마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

요약

많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

초록

혈관 불충분 그리고 정상 망막 관류 변경 다양 한 시력을 위협 하 고 안구 질환, 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증 및 녹 내장 등의 병 인에 대 한 주요 요인 중입니다. 따라서 망막 microvascular 준비 중추적인 도구 기본 병 태 생리 기계 장치 윤곽을 그리 다 생리 및 약리 연구 및 질병에 대 한 치료를 디자인 하는. 안과 연구에 마우스 모델의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 망막 혈관 반응성에 대 한 연구는이 종에서 부족. 이 불일치에 대 한 주요 이유는 도전적인 격리 절차는 이러한 망막 혈관의 작은 크기 때문 ~ luminal 직경에서 ≤ 30 µ m. 기능 연구에 대 한 이러한 망막 microvessels의 직접 분리의 문제를 회피, 우리 ex vivo 마우스 망막 vasoactivity 근처 생리 적 조건 하에서 연구를 가능 하 게 절연 및 준비 기술 설립 . 현재 실험 준비 특히 마우스 망막 arterioles를 참조 것입니다, 하지만이 방법은 쉽게 사용할 수 있습니다 microvessels에 쥐에서.

서론

망막 관류에 장애 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증, 녹 내장^1,2,3등 다양 한 안구 질환의 병 인에 연루 되었습니다. 따라서, 망막 혈관 반응성을 측정 하기 위한 연구는 이러한 질병의 병 태 생리학을 이해 하는 것이 중요 하 고 접근 새로운 치료를 개발 하.

Murine 게놈에서 유전자 조작의 가능성으로 인해 마우스⁴심장 혈관 시스템 연구에 대 한 널리 사용 되는 동물 모델 되고있다. 그러나, 망막 혈관 (≤ 30 µ m)의 작은 크기 때문에 측정 마우스 망막 혈관 반응성의 도전 이다. 예를 들어 stereomicroscopic vivo에서 측정을 위한 그들의 광학 해상도 제한 기술과 따라서 ≤ 30 µ m 직경 장비 될 때 보다는 더 적은의 작은 피에 지름 또는 혈액 흐름에 변화를 정확 하 게 탐지를 허용합니다 confocal 현미경 또는 적응 광학 스캔 빛 Ophthalmoscope^5,6형광 염료를 사....

프로토콜

이 연구의 실험 절차에 의해는 동물 관리 위원회의 라인란트-Palatinate, 독일 승인 되었다. 동물 보호 안과에서 동물의 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 성명에서 연구 및 비전 연구 기관 지침 및 협회에 맞 췄 나. 동물 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 치료 했다. 남성 C57BL/6J 쥐 (The 잭슨 실험실, 바 하버, 나, 미국) 3-4 개월을 세는 실험을 위해 사용 되었다. 동물 표준 조건 (온도 23 ± 2 ° C, 습도 범위 55 ± 10% 및 12 h 명암 주기), 유 숙 했다 그리고 표준 마우스 차 우와 물 광고 libitum에 접근 했다.

1입니다. 마우스 망막의 분리

1. 해 부 악기를 준비 테이블에 놓고 모든 악기 가능 빠른 준비 완료 확인 합니다.
2. CO₂ 흡입에 의해 마우스를 희생.
3. 스틸가 위 마우스를 목을 벨, 두개골 sagitally가 위의 동일한 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽으로 잘라 고 피부와 뇌 눈이 위 (그림 1)를 사용 하 여 제거 합니다.
4. 눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 떠나 두개골 뼈를 잘라.
5. ....

결과

U-46619 농도-종속 vasoconstrictor 응답 망막 arterioles 야생-타입 마우스 C57Bl/6J 배경에서 생산. 10^-6 M의 농도에서 luminal 직경에서 감소는 휴식 직경에서 ≈50 %를 했다. 그림 9A 한 망막 되의 대표적인 농도-응답 곡선을 보여 줍니다. U46619와 preconstricted arterioles에 아 세 틸 콜린의 누적 관리 갖는 luminal 직경 농도 의존 증가 ≈25 %를 10^-5 M, 그대로 혈관 내 피 (지표에 preconstricted 직경에서 그림 9B)입니다.

