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방법 논문

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

9.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56213

⸱

2018년 1월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

초록

DNA 손상 유도 게놈 무결성의 보호에 대 한 중요 한 셀에 특정 신호 및 복구 응답 합니다. 레이저 microirradiation 귀중 한 실험 도구는 DNA 손상 응답 (DDR) vivo에서조사 되었다. 레이저 유도 손상 세포 핵에 있는 submicrometer 지역에 대 한 응답에서 고분자 역학의 실시간 고해상도 단일 세포 분석을 수 있습니다. 그러나, 다양 한 레이저 조건 유도 된 손상의 종류에 있는 다름의 감사 없이 사용 되었습니다. 그 결과, 피해의 특성은 종종 잘 특징 또는 제어, 채용 또는 수정 프로필에 명백한 불일치를 일으키는. 우리는 다른 방사선 조건 (즉, 다른 파장으로 펨 (fs) 근처-적외선 (NIR) 레이저의 다른 입력된 파워 (irradiances)) 고유 DDR 및 복구 단백질 어셈블리 유도 시연 했다. 이 생산 하는 DNA 손상의 종류를 반영 한다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 레이저 입력된 전력의 적정 수 다른 금액의 유도 및 자료 및 가교 손해, 신호 처리, 차동 폴 리 (ADP-ribose) (파)의 탐지에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다, DNA 손상의 복잡 하 고 피해 사이트에서 경로 특정 복구 요소 어셈블리입니다. 손상을 조건 결정, 일단 관심의 어떤 요소에 업스트림 factor(s)의 고갈 뿐만 아니라 다른 손상 복잡성과 차동 손상 신호 전달의 효과 조사 가능 하다.

서론

Vivo에서 DNA 손상 신호는 잘 이해 되지
Vivo에서, DNA는 히스톤과 양식 chromatin 섬유에 다른 요인 complexed. Chromatin 구조의 규정은 DNA 물질 대사에 대 한 파라마운트의 중요성입니다. 예를 들어 히스톤 변형 H2AX 증-오점이 돌연변이 (ATM)와 다음 이중 가닥 (DSB) 유도, 휴식과 DSB 손상 신호 증폭으로 다른 도킹 사이트를 제공 하는 것이 중요 하다 다른 kinases phosphorylated은 요인입니다. 손상 신호 및 복구 통로 선택의 확산 비판적으로 피해 사이트1에서 로컬 chromatin 구조에 의해 영향을 받을 것으로 보인다. 다양 한 요인, 히스톤 보호자 및 히스톤 수정 효소를 개장 하는 chromatin 실제로 사이트 손상 모집 DDR에서 chromatin 규제의 중요성을 강조 하는 효율적인 DNA 수리를 위해 중요 한 및 복구2 , 3 , 4. 또한, 피해 사이트 클러스터링 또는 재배치 효 모와 초파리5,6,7,8, relocalization에 유전자 loci의 연상에서 관찰 되었다는 subnuclear 구획 연관 유전자 규칙9,10. 마우스와 인간 세포에 있는 최근 연구는 또한 DSB 사이트, 어느 영향 복구 충실도 및 통로 선택11,12의 동원을 공개 했다. 이 DDR/수리도 연결 될 수 있습니다 속속들이 핵 건축, 더 높은 순서 chromatin 조직과 염색체를 세포 핵에 역학 가능성 제기. 따라서, DDR을 연구 하 고 DNA 손상의 단기 및 장기 결과 이해 하기 위해서는 살아있는 세포에서 핵 생 환경에 프로세스를 복구 고해상도 방법을 개발 하기 위해 중요 하다.

파 중 합 효소 (PARP) 손상의 유형과 정도 측정 하 고 규제 피해 사이트에 단백질 조립에의 중요 한 역할
PARP1는 DNA 수리13에서 중요 한 역할을 담당 하는 DNA 손상에 의해 빠르게 활성화 DNA 닉 센서입니다. PARP1 원래 x 선 수리 크로스 보완 1 (XRCC1) 기본 절단 수 선 (BER)를 촉진 하기 위하여 함께 작동 생각 하지만 최근 연구 결과 공개 DSB 수리14를 포함 하 여 다른 DNA 복구 경로에서 역할. 자신을 포함 한 여러 대상 단백질, ADP ribosylate는 기판으로 PARP1 사용 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)을 활성화. 이 효소와 다른 가족 구성원 있다 관심을 끌었다 많은 최근 몇 년 동안에서 PARP 억제제는 암에 대 한 유망 치료 약물 등장 했습니다. PARP 억제제 처음 유 방 암 유전자 (BRCA)에 효과가 있어야 발견 했다 비록-유 방 암 세포를 돌연변이 지금 에이전트/조사에 대 한 손상 DNA와 함께 모노-및 조합 치료에 그들의 효과 대 한 증거의 과다 한입니다 BRCA15,,1617,18,19,20을 돌연변이와 암의 광범위 한 스펙트럼.

