면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

요약

생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

초록

면역 형광 검사 subcellular 구획을 시각화 하 고 조직 샘플 내 특정 단백질의 지 방화를 결정 하는 데 사용 하는 일반적인 방법입니다. 면역 형광 이미지를 높은 품질의 인수에 큰 방해 lipofuscin 같은 노화 안료 또는 알데하이드 고정 등 일반적인 샘플 준비 과정에 의해 발생 하는 조직의 내 생 autofluorescence입니다. 이 프로토콜 배경 형광을 흰색 형광체 발광 다이오드 (LED) 배열 처리 이전 형광 프로브를 사용 하 여 photobleaching를 통해 크게 줄어들 수 있습니다 방법에 대해 설명 합니다. 흰색 형광체의 넓 스펙트럼 방출 Led 방출 봉우리의 범위에 걸쳐 fluorophores의 표백에 대 한 수 있습니다. Photobleaching 장치 매우 낮은 비용에 상용 구성 요소에서 생성 될 수 있습니다 고 상용 화학 quenchers에 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 뒤에 기존의 면역 형광 염색 직물의 photobleaching 전처리 배경 autofluorescence의 이미지를 생성 합니다. 비교 조사 배경 감소는 화학 quenchers 설립을 신호, photobleaching 처리 했다 프로브 형광 강도에 영향을 주지 않습니다 그것은 배경과 lipofuscin 형광을 효과적으로 감소 하는 동안. Photobleaching 전처리에 대 한 더 많은 시간을 필요로, 하지만 높은 휘도 LED 배열 photobleaching 시간을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 방법은 잠재적으로 다양 한 조직, 두뇌 등 lipofuscin 축적 특히 postmitotic 조직 및 심장 또는 골격 근육에 적용할 수 있습니다.

서론

형광 현미경 검사 법 특정 단백질을 표적으로 하는 항 체를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양과 조직에 관심사의 단백질을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 면역 형광 검사에서 명확 하 고 확실 한 이미지의 인수를 주요 합병증이 발생할 수 있습니다 endogenously 포유류 조직에서 나이 안료 lipofuscin과 단백질 엘라 스 틴과 콜라겐^{1, autofluorescence 2}. Autofluorescence의 다른 소스는 알데하이드 고정³샘플 준비 단계를 통해 소개 될 수 있습니다. Lipofuscin과 립, oxidatively 수정 단백질과 지질 저하 잔류물의 주로 구성 된 긴 살아있는 세포 증가 나이²에 누적 됩니다. 그러면 뇌와 심장이 나 골격 근육, postmitotic 조직 이미징에 어려움 lipofuscin의 형광 방출 스펙트럼은 광범위 하 고 가변, 자주 사용 하는 일반적인 fluorophores의 방출 파장와 동시 ⁴라벨. 이러한 요인 특히 도전 frontotemporal lobar 변성 (FTLD) 늦은 발병 신경 퇴행 성 질병의 경우에서 인간 뇌 조직의 이미지를 확인 합니다.

Autofluorescence를 줄이기 위해, 우리는 우리와 백색 발광 다이오드 (LED) 배열 가구 책상 램프⁵를 사용 하 여 슬라이드 마운트 조직 단면도 비추는 기법을 고안 했다. 이 간단한 기술은 대안을 암모늄 아세테이트, 또는 냉각 하는 염료 수단 블랙 B 및 Eriochrome 블랙 T⁶같은 상용 CuSO₄ 등 화학 quenchers를 사용 하는 기법을 제공 합니다. 그것은 또한 상당한 비용 절약 이상의 multispectral 있다 램프 photobleaching 기술을 주도하 고 합병증과 스펙트럼 취소 혼합^7,8같은 디지털 autofluorescence 제거 방법에서 생성 하는 유물을 피 한다. 백색 발광 Led 있다 넓은 방출 스펙트럼, 높은 광도 및 낮은 제조 비용, photobleaching chromophores^5,9다양 한에 대 한 상용 부품으로 이상적.

