와 진탕 인큐베이터FIRSTEKS300박테리아 인큐베이션 
pBSL180nptII 유전자
pAKlux2luxCDABE 오페론
T& 복제 키트Yeastern BiotechFYC001-20PTA 복제에 사용 
Nsi INEBR0127S플라스미드 클로닝에 사용 
Sca INEBR0122S플라스미드 클로닝에 사용 
Spe I-HFNEBR0133S플라스미드 클로닝에 사용 
Sma 나는 플라스미드 클로닝에 NEBR0141S
플라스미드 클로닝에 T4리가제NEBM0202S
ExTaq TaKaRaRR001APCR 증폭 사용
10X Ex Taq 버퍼TaKaRaRR001APCR 증폭
dNTP 혼합물 사용 TaKaRaRR001A는 PCR 증폭
PCR 기계에사용됩니다. Biosystem을 적용했습니다.2720 써멀 사이클러   PCR 증폭용
글리세롤SIGMAG5516-1L박테리아 스타킹 용액
NaClSigma31434-5KG-RLB 매체 제조용 화학품, 10g/L
트립톤CONDA pronadisaCat 1612.00LB 배지 제조용 화학품, 10g/L
효모 추출물 분말Affymetrix23547-1 KGLB 배지 제조용 화학품, 5g/L
AgarCONDA pronadisaCat 1802.00LB 한천 카나마이신을 만들기 위한 화학물질
 SigmaK4000-5G항생제, 셀렉시톤
스트렙토마이신에 사용 SigmaS6501-100G항생제, 쥐의 미생물군 제거
EDL933 유능한 세포집에서 만든방법은 보충 문서에 있습니다 
ElectroporatorMicroPulserfor electroporation
Electroporation CuvettesGene Pulser/MicroPulser1652086for electroporation
고속 원심분리기Beckman CoulterAvanti, J-26S XPuse for centrifuging bacteria 
고정 각도 로터Beckman CoulterJA25.5박테리아를 원심분리하는 데 사용됩니다 
고정 각도 로터Beckman CoulterJLA10.5박테리아를 원심분리하는 데 사용됩니다 
원심분리기 병Beckman CoulterREF357003박테리아 원심분리에 사용 
원심분리기 병Thermo Fisher scientific3141-0500세균 원심분리에 사용 
Eppendorf BioPhotometer Plus EppendorfAG 22331 함부르크의 OD600 값을 측정하기 위한
 NCKU
실험실 코트의 실험실 동물 센터,개인 보호용 장갑
이소플루란 파니온 & BF 생명 공학 Inc.G-8669마우스 마취용, 제약 등급
1ml 주사기 마우스의 구강 간을 위한 사용
재사용 가능한 22 G 볼 팁 먹이 바늘& 파이; 0.9 mm X L 50 mm마우스 구강 위장에 사용
  가위 생쥐 실험에 사용
Xenogen IVIS 200 이미징 시스템Perkin ElmerIVIS 스펙트럼생물 발광 이미지 캡처에 사용 
데이터를 정량화하는 데Living Image SoftwarePerkin Elmer버전 4.1
사용  사용 는 는 는 박테리아 C57BL/6 마우스 것입니다 이미지 사용되는

참고문헌

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