분자 수준에서 PARP 활성화 조직 손상 사이트에서 로컬 chromatin 구조에 중요 한 역할을 표시 했다. Chromatin 변경 효소의 파 종속 모집 DSB 수리를 용이 하 게 하 고 지시 복구 경로 선택, 파 수정 피해 사이트에서의 중요 한 발판 역할을 제안 합니다. 13,21,22,23,,2425,26,27,28,29, 30,31 우리는 최근 손상에서 p53 바인딩 단백질 1 (53BP1)의 배제를 시연 파 32, 비 동종 endjoining (53BP1-종속 hyperactivation에 대 한 대체 설명을 제공 하 여 사이트 NHEJ) 의해 PARP 억제제 및 DSB에 PARP의 중요성을 강조 복구 통로 선택33,34. PARP1 또한 PARylates 및 활동의 여러 DNA 복구 직접 요인14.

DDR/수리에서 Vivo에서 공부 하는 도구로 서 레이저 Microirradiation를 사용 하 여
개별 염색체에 서브 미크론 변경 생산 레이저 microirradiation 196935 에 설명 된 처음 이었고 198136에 자세히 검토. 몇 십년 후, 레이저 microirradiation 세포 핵에 정의 된 submicrometer 지역에서 DNA 손상 유도 표시 했다 고 모집 또는 수정 다양 한 요인의 DNA 병 변 비보 를 연구 하는 귀중 한 기술 입증 되었다 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41.이 메서드는 손상 사이트39,42에서 뚜렷한 방사선-유도 포커스 (IRIF)를 형성 하지 않습니다 그 요인의 탐지를 수 있습니다. 그것은 또한 손상 사이트에서 고 핵의 나머지에서 chromatin 구조 변화 spatiotemporal 역학 검사 가능. 우리는 신중 하 게 다른 레이저 시스템에 의해 유도 된 Ddr에 비해 DNA 손상의 유형 및 microirradiation 조건32,,4344, 사이의 관계를 평가 하는 능력을 입력 하 고 45. 53BP1 및 telomeric 탈 채용 패턴 반복 바인딩 요소 2 (TRF2) 레이저 유도 손상46의 "비 생리" 자연에 대 한 되풀이 우려에 대 한 기초를 제공 하는 이전 레이저 손상 연구에서 관찰 되었다 ,47,,4849. 우리는 양과 복잡성 유발된 손상32의 계기 신호 이러한 명백한 불일치 이제 차동 PARP에 의해 설명 될 수 있는 발견. 우리 확인: 1) (높은 입력 전력 조사) 후에 레이저 microirradiated 세포 손상 검사점 제어 종속 방식에서 interphase에 체포와 유지 가능한 (적어도 48 h까지)32,50; 그리고 2) 수리 계수 모집/수정 충실 하 게 그 endonucleases32,,3942에 의해 기존의 DNA 파괴적인 대리인을 가진 처리와 DSB 유도 관찰 정리 44,50,,5152. 이러한 결과 강하게 레이저 손상 유발 세포 응답의 생리 적인 관련성을 지원 합니다.

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프로토콜

1. 기본 셀 준비

참고:이 단계는 생 단백질 모집 또는 수정, 표준 면역 형광 감지 하 고 안정적으로 붙일 태그가 재조합 단백질을 표현 하는 셀 라인의 사용에 대 한. 예를 들어 Potorustridactylus (PtK2) 주머니 신장 상피 세포 이전에 사용 되었다 안정적 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP 표현 연구 (그림 1)32. 전자의 경우, 53BP1의 지역 형성 하는 초점 (아미노산 1220-1711)를 포함 하는 oligomerization 도메인, 튜더 도메인 및 ubiquitylation 종속 모집 (UDR) 주제, 향상 된 GFP (EGFP 53BP11220-1711)를 융합 했다. 이 융해 단백질이 전체 길이 53BP153,,5455의 피해 사이트 모집. HeLa 세포에서 cohesin (예를 들어, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52, 그리고 GFP SA2 51)의 붙일 태그가 subunits 표현 해야 합니다 안정적으로 복잡 한에 효율적인 통합을 보장 하 고 정리 S/g 2 세포 주기 단계 관련 피해 사이트의 채용 생 cohesin51.