이 프로토콜에 액세스할 수 있는 구성 요소를 사용 하 여 photobleaching 기구 건설을 설명 하 고 FTLD 조직의 phosphorylated 타우에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 타우-긍정적인 포함 (FTLD-T)를 포함 하는 경우에 photobleaching를 적용. 우리 붙일 표시 된 항 체 두 통용 chromophores 채용 이미징에 photobleaching의 효과 보여줍니다: 알 렉 사 488와 텍사스 레드. 치료 섹션 대 photobleaching의 효과 또는 상업적인 화학 끄는 치료는 계량 하 고 비교. 이 photobleaching 전처리 생물학 견본에서 autofluorescence를 제거 하려면 모든 표준 면역 형광 얼룩 프로토콜에 포함 될 수 있습니다.

프로토콜

참고: 국제 회의에 조화 (ICH), 위원회에 대 한 국제 단체의 의료 과학 (CIOMS)를 포함 하 여 인식된 국제 표준에 따라 제시 하는 작업 수행 그리고 헬싱키 선언 원칙. 인간의 조직의 사용 대학 건강 네트워크 연구 윤리 위원회의 승인을 했다. 인간의 두뇌 샘플 해상 뇌 조직 은행의 일환으로 수집 되었습니다. 수집 시 동의 모든 환자에서 얻은 했다.

1. photobleaching 장치 및 솔루션의 건설

1. 준비 재고 솔루션.
   1. 8.77 g NaCl의 그리고 트리 스의 6.06 g을 용 해 하 여 재고 Tris 버퍼 식 염 수 (1 x TBS) 솔루션 (150 m m NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) x 1의 준비 1 L ddH ₂ O의 800 mL에서 기지 고 HCl. 1 L와 오토 클레이 브에 볼륨을 가져오기를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. < / 리 >
   2. 1 g의 나트륨 아 지 드 (10%, 200 x 재고) ddH ₂ O 10 mL에 용 해 하 여 10% (200 x 주식) 나트륨 아 지 드를 준비.
2. 1-3 표준 크기 슬라이드, 슬라이드 챔버로 단일 100 mm x 100 mm 투명 하 고, 광장 페 트리 접시를 사용. 단일 슬라이드 챔버에 대 한 0.05% 아 지 드-TBS 솔루션 1 x TBS의 50 mL를 200 x 나트륨 아 지 드 재고의 0.25 mL를 추가 합니다. 2-3 슬라이드 챔버 추가 슬라이드를 처리 하는 데 세로로 스택. 아 지 드 TBS 솔루션의 추가 50 mL 각 챔버에 대 한 준비.
3. 그런 램프 머리 아래 들어갈 수 있는 슬라이드 chamber(s) 상승 발판을 만듭니다.
   1. 는 100 x 100 mm 슬라이드 챔버, 하단에는 100 x 100 mm x 30 mm 플라스틱 음식 컨테이너의 측면 구멍 고 컨테이너 반전. 측면 구멍 하는 LED 광원에 맞게 하단 오프닝 충분히 큰 광원에서 빛 장애 없이 샘플 챔버에 도달 되도록 충분히 큰 확인 하십시오.
   2. 비 계 발판 및 샘플 챔버/벤치탑 사이 그립을 증가 전기 테이프를 적용 됩니다. 어떤 대체 물질을 사용 하 여 너무 오랫동안 안전 하 게 샘플을 도달에서 빛을 방해 하지 않고 슬라이드 챔버를 끌어올리고 발판을 생성.
4. 직접 도달 하는 샘플 (가능한 경우)에서 LED 빛을 방해 수 있는 LED 어레이 위쪽으로 방향을 책상 램프 디퓨저 또는 불투명 플라스틱을 제거. 비 계 및 슬라이드 chamber(s) LED 어레이 위에 놓습니다. 유연한 목 램프를 사용 하 여 쉬운 조작을 위한.
5. 구문 반사 돔 줄 상자 슬라이드 챔버와 비 계 알루미늄 호 일 수의 내부 장치에 대 한 커버. 사용 하 여 1 mL 피 펫 팁 상자 단일 챔버에는 150 x 150 mm x 150 mm 골 판지 상자, 다중에 대 한 수직으로 쌓아 챔버.

