세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

요약

세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.

초록

세균성 성장 시스템 수준에서 세포 역학 조사에서 뿐만 아니라 현대 미생물 생리학의 발달에 중앙 개념 이다. 최근 연구는 세균성 성장 및 게놈 감소와 transcriptome 개편 같은 게놈 넓은 이벤트 사이의 상관 관계를 보고 했다. 올바르게 박테리아의 성장을 분석 유전자 기능 및 세포 구성 성분의 성장-종속 조정 이해 결정적 이다. 따라서, 높은 처리량으로 세균 성장의 정확한 정량적 인 평가 필요 합니다. 신흥 기술 개발 공부 하는 박테리아의 성장을 위해 사용 하는 방법의 업데이트를 허용 하는 새로운 실험 도구를 제공 합니다. 여기 소개 하는 프로토콜 세균성 성장의 재현 하 고 정확한 평가 위해 고도로 최적화 된 실험적인 절차 microplate 리더를 사용 합니다. 이 프로토콜의 성장을 평가 하는 데 사용 되었다 대장균 변종 설명한. 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다: 재현할 결과와 높은 처리량 성장 평가 96 잘 접시를 사용 하 여, 두 가지 주요의 수동 계산 반복된 테스트에 대 한 작은 튜브에서 셀 주식의 많은 수의 준비 매개 변수 (즉, 최대 성장 속도 인구 밀도) 성장 역학을 나타내는. 전통적인 식민지 형성 단위 (CFU) 분석 결과, 한 천 배지에서 시간이 지남에 따라 유리 튜브에 교양 있는 셀을 계산, 비교 현재의 방법 보다 효율적 고 성장 변화, 자세한 시간 레코드를 제공 합니다 하지만 엄격한 낮은 인구 밀도에 검색 제한입니다. 요약, 설명된 방법 개념적 결론 또는 이론적 관찰 하도록 이용 될 수 있는 세균 성장의 정확 하 고 재현성 높은 처리량 분석을 위해 유리 하다.

서론

미생물 연구는 종종 세균 세포의 문화, 그리고 세균 생리학^1,2,3의 기본적인 현상을 대표 하는 세균성 성장 곡선의 평가로 시작 합니다. 세균성 문화는 근본적인 방법론 때문에 기본적인 문화 원리 교과서 출판된 연구 문학에 널리 사용할 수 있습니다. 벤치 수준에서 상당한 관심은 전통적으로에 초점을 맞춘 성장 미디어 최적화와 배양 조건, 하지만 성장 속도 제어는 미생물 생리학의 더 큰 이해를 제공할 것입니다 가능성이 되지 않았습니다. 광범위 하 게 공부⁴. 기 하 급수적으로 성장 하는 박테리아, 세포의 주요 매개 변수는 성장률, 게놈, transcriptome와 프로테옴^{5,6,7,8 조정 될 것으로 보고 되었습니다.} . 따라서, 세균성 성장의 양적 평가 미생물 생리학을 이해 결정적 이다.

세균성 성장 평가, 바이....

프로토콜

1. 성장 매체를 준비

참고: 최소한의 중간 M63의 화학 조성은 다음과 같습니다: 62 m K m ₂ HPO ₄, 39mm KH ₂ 포 ₄, 15 밀리미터 (NH ₄) ₂ 등 ₄, 1.8 µ M FeSO ₄, 15 µ M 티 아민-HCl, 0.2 m m MgSO ₄ 및 22 m m 포도 당. M63 3 재고 솔루션을 혼합 하 여 이루어집니다: 5 X 솔루션, 20% 포도 당 및 MgSO ₄ 티 아민 솔루션. 4 모든 솔루션을 저장 ° C.

1. FeSO ₄ 솔루션을 준비 하는 5 X 솔루션
   1. 준비를 사용 하 여 전기 피 펫, 일회용 혈 청 학적인 피 펫 ddH ₂ O 50 mL 원심 분리기 튜브를 추가. P-200 0.06 mL HCl 0.01 M HCl. 추가 36 mg FeSO ₄-7 H ₂ O를 섞어 잘 추가를 사용 하 여.
   2. 160 mL ddH ₂ O 측정 실린더에 측정 하 고 500 mL 비 커....