  1. 개별 셀 식별을 위해 허용을 gridded coverslip로 35mm 조직 문화 접시에 모든 부착 셀 형식을 씨앗합니다 36-48 h에 대 한 특정 셀 라인의 확산 속도에 60 %confluency 달성 하기 위해 초기 셀 수를 조정 합니다. 예를 들어:
    1. PtK2 유대류 신장 상피 세포 (야생 타입 또는 그 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP 안정적으로 표현)에 대 한: 2 m L-글루타민, 4% 태아 소 접시 2.0 x 104 셀 2 mL에 고급 최소 필수 매체 (MEM) 보완 혈 청 (FBS), 그리고 항생제 (100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스), 및 7% CO2와 37 ° C에서 품 어.
    2. 헬러에 놓여있는지 표현 안정적으로 세포 재조합 단백질 GFP SA2 태그: 씨앗 1.0 x 105 2 mL에 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)과 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 그리고 5% CO2와 37 ° C에서 품 어. 다른 HeLa 세포도 수정 되지 않은 셀 또는 hSMC1 GFP를 표현 하는 셀을 포함 하 여 사용할 수 있습니다.
  2. 준수 하 고 30-60% 합류 (허용 하는 격자 수의 시각화)에서 DNA 손상 유도 전에 36-48 h에 대 한 증식 하는 세포를 허용 한다. 섹션 4로 이동 합니다.

2. 과도 Transfection

참고: 때로는 좋은 항 체 생 단백질을 감지할 수 있습니다. 셀 라인 마커 단백질을 표현 안정적으로 사용할 수 없는 경우, 과도 transfections 붙일 레이블된 단백질 살아있는 세포 분석을 위한 모니터링을 실시 합니다.

  1. 헬러 세포, 하루에 1, 6-8 x 104 셀에 24-잘 접시의 한 잘 0.5 mL 문화 미디어에 씨앗 및 5% CO2와 37 ° C에서 100% 습도 인큐베이터에서 품 어. 1.1 배양 조건에 대 한 단계를 참조 하십시오.
  2. 주 2, 포유류 식 플라스 미드 인코딩 붙일 태그가 DNA 복구를 사용 하 여 요소 (예를 들어, GFP-NTH1 또는 기본 피해32,44,56, 높은 복용량 DSBs57, GFP-53BP1 GFP 구 GFP-OGG1 32 비교적 간단한 DSBs 또는 형광 태그를 융합 하는 관심사의 다른 단백질에 대 한) DNA transfection liposome 중재 수행 하. 0.3 µ g 플라스 미드 DNA 1.5 mL 튜브에 혈 청 자유로운 문화 매체의 25 µ L로 희석.
  3. 또 다른 1.5 mL 튜브에 혈 청 자유로운 문화 매체의 25 µ L로 1 µ L liposome 기반 DNA transfection 시 약을 희석 하 고 부드럽게 혼합 합니다.
  4. 부드럽게, 희석된 DNA와 transfection 에이전트를 혼합 하 고 양식 DNA 지질 단지를 실 온 (RT)에서 10 분 동안 품 어.
  5. 0.5 mL 문화 미디어와 린스 세포는 한 번, 미디어, 제거 하 고 0.5 mL 신선한 문화 미디어 (단계 1.1)에서 세포를 추가.
  6. 세포 DNA 지질 단지를 추가 합니다. 락 접시 몇 번으로 부드럽게 혼합. 2.1 단계와 마찬가지로 인큐베이터에서 다시 세포를 넣어.
  7. 후 4-6 h는 세포에서 문화 미디어를 제거 하 고 추가 300 µ L 0.05% 트립 신-EDTA. 그것을 제거, 추가 200 µ L 트립 신-EDTA, 그리고 3-4 분 동안 37 ° C 배양 기에서 품 어.
  8. 확인 후 세포를 분리, 800 µ L 문화 미디어를 추가 하 고 부드럽게 헤어 셀 덩어리를 pipetting으로 셀을 resuspend. Gridded coverslip로 35mm 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 2 mL의 최종 볼륨을 문화 미디어를 추가 합니다.
  9. 48 h, 단계 2.1에서 인큐베이터에서 셀을 품 어 다음 섹션 4로 진행 합니다.
    참고: 재조합 단백질의 표현식이 독성 (transfected 세포 단계 2.8에서에서 부 화 후 원형 또는 불규칙 한 형태를 표시), 식 시간을 단축 하 고 transfection 만큼 후 레이저 microirradiation (제 4) 16-20 h에 수행은 단백질 표정 확인 될 수 있다 (형광 탐지 단계 4.3 참조). 이 경우에, 35 mm 접시에 직접 transfection를 수행 합니다. 30 헤 Transfect DNA 플라스 미드, 후 약 50-70% 합류를 달성 하 여 미디어 2-6 h 변경할 gridded coverslip로 35 mm 접시에 시드 3.0 x 105 HeLa 세포 transfection 후. 레이저 microirradiation 12-20 h 진행 나중 단백질 표정 합리적 이며 셀 건강 표시 하는 경우.