2. Photobleaching 조직 단면도의 전처리

참고: 조직 섹션 준비 조직 및 고정 방법을 사용을 포함의 소스에 따라 다를 수 있습니다. 여기, FTLD T의 경우에서 뇌 조직 (orbitofrontal gyri) ~ 2 일 말린, 자당 그라디언트를 통해 실행, 10 월에 고는 cryostat를 사용 하 여 10 µ m 두꺼운 섹션을 잘라 고정.

1. 는 4 º C 찬 방, 찬 장, 또는 냉장고, 발판 아래 램프 방향을 지정 하 고 발판에 샘플 챔버를 놓습니다. 시료 챔버에 아 지 드 TBS 솔루션 50 mL를 붓고.
2. Submerge 조직 섹션 표준 유리 현미경 슬라이드를 포함 하는 아 지 드-TBS 청소 집게를 사용 하 여 슬라이드 챔버에 장착. 여러 슬라이드, 슬라이드는 단일 레이어에 챔버에 배치 됩니다 확인 하십시오.
3. 반사 돔과 기구를 커버, LED 램프 켜고 4 º C에서 48 h에 대 한 품 어.

3. 면역 형광 검사

1. 얼룩 phosphorylated 타우 DAPI counterstain와 알 렉 사 488-및 텍사스 레드 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여에 대 한 조직, 먼저 항 원 검색, permeabilization, 차단, 그리고 기본에 대 한 솔루션을 준비 하 항 체 바인딩입니다.
2. 항 원 복구의 준비 500 mL
   버퍼 (10 m m 구 연산, 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산, 0.05% 트윈 20, pH 6.2) 0.92 g의 연산 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) ddH ₂ O. 조정 산도의 500 ml의 0.37 g을 용 해 하 여 NaOH와 6.2를 트윈 20의 0.25 mL을 추가.
   1. 0.025%의 500 mL를 준비 Triton X-100 Triton X-100의 0.125 mL 500 mL 1 추가 하 여 TBS 솔루션 (TBS-트리톤)에 tbs. x
   2. 준비에 TBS (BSA TBS 버퍼) 0.1 g 10 ml tbs. BSA를 용 해 하 여 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션
   3. 차단 솔루션을 준비 하는 1%의 1.8 mL를 정상 염소 혈 청의 0.2 mL를 추가 하 여 BSA/tbs.
   4. 각 슬라이드에 대 한 안티-인-PHF-타우 pSer202 + Thr205의 pipetting 1.5 µ L에 의해 1 차적인 항 체 솔루션 (1: 100 희석)의 150 µ L 준비 1% BSA TBS 버퍼 및 얼음에의 148.5 µ L에 항 체 (AT8)
3. 항 원 복구를 수행 하려면 antigen 검색 버퍼의 25 mL를 포함 하는 슬라이드 수집기에 세로로 photobleached 슬라이드 잠수함. 컬렉터 물 목욕으로 빠지지 않는 그런 테이프 또는 문자열 수집기를 보호 합니다. 30 분 동안 90 ° C에 물 목욕에서 수집기가 열 하 고 슬라이드를 제거 하기 전에 30 분 동안 실내 온도에 냉각 수집기를 허용. 그것으로 즉시 슬라이드 섹션을 밖으로 건조 하면 제거 하지 마십시오.
4. 는 TBS 트리톤의 30 mL 가득 얼룩 항아리에 항 원 검색 수집기에서 슬라이드를 전송 하 고 부드러운 떨고와 궤도 통에 5 분에 대 한 섹션을 씻어. 신선한 TBS-트리톤으로 한번 세척을 반복 합니다. 윅 보풀 조직과 개요 소수 성 펜으로 조직으로 멀리 초과 버퍼입니다. 알아서 하지 슬라이드 밖으로 건조 하 게.