토론

마우스 망막에 혈관 반응의 측정은 망막 혈관의 작은 크기 때문에 도전 이다. 제시 기법으로 망막 arterioles 전송된 가벼운 현미경 검사 법에 의해 시각화 됩니다. 이 격리 된 망막은 반투명 하기 때문에 가능 하다. 기술의 장점은 높은 광학 해상도입니다. 계산된 공간 해상도 11 픽셀 / µ m 이다. 그러나, 하얀 빛을 사용 하 여이 광 시스템에 대 한 실제 해상도 Abbe 회절 한계에 의해 설명 된다 200, 300 nm 사이입니다. 마우스 망막 arterioles의 첫 번째 분기에는 20 ~ 30 μ m의 내부 직경, 이후 약 1%의 직경 변화가이 시스템으로 알 수 있습니다. 작은 망막 arterioles^5,,67시각화에 추가 기술 장치 또는 다른 연구에서 보고 형광 염료의 필요가 있다. 기술의 단점은 훈련 된 수 사관 90 ~ 120 분 사이 긴 준비.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
강철 가위	Carl Roth GmbH	3576.1	1x 140 mm
눈 가위	Geuder	G-19390	1x 스트레이트, 10.5cm
정밀 핀셋, 가는 팁이 있는 스트레이트	Carl Roth GmbH	LH68.1	2x 타입 4
정밀 핀셋, 엑스트라 파인 팁이 있는 스트레이트	Carl Roth GmbH	LH53.1	2x 타입 5
Vannas 캡슐 절개술 가위	Geuder	19760	1x 직선, 77mm
학생 Vannas 스프링 가위	Fine Science Tools	91501-09	1x 곡선,
Barraquer< / em> 바늘 홀더	Geuder	G-17500	1x 곡선, 120mm
바늘	Becton, Dickinson and Company		305128 1x 30G
유리 모세 필라리 (마이크로 피펫 생산 용)	Drummond Scientific Company	9-000-1211	1x (1.2 x 0.8 mm, 외경/내경)
나일론 봉합	Alcon	198001	1x 10-0
Nunclon 세포 배양 접시	Thermo Fisher Scientific		153066 1x 35 mm 직경
Nunclon 세포 배양 접시	Thermo Fisher Scientific	172931	1x 100 mm 직경
Discofix C	Braun	16500C	10 cm
Histoacryl 접착제	B. 브라운 외과, S.A.	1050052
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Equipment
Pericyclic pump  (싸이클로 II)	Carl Roth GmbH	EP76.1	1x
수직 피펫 풀러 모델 700C	David Kopf Instruments		1x
현미경(Vanox-T AH-2)	Olympus		1x
침수 대물렌즈 LUMPlanFL, 1.0 NA	Olympus		1x
디지털 카메라(TK-C1381)	JVC		1x
관류 챔버	자체 제작		1배
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>
Ethanol	Carl Roth GmbH	K928.4
염화칼슘 이수화물(CaCl2)	Carl Roth GmbH	5239.1
염화칼륨 (KCl)	Carl Roth GmbH	6781.1
인산이수소칼륨 (KH2PO4)	Carl Roth	GmbH 3904.2
황산마그네슘 (MgSO4)	Carl Roth GmbH	261.2
염화나트륨 (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265.2
탄산 수소 나트륨 (NaHCO3)	Carl Roth GmbH	0965.3
α-(D)-(+)- 포도당 일수화물	Carl Roth GmbH	6780.1
9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619)	케이맨 화학	16450
아세틸 콜린 클로라이드	시그마 Aldrich	A6625-25G

사