3. 세포 주기 동기화

참고: 동종 재결합에 대 한 수리 (HR) 단백질, Rad51 등 cohesin, 채용은 세포 주기, 어떤 시간에 수리 소요 장소51의 S/g 2 단계에서 더 유명. 따라서, 이러한 단백질의 신규 모집, 모니터링 S/g 2 단계 셀 동기화 필요 하다.

  1. S/g 2 단계 동기화
    1. S/g 2 단계50,51셀 동기화에 대 한 이중 티 미 딘 블록 프로토콜을 사용 합니다. 35 mm gridded coverslip 접시에 셀 시드 후 (단계 1.1 참조), 셀 문화 미디어 (단계 1.1)에서 37 ° C에서 17 h (2.5 m m의 최종 농도)에 티 미 딘 그리고 5% CO2를 품 어.
    2. 1 mL 티 미 딘 무료 문화 미디어 (1.1 단계)로 셀을 두 번, 헹 구 고 셀 2 mL 티 미 딘 무료 문화 미디어 단계 1.1에서 9 h에에서 품 어.
    3. 티 미 딘 2.5 m m의 최종 농도에 세포와 배양에 27.5 m m 티 미 딘 재고 솔루션 (문화 미디어에 녹아 있는)의 200 µ L를 추가 합니다. 3.1.1 다른 15 h. 린스에 대 한 단계에서 셀을 품 어 하 고 셀 티 미 딘 무료 4-6 h 문화 미디어에 품 어 DNA 손상 (제 4) 유도.
    4. 세포 주기 마커를 사용 하 여 동기화 효율성을 확인 ( A2와 B1 S/g 2와 g 2는, 각각), S/g 2 단계-특정 DNA 손상 복구 요인 (예, Rad51 또는 cohesin), 또는 IdU/듀 (S 단계 세포)에 대 한 설립51.
  2. G 1 단계 동기화
    1. Gridded coverslip (2.1 단계)와 35mm 문화 접시에 104 HeLa 세포 x 씨 6-8.
    2. 2 일 후 약간 해제 하 고 10 X 목표와 10 X 눈 렌즈를 사용 하 여 거꾸로 현미경 라운드 모양의 분열 세포를 식별 합니다. Gridded coverslip 분열 셀의 위치를 기록 하는 이미지를 취득 합니다.
    3. 후 3-4 h (g 1 단계에서), 2 개의 딸 세포로 세포 분열을 확인 하 고 DNA 손상 (제 4) 유도.

4. 레이저의 적정 입력 전원

참고:이 프로토콜에서 우리 유도 780을 사용 하 여 DNA 손상 nm 펄스 fs NIR 레이저 시스템 confocal 현미경, 나는 800 nm 펄스 fs NIR 레이저는 거꾸로 피-형광 현미경을 결합. 입력된 전원 (실제 방사는 시료에 레이저 초점에서) 유사한 DDR을 유도 하는 데 필요한이 시스템에서 다른, 적정 입력된 전원의 기본 원리 이지만 둘 다, 또는, NIR 시스템32,57에 적용 . 두 개의 레이저 시스템에 대 한 초점에서 레이저 펄스와 피크 방사 당 현장에서 에너지 5.33 × 10-2-4 × 10-1 의 범위에서 했다 뉴저지, 7 × 1010-5.24 × 1011 W/c m2를 각각32.