   1. 각 슬라이드에 대 한 조직 pipetting 200 µ L 조직에 솔루션을 차단에 의해 차단 및 습도 챔버에 슬라이드를 배치. 젖은 종이 수건을 포함 하는 피 펫 팁 상자 안에 슬라이드 랙 배치 하 여 챔버를 구성 합니다. 2 h 평면에 대 한 실 온에서 품 어. 차단 솔루션 완전히 조직을 포함 하는 확인 하십시오.
5. 포부에 의해 차단 솔루션을 제거 하 고 조직에 1 차적인 항 체 솔루션의 100-150 µ L 플라스틱. 충분 한 양의 항 체는 1 개의 측에 항 체 솔루션의 풀링 하지 않으려면 레벨 표면에는 구역 확인 합니다. 습도 챔버에 하룻밤 4 º C에서 품 어.
6. 이차 항 체 혼합물과 DAPI 핵 counterstain 준비.
   1. 각 슬라이드에 대 한 염소 반대로 마우스 알 렉 사 488의 1.5 µ L과 염소 반대로 마우스 BSA TBS의 147 µ L 텍사스 레드의 1.5 µ L을 추가 하 여 이차 항 체 혼합물 (1: 100 희석)의 150 µ L를 준비 하 고 얼음에
   2. 준비 0.1 µ g/mL DAPI 직렬 희석에 의해 counterstain. 재고 솔루션을 철저 하 게 혼합 하 고 재고 5 mg/mL DAPI에서 5 µ g/mL 해결책의 1 mL를 만들려고 TBS의 999의 1 µ L를 희석. 각 슬라이드에 대 한 희석 3 μ0.1 µ g/mL의 최종 농도에 TBS의 147 µ L 5 µ g/mL 해결책의 L.
      주의: DAPI 알려진된 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다.
7. 포부에 의해 1 차적인 항 체를 제거. TBS-트라이 톤의 궤도 셰이 커에 부드러운 혼합으로 5 분 동안 세척 30 mL를 포함 하는 항아리를 얼룩 유리에서 슬라이드 잠수함 신선한 TBS-트리톤와 세척 단계를 반복 합니다. 멀리 초과 TBS 트리톤 심지 하 고 각 슬라이드에 이차 항 체 혼합물의 100 ~ 150 µ L 플라스틱.
   1. 확인 조직 항 체 혼합물에 의해 완전히 덮여 있다. 어둠의 습도 챔버에 실 온에서 2 h에 품 어.
8. 포부에 의해 이차 항 체 혼합물을 제거 하 고 슬라이드 유리 얼룩 TBS (트리톤) 30 mL를 포함 하는 항아리로 전송. 궤도 셰이 커에 부드러운 혼합으로 5 분 동안 세척. 신선한 tbs.와 세척 단계 각 슬라이드에 0.1 µ g/mL DAPI counterstain의 100 ~ 150 µ L을 적용 하 고 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 품 어 반복.
9. 는 TBS를 포함 하는 항아리를 얼룩 유리 슬라이드를 전송 하 고 5 분 각, 각 세척에 대 한 신선한 TBS를 사용 하 여 부드러운 혼합과 3 번을 씻어. 멀리 초과 버퍼 윅.
10. 적용 3 방울 수성 장착 매체 조직에의. 집게를 사용 하 여 부드럽게 한 가장자리부터 시작 하 고 천천히 기포의 트랩을 피하기 위해 다른 가장자리를 낮추는 조직에 깨끗 한 유리 coverslip 낮은. 알아서 하지 즉시 이미징 하는 경우는 coverslip를 꺼내. 그렇지 않으면, 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 하기 전에 건조 장착 매체 허용.