결과

설명된 방법 96-잘 형식 리더는 여러 광학 밀도 측정 (일 분)에서 다양 한 시간 간격을 이용 하 여 동적 세균성 성장을 지속, 높은 처리량으로에서 잡으려고 수단을 제공 합니다. 다양 한 유전자를 표현 하는 E. 콜라이 긴장의 구색의 성장 곡선 단일 실험 (그림 1A)에서 정확 하 게 취득 될 수 있다. 설명된 방법에 비해 전통적인 방법 (CFU 분석 결과) 일반적으로 필요 이상 샘플링 시간 간격 (그림 1B) 이며 노동 집약적인 여러 문화 필요한 경우. 또한, 각 문화 샘플링 시간 CFU 분석 결과 대 한 작은 양의 세포 배양을 반복된 측정에 사용할 수 없습니다 사용을 해야 합니다. 또한, 검색 시간 포인트의 제한 된 숫자는 성장 속도 및 최대 OD₆₀₀의 정확한 계산에 필요한 샘플링 포인트를 놓칠 수 있습니다. 그러나, CF.......

토론

프로토콜에 중요 한 단계는 기 하 급수적으로 성장 하는 세포와 같은 샘플은 microplate에 다양 한 위치에서 여러 우물에서의 복제의 보통주 준비 포함 됩니다. 이전, 미생물학 하룻밤 사전 문화에서 문화를 시작 했다. 이 방법은 세균 성장의 지연 시간을 줄일 수 있습니다, 하는 동안 재현할 수 성장 곡선을 달성 하기 어렵다. 그림 2에서 같이 거의 동일한 성장 곡선, 재현할 수 및 정확한 결과 제공 하는 일반적인 글리세롤 주식을 사용 하 여 독립 측정 결과. 그림 3에서 보듯이 다양 한 위치에서 웰 스는 측정의 글로벌 배경 이라고 여겨진다 약간 다른 읽기에 제공 합니다. 세균성 성장의 양적 평가 대 한이 배경 고려 되어야 한다. 실험적인 복제에 대 한 다양 한 플레이트 위치에 여러 우물을 샘플의 접종이 글로벌 바이어스에 대 한 계정에 좋습니다.

오류를 처리, 뿐만 아니라.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
K2HPO4	Wako	164-04295
KH2PO4	Wako	166-04255
(NH4)2SO4	Wako	019-03435
MgSO4-7H2O	Wako	138-00415
Thiamine-HCl	Wako	201-00852
포도	Wako	049-31165
HCl	Wako	080-01066
철 (II) 황산 헵타하이드레이트 (FeSO4-7H2O)	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
글리세롤	Wako	075-00611
원심분리기 튜브 (50 mL, 멸균)	WATSON	1342-050S
피펫 팁, 200 &마이크로; L	WATSON	110-705Y
피펫 팁, 1,000 &마이크로; L	WATSON	110-8040
Microtube (1.5 mL)	WATSON	131-715C
8 멀티채널 피펫	WATSON	NT-8200
PASORINA STIRERER	AS ONE	2-4990-02
유리 실린더(200 mL)	AS	ONE 1-8562-07
정밀 pH	mater AS	ONE AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
일회용 혈청 항 피펫 (10 mL)	SANPLATEC	SAN27014
일회용 혈청 항 피펫 (25 mL)	SANPLATEC	SAN27015
마이크로 튜브 스탠드	BM Bio	801-02Y
Vortex	BM Bio	BM-V1
Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Corning Costar 시약 reservoir (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µ M)	Merck Millipore	SCGVU02RE
Pipet-Aid XP	DRUMMOND	4-000-101
Bioshaker (BR-23UM MR)	TAITEC	0053778-000
Disposal cell (1.5 mL)	Kartell	1938 / 2-478-02
DU 730 Life Science UV/Vis 분광 광도계	Beckman Coulter	A23616
EPOCH2	BioTek	2014- EP2-002 / EPOCH2T
비커 (500 mL)	IWAKI	82-0008
BIO 클린 벤치	Panasonic	MCV-B131F
유리관	NICHIDEN RIKA GLASS	P-10M ~ P-30 / 101019
실리콘 고무 마개	ShinEtsu Polymer	T-19
박테리아 균주 균주 균주	은행 조직; 일본 국가 바이오 자원 프로젝트(NBRP)

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