  1. 적외선 레이저를 켜고 사용 하기 전에 1 시간 워밍업을 레이저 시스템.
  2. 있도록 CO2 (5%)와 습도 (100%) 제어 챔버에 온수 (37 ° C) 무대에서 셀의 접시를 놓습니다.
    참고: CO2 챔버를 사용할 수 없는 경우 사용 하 여 CO2-5-6 h에 대 한 독립적인 문화 미디어. 난방 단계를 사용할 수 없는 경우 < 20 분에 대 한 현미경 세포를 유지 하 고 즉시 적절 한 온도, CO2, 및 습도 제어 조직 문화 인큐베이터로 대체. 이러한 문화 조건 파생 (예를 들어, 양서류와 포유류)의 유기 체 뿐만 아니라 사용 하는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다.
  3. 붙일 태그가 단백질의 살아있는 세포 분석을 위해 선택 GFP 필터 (450-490 nm 여기, 515-586 nm 방출) 또는 Cy3 필터 (540-552 nm 여기, > 590 nm 방출) GFP 또는 mCherry 융합 단백질, 각각, 100 X 또는 63 X 기름 침수를 사용 하 여 목적입니다.
  4. 유사한 형광 신호, 단백질 식의 유사한 수준을 반영 하는 셀에 대 한 검색. 형광 측정에 셀 가변성을 감소 시키기 위하여 너무 약하거나 너무 강한 표현 된 셀을 하지 마십시오.
  5. 레이저 입력된 전원 적정
    1. 780 nm 적외선 레이저 confocal 현미경에 부착 된
      1. 소프트웨어 표 백제 함수를 사용 하 여 오일 목표 통해 단일 레이저 스캔 (해상도 512 x 512 픽셀, 확대/축소 X1, 표백 지역 50 x 4 픽셀, 12.8 µs 픽셀 유지 시간, 반복 x1)에 대 한 노출 셀 핵 안쪽에 선형 궤도 대상 (100 X / 1.3 없음).
      2. 다른 설정을 변경 하지 않고 5% (제조 업체에 의해 레이저 현미경 시스템에 내장 된 소프트웨어/하드웨어를 사용 하 여) 레이저 전송 비율을 조정 합니다.
      3. 셀 분야의 중심에 배치 합니다. 관심 (ROI) 도구의 지역 고 마우스를 사용 하 여 핵에서 선이나 상자 (약 50 x 4 픽셀)을 그릴 고 DNA 손상을 유도 하 "표 백제" 버튼을 클릭 합니다.
        참고: 이후 조사 단계에서 "표백" 증가 되어야 한다 40%를 5% 단위로 또는 100% 필요한 경우.
      4. 800 nm 적외선 레이저 피 형광 현미경에 부착 된
      5. 통해 입력된 전력 제어는 (63 X 1.4 / 없음) 단계 대비 기름 침수 편광 필터의 동력된 회전 하 여 빔 경로에 도입 목적과 컴퓨터 제어 전동된 회전 무대32,39 에 장착 , 58.
      6. 편광 각도 (°)를 조정 하 고 측정 현미경, 레이저 파워 미터를 사용 하 여 입력 입력된 전력 (mW). 입력된 파워에 5-10 mW 단위로 20 mW-155 mW에서 제공 하는 편광판 각도 결정 합니다.
      7. 20 mW 입력된 전원에 해당 하는 편광판 각도 설정 합니다.
        참고: 우리의 레이저 시스템에 대 한 편광 각도 40 °, 입력된 전원 이면 65 mW. 5-10 mW 단위로 입력된 파워를 증가.
  6. 살아있는 세포 분석을 위한 단계 6.1 및 6.3로 이동 합니다. 면역 형광 검출 생 단백질 또는 수정에 대 한 섹션 5로 진행 합니다. 분석, 후 단계 4.7 레이저 전력의 적정 추가로 이동 합니다. 상위 요소 요구 사항 분석, 섹션 7로 이동 합니다.
    참고: BER 및 NHEJ 요인의 채용은 (몇 분) 이내 급속 및 과도 (< ~ 30 분-1 시간 요소와 < ~ 4 h 게시물에 따라 손상 유도, 각각). 대조적으로, HR 요소 Rad51 및 cohesin의 채용 ~ 30 분-1 시간에 감지 이며 그들은 배달 DNA 병 변44,,5051이상 8 h을 유지 하는 경향이 있다. 따라서, 그것은 다른 시간 포인트 게시물 다른 수리 요인에 대 한 조사를 검토 하는 데 필요한입니다.
  7. 단위로 원하는 (즉, 780 NIR 레이저에 대 한 5% 및 800 NIR에 대 한 5-10 mW) 단계 4.4 에서처럼 입력된 파워를 증가 하 고 피크 (100% 셀 표시의 임계값 (손상 된 세포 쇼 채용의 50%)를 결정 하는 세포의 새로운 세트에 4.5 4.7 단계 반복 모집) 각 단백질에 대 한.

5. 면역 형광 염색

참고: 공유 단백질 수정, 파 (복잡 한 손상 마커) H2AX 인 산화 (γH2AX) 등의 검색을 위한 (DSB 표식), cyclobutane pyrimidine 이합체 뿐만 아니라 (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) 및 8-oxoguanine (8-oxoG) (가교 및 베이스 손상 마커, 각각), 셀 고정 되어야 하며 특정 항 체와 스테인드. 또한, 그것은 최고의 태그 붙일 재조합 단백질 재조합 융합 단백질의 overexpression에 의해 유도 된 아티팩트를 구별 하는 생 단백질의 항 체 검출에 의해 얻은 결과 확인 하.