4. 형광 현미경 검사 법

형광 램프, 현미경 및 컴퓨터에
1. 차례 15 분 장소 얼룩진된 조직 형광 현미경 단계에서 슬라이드에 대 한 따뜻한 램프를 허용 하 고. 밝은 필드 이미지를 사용 하 여 10 배 확대에 조직 찾습니다.
2. DdH ₂ O의 드롭 coverslip 표면에 적용 하 고 20 x 물 침수 대물 렌즈를 사용 하 여 (나 = 1.0). 4 라인 평균 비행기 검사 설정을 선택 합니다. 1 공기 단위 ~ 3 미크론의 광학 분할을 주는 작은 구멍 크기를 설정 합니다. 최상의 신호에 대 한 별도 트랙에 각 fluorophore의 레이저 여기 및 방출 파장을 선택 합니다.
   참고: 알 렉 사 488: _ex λ = 488 nm (아르곤 레이저) λ _em = 493-570 nm; 텍사스 레드: λ _전 561 = nm (DPSS 561 nm 레이저), λ _em 601-635 nm; = DAPI: λ _전 = 405 nm (레이저 다이오드 405), λ _em 410-507 nm =.
   1. 레이저 파워를 조정 하 고 각 트랙에 대 한 신호 강도 최적화 하는 설정을 얻을. 합성 이미지를 수집 하 고 저장 합니다. 동일한 레이저 설정을 사용 하 여 다른 슬라이드에 형광 강렬을 비교.
3. 각 채널에서 형광 강도의 시각화, ImageJ ¹⁰ RGB 프로 파일 도구 매크로 설치. 웹 페이지에서 텍스트 파일 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)으로 매크로 저장 합니다. ImageJ 메뉴에서 플러그인-선택 > 매크로-> 설치; RGB 프로 파일 도구를 설치 하는 텍스트 파일을 선택 합니다.
   1. Confocal 이미지 파일 ImageJ 열고 다음을 수행 하 여 rgb 3 스택에서 복합 이미지 변환: 이미지-> 색상-> 채널 도구. 선택 " 복합 " 3 채널 드롭다운 메뉴 및 확인 모든. 그런 다음 이미지-선택 > 타입-> RGB 색상.
   2. 는 RGB 프로 파일 도구 아이콘을 선택 하 고 이미지를 프로 파일링 섹션에서 선을 그립니다. 강도 데이터를 스프레드시트로 저장.

결과

Photobleaching 전처리 단계 직전 항 원 검색 및 immunostaining (그림 1A) 표준 면역 형광 검사 프로토콜을 추가할 수 있습니다. Photobleaching 장치에의 조립 또한 수행할 수 있습니다, 다양 한을 사용 하 여 저렴 한, 상용 구성 요소 (그림 1B). 흰색 형광체의 발광 스펙트럼 Led 이전 보고서 (그림 1C)^5,11동의 그들 광범위 한 범위 photobleaching를 위해 적당 한 시키는 파장의 광범위 커버. 48 h photobleaching, 후 유사한 lipofuscin 뿐만 아니라 일반적인 배경 형광 autofluorescent speckles의 강도 FTLD...

토론

조직의이 원고에 설명 된 photobleaching 전처리 상용 구성 요소를 사용 하 여 autofluorescence의 효과적인 제거 할 수 있습니다. 프로토콜 phosphorylated 타우 포 르 말린 고정 뇌 조직 알 렉 사 488, 핵 counterstain로 DAPI와 텍사스 적색 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 집계의 면역 형광 영상을 설명 합니다. 다른 조직에 메서드를 적용 하려면 시작 지점으로 샘플을 48 h photobleaching 사전 치료를 수행 하는 것이 좋습니다. Photobleaching, 후 표준 면역 형광 항 체 희석 제조업체의 권장 사항에 따라 사용 하 여 관심사의 기능에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지를 수행 합니다. 배경 형광 여전히 있으면 photobleaching 기간 및 단계를 얼룩이 지는 항 체 또는 수정할 필요가 있다. Photobleaching의 기간 램프 기구와 샘플에서 autofluorescence의 수준 선택에 따라 달라 집니다. 각 고유 램프 기구에 대 한 최적의 표백 시간...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
콜로라이드 나트륨	Sigma-Aldrich	S7653
염산	Caledon 실험실 화학 물질	1506656
아지드 나트륨	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	photobleacher의 모든 구성 요소는 가용성에 따라 대체될 수 있습니다
6 W LED 조광 가능 책상 램프	DBPower	DS501	photobleacher의 모든 구성 요소는 가용성에 따라 대체될 수 있습니다
구연산	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid ( EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
수산화나트륨	BioShop Canada	SHY700.1
수조	Haake Fisons	K15
슬라이드 수집기	FisherScientific	12-587-17B
염색 용기	FisherScientific	E94
오비탈 셰이커	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
소 혈청 알부민	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
소수성 펜	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal 항체 (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse 2차 항체, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse 2차 항체, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
마운팅 매체	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal 현미경	Zeiss	LSM710
이미징 소프트웨어 ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	소프트웨어는 컨포칼 현미경
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB 프로파일 도구 매크로	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
상업용 화학 담금질제	비오텀	23007