  1. 4 %paraformaldehyde / 1 X PBS 실시간에 10 분의 1.5 mL (단계 1.1 참조) 문화 미디어 대체 하 여 다른 시간 지점에서 세포 손상 유도 (4.5 단계) 요인에 따라 후 수정
    주의: Paraformaldehyde 연기 독성이 고 통풍이 증기 두건에서 모든 작업을 할 수 있습니다.
  2. 4 %paraformaldehyde / PBS를 제거 하 고 실시간에 0.5% 세제/PBS 10 분의 1 mL을 추가
  3. 두 번, 5 분에 대 한 PBS의 2 mL와 0.5% 세제/PBS와 린스 세포를 제거 하 고 차단 솔루션의 2 mL에 셀을 품 어 (10% 송아지 혈 청, 1 %BSA / PBS) 실시간에서 1 h
  4. 차단 솔루션을 제거 하 고 셀, PBS의 2 개 mL를 추가 3%의 250 µ L 1 차적인 항 체 솔루션으로 PBS를 대체 BSA/PBS 하룻밤에 4 ° C 또는 실시간 사용에서 1 h는 1: 200-1: 500 희석 (일반 농도 약 1 µ g/mL, 경험적으로 결정) 항 체에 대 한 다른 DNA 손상 마커 (예를 들어, γH2AX/53BP1 (DSB);에 대 한 특정 구 (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); 일일/6-4PP (가교 손상); 8-oxoG/DNA glycosylases (예를 들어, NTH1) (베이스 손상); 파 (높은 복용량 복잡 한 손상)).
  5. 항 체 솔루션을 제거 하 고 린스 2 mL PBS의 5 분 동안 두 번, 제거 PBS, 250 µ L 0.1 %2 차 항 체로 3%에서 품 어 실시간에 어둠 속에서 1 시간을 위한 BSA/PBS
  6. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 두 번 5 분에 대 한 PBS의 2 개 mL를 추가 이미징 6.1 및 6.2 단계에서 4 ° C에서 1.5-2 mL PBS에에서 셀을 계속.

6. 양적 형광 분석 Immunostained 또는 라이브 셀의

  1. 스테인드 또는 라이브 셀의 이미지를 캡처 (n > 10) 방사선 조사에 사용 하는 현미경을 사용 하 여. 피-형광 현미경 시스템 1,344 x 1024 픽셀의 해상도 사용 하 여 고 TIFF 16 비트 파일로 이미지를 저장 합니다. Confocal 현미경 사용 1 X 확대; 아르곤 레이저 GFP/FITC, 594 HeNe 레이저 Cy3/mCherry; 512 x 512 또는 1024 x 1024 픽셀 해상도; 스캔 속도 5, 번호: 빠른 스캔 또는 신호 대 잡음 비를 개선 하기 위해 여러 검사를 통해 평균을 위한 2 + 1.
  2. 픽셀 강도 측정 하도록 설계 되어 프로그램 이미지 분석을 사용 합니다.
    1. 볼륨 사각형 도구를 사용 하 여 개별 셀 이미지에 손상 사이트는 ROI를 그릴. 같은 크기 ROI를 사용 하 여 nucleoplasm 옆에, 하지만 피해 사이트와 겹치는 하지에 배경 형광 신호를 측정. 이것은 비 confocal 현미경 시스템와 관련 된 photobleaching의 정규화에 대 한 중요입니다.
    2. 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 형광 신호를 측정, "볼륨 분석 보고서" 도구 상자에서를 클릭 합니다. 새 창이 나타납니다. "디스플레이를 데이터" 섹션에서 "이름"와 "밀도" 상자만을 선택 합니다. "완료" 측정 시각화를 클릭 합니다.
    3. 수출 대상에 대 한 필드 구분 기호 및 "파일"에 대 한 볼륨 보고서 창 및 선택 "탭 (엑셀 서식)"의 하단에서 찾을 테이블 아이콘을 클릭 하 여 스프레드시트 프로그램에 값을 내보냅니다.
    4. 상대 신호를 컨트롤에 배경 지역 (2 열)는 nucleoplasm에서 정규화 1 빼기 형광 강도 의해 피해 사이트 (열 1)에 분할을 스프레드시트 프로그램, 사용 합니다.
  3. Confocal 현미경을 사용 하 여 실시간 양적 형광 시간 과정 분석
    1. 붙일 태그가 단백질-긍정적인 세포 단계 4.3에서 현미경을 사용 하 여 식별 합니다.
    2. 섹션 4에서 손상 유도 후 시간 경과 형광 이미징 손상 전과 다른 시간 지점에서 수행 합니다. 먼저 그릴 (손상 유도)에 대 한 투자 수익 표 백제 다음 선택은 "취득 > 시계열" 하위 메뉴, 30 20, 및 "주기 지연" "숫자"를 설정 s, "첫 번째 스캔 후 한 번 표 백제"를 선택 하 고 "B 시작"을 클릭. 이 경우에, 첫 번째 이미지는 손상 유도, 19 이미지 인수 뒤에 30 s 간격에 직전 획득 됩니다. 간격 ("주기 지연") 연구의 목적에 따라 변경할 수 있습니다.
    3. 이미지 수집 완료 되 면 "의미"를 클릭 하 고 피해 지역에 투자 수익을 그립니다. "테이블 표시" 선택한 ROIs 내 강도 나열 하는 테이블을 클릭 합니다. 손상, 전에 동일한 영역의 강도 의해 다른 시간 지점에서 피해 사이트의 형광 강도 나누어 데이터를 표준화 하 고 1을 뺍니다.

7. 작은 Interfering RNA (siRNA) Transfection

참고: 대상 단백질의 고갈 관찰된 단백질 채용 사이트 (제 4) 손상에 대 한 업스트림 요소 요구의 윤곽을 그리 다 수 있는 효과적인 방법입니다. 또한, 전략은 면역 형광 검출에 사용 되는 항 체의 특이성을 해결 하는 가장 좋은 방법은 (섹션 5 참조).

  1. 주 1: 6-8 x 104 HeLa 세포에 각 잘, 제어 siRNA transfection과 PARP1 siRNA 한 0.5 mL 문화 미디어에 시드 2 웰 스 24 잘 플레이트에 HeLa 세포의 준비 (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. 주 2: 세포는 약 40-50% 합칠 확인 합니다. SiRNA transfection의 첫 라운드를 수행: 혈 청 무료 문화 미디어, 25 µ L로 희석 5 pmol siRNA 3 µ L 지질 튜브에 transfection 시 약을 기반으로 추가 하 고 부드럽게, 혼합 하 고, 실시간에 5-10 분 동안 품 어
  3. 0.5 mL 신선한 문화 미디어와 셀을 한 번 헹 구 고 0.5 mL 신선한 문화 미디어 (단계 1.1 참조)에 셀을 계속.
  4. 셀, RNA 지질 단지를 추가 하 고 요리를 앞뒤로 기울이기로 부드럽게 혼합. 2.1 단계와 마찬가지로 인큐베이터에서 다시 세포를 넣어.
  5. Transfection 믹스를 발음 하 고 6 h 후 0.5 mL 신선한 문화 미디어 (단계 1.1)를 추가 합니다.
  6. 제 3 일: siRNA transfections (단계 7.2 참조)의 두 번째 라운드를 수행 합니다. 2.3 단계에서 설명한 대로 다음, 35mm gridded coverslip 그릇에 60-100% 씨.
  7. 제 5 일: 레이저 microirradiation 섹션 4에 의해 결정으로 관심의 요인의 최대 모집에 대 한 최적의 레이저 전원 상태를 사용 하 여 계속 합니다. 일반적으로, 효율적인 고갈 HeLa 세포의 약 60-90%에서 관찰할 수 있습니다.
    참고: 대체 및 보완 접근, 억제제, 사용 가능한 경우 사용할 수 있습니다 관심32,44의 요인의 기능을 억제 하기 위해. DDR 신호 억제의 효과 분석 하기 위한 추가 20 µ M PARP 억제제, 1 µ M 파 glycohydrolase (PARG) 억제제, 또는 10 µ M DNA 의존 단백질 키 니 아 제 촉매 소 단위 (DNA-PKcs) 억제제와 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 10 µ M ATM 억제제에는 손상 유도 전에 1 시간을 요리. DMSO만 셀을 추가할 컨트롤.

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결과

안정적으로 표현 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP PtK2 셀을 사용 하 여, 레이저 입력된 전원 적정 실시 되었다 그들의 모집 (그림 1)32에 대 한 최적의 상태를 확인 하려면.

높은 입력 파워 레이저 피해 사이트에서 구체적으로 인식 하는 베이스 손상 GFP NTH1 DNA glycosylase 뿐만 아니라 일일 (가교 손상 자외선 (UV) 손상에 의해 일반적으로 생성 된)의 중요 한 클러스터링 관찰 되었다. 또한, 높은 XRCC1 및 CtIP 신호 스트랜드 나누기의 증가 수를 반영 하 고이 조건 (그림 2A) 복잡 한 DNA 손상 유도 된다 시연, 관찰 되었다. 다른 DNA glycosylases 형광 단백질을 융합 (예를 들어, GFP nei endonuclease ...

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토론

레이저 microirradiation DDR 연구에 대 한 사용의 장점은 다음과 같습니다.

1. 그것은 가능한 다양 한 종류를 유도 하 고 양의 DNA가 복잡 한 DNA 손상, 간단한 가닥 나누기에서 손상 감지 다른 수리 DNA에서 파손 사이트 레이저 조사 매개 변수를 조정 하 여. ( 그림 3)에서 트랜스 효과 평가 하기 위해 여러 번 같은 셀 핵에에서 피해를 입힐 수 이기도 합니다.

2. 중요 한 것은, 피해 사이트와 다른 핵에서 발생 하는 2 차 이벤트에 이벤트 쉽게 구분할 수 있습니다.

3. 그것은 포함 하 여, 단일 세포 수준에서 손상에 대 한 응답에 붙일 태그가 단백질 역동성의 고해상도 실시간 측정 수행 가능 하지만에 국한 되지 않음: 포스터 공명 에너지 전송 (무서 워), 형광 일생 화상 진 찰 ( ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 GFP NTH1 식 플라스 미드에 대 한 토 호 쿠 대학, 일본에서 야 스도 아키라 박사 및 박사 에로스 Lazzerini Denchi 스 크립 스 연구소, 라 Jolla, 캘리포니아 TRF2 YFP EGFP 53BP11220-1711 식 플라스 미드에 대 한 감사합니다. 이 작품은 공군 사무실의 과학적 연구 (FA9550-04-1-0101)와 베크만 레이저 연구소 Inc. 재단 (M.W.B), 과학 (B.A.S), 하 고 NSF MCB 1615701 CRCC 국립 아카데미에서 포드 기초 장학금에 의해 지원 되었다 음악원-17-426665 (K. Y.)에.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ti:사파이어 NIR 펄스 펨토초 레이저 Mira-900Coherent Inc.Mira 900
도립 현미경 Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NA 대물렌즈 ZeissAPOCHROMAT Ph3 
컴팩트 회전 스테이지 Newport CorpPR50PP
온도 컨트롤러WarnerTC-344B
난방 시스템Ibidi 10918
가스 배양 시스템Ibidi 11920
레이저 출력 및 에너지 미터 (RoHS)CoherentFieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 디지털 CCD 카메라HamamatsuC10600
LSM 510 META 레이저 스캐닝 현미경Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm 그리드 접시 MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 신장 상피 세포ATCCCCL 56 
HeLa 세포ATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
CO2-독립 매체 Life Technologies18045-088
고급 MEM -글루타민, 4% FBSLife Technologies12492-013
Fisher Scientific15140122
L-글루타민Fisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Thymidine   SIGMAT9250
무 세럼 미디어        (Opti-MEM I 저감 혈청 배지)Fisher Scientific11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (mouse)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (rabbit)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (rabbit)Abcamab70163
Anti-PAR polymers (mouse)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (토끼)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (마우스)Novus Biological NB100-56506
안티 6-4PP (마우스)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (토끼)                                        (응집체 검출용)Yokomori (KY) 실험실
Anti-Rad51 (토끼)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (마우스)  Novus BiologicalsNB100-102
8-옥시구아닌 트레비젠, Inc.
안티-PARP1  (토끼)                                       KY labref 43
 에서 생성됨; 안티-hCAPG(토끼)                                      (응축 감지용)KY 연구소ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
당나귀 안티-마우스 Alexa Fluor 488IgG Thermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA 형질주입 시약Qiagen301705
Lipofectamine 2000 형질주입 시약Thermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 안정 세포주       KY labref 49 에서 생성됨;
ref 54에서 생성된GFP-NEIL2 안정 세포주
ref 32에서 생성된GFP-NTH1 안정 세포주
KY labGFP-SMC1 플라스미드
KY labGFP-Ku 플라스미드
Anti-MDC1 (토끼)  Novus BiologicalsNB100– 395
Anti-gH2AX (토끼)  밀리포어07– 164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 안정 세포주Berns 연구실ref 32
TRF2-YFP PtK2 안정 세포주가 Berns 연구실ref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
PARG 억제제Trevigen4680-096-03
DNA– PKcs 억제제  NU7026 SigmaN1537
ATM 억제제 KU55933  Calbiochem118500
올라파립 Apexbio TechnologyA4154
파라포름알데히드 ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS100503-916 (EA)
Quantity One 1-D 분석 소프트웨어 버전 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC 이미지 분석 프로그램
엑셀마이크로소프트스프레드시트 프로그램
Triton X100Fisher ScientificBP151-500세제
칼슘과 마그네슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 10XFisher Scientific142001661X로 희석 
L페니실린/스트렙토마이신이 보충된 에서 생성에서 생성 KY lab KY lab 에서 생성된에서 생성된가 에서 생성됨 에서 생성됨

참고문헌

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27(2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68(2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548(2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219(2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460(2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

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