인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

요약

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

초록

Chemotaxis는 특정 화학 그라데이션¹따라 마이그레이션. 발산은 해부학과 시간적 특이성²세포질 매매 홍보 혈 cytokines. Chemotaxis는 세포의 중요 한 기능 그리고 양이 많게 될 수 있는 다른 면역 세포에 생체 외평가. 이 원고 chemotaxis의 평가 허용 하는 방법에 설명 합니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, 셀 라인 및 기본 셀을 포함 하 여 다양 한 셀 형식에 대 한. 생체 외에서플레이트 기반 포맷 허용 몇 가지 조건 동시에 비교 실시간, 1-4 헤 체 외에서 분석 결과 조건 주 작동 근 그리고 길 항 근, 소개를 조작할 수 있습니다 내에서 완료 될 수 있습니다 그리고 뿐만 아니라 chemokinesis에서 chemotaxis 차별화는 임의 운동. Vivo에서 인신 매매 평가, 대 한 면역 세포는 여러 형광 염료로 표시 고 입양 전송에 사용 될 수 있습니다. 셀의 차동 라벨 혼합된 셀 인구 함으로써 분산 감소 하 고 적절 하 게 구동된 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동일한 동물에 소개 될 수 있습니다. 1 시간 만큼 적게 발생 하는 림프 조직으로 마이그레이션 하 고 여러 조직 구획을 샘플링할 수 있다. Cytometry 조직 수확에 따라 여러 종류의 세포 철새 패턴의 급속 한 양적 분석 할 수 있습니다.

서론

강력한 면역에는 부상, 감염에 적절 하 게 응답 하 고 생성 하는 self-tolerance 세포 유형의 수많은 복잡 한 시간적 및 공간 조정을 필요 합니다. 여러 다스 chemokine 수용 체와 그들의 해당 ligands 발견 되었습니다 하 고 특정 셀에 의해 특징이 제공 분자 기계 장치는 특정 시간에 특정 조직으로 지시 될 수 있다. 따라서, 공부 chemotaxis 및 마이그레이션 면역학 연구의 필수적인 구성 요소 이다. 실제로, 설명 체 외에서 분석 결과 가속 C C 19와 21 발산³으로 T-세포의 chemotaxis 혈 공동 인자를 식별 하기 위해 심사 도구로 사용 최근 했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 면역 세포 chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 정량적 평가 허용 하는.

Boyden (셀 이동과 침략) 챔버 분석 결과 셀 마이그레이션^4,5을 평가 하기 위한, 재현, 저렴 하 고 빠른 방법입니다. 표준 분석 결과에서 상단 챔버 셀, 시드 고 낮은 챔버로 셀 이동에서 다공성 삽입으로 구분 됩니다. 원하는 시간에 ....

프로토콜

모든 절차는 록펠러 대학에 의해 승인 되었다 ' 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 모든 동물은 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.

1. 체 외에서 Chemotaxis

1. 문화 THP-1 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 4-(2-hydroxyethyl)-1 보충 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640)에 ⁶- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES; 25 m m) (미디어 완료), 0.5-1.0 x 10 ⁶ 셀/mL 사이 밀도 유지.
2. 에는 35 m m 세포 배양 접시, 30 분에 대 한 calcein acetoxymethyl (calcein-오전; 2.5 µ M) 또는 37 ° C에서 완전 한 미디어에 적합 한 형광 성 염료 다른 조건 당 3.5 x 10 라벨 ⁵ THP-1 셀
   참고: 염료 세포 막 투과성 및 라이브 셀 라벨와 호환 되어야 합니다.
3. 사전 따뜻한 플레이트 리더를 37 ° c.
   참고: 뿐만 아니라 온도 제어, 하단-읽기 기능이입니다 또한 필요. 마이그레이션 단계 1.10.2 정량화에 ....

결과

Calcein 오전 염료를 사용 하는 경우 셀의 시각적 검사 레이블 통풍 관 (그림 1)를 확인 합니다. 자동화 된 형광 판독 시간이 지남에 삽입의 아래쪽에 셀 교통으로 마이그레이션을 추적 합니다. 이러한 데이터는 명확 하 게 혈 청 (그림 2A)에 의해이 응답의 확대 뿐만 아니라 MCP-1으로 셀 이동의 유도 표시. 철새 자극의 강도 따라, 신호 증가 전에 적어도 15 분의 지연이 있다. 형광 신호 피크 하 고 점차적으로 거부할 수 있습니다. 이 셀 셀 위 약 실에서 마이그레이션 보다 더 빠른 속도로 낮은 챔버로 솔루션으로 통과 삽입의 밑바닥에 고착 하는 셀의 수에 있는 순수한 감소를 나타냅니다. 더 강한 철새 자극에 일반적으로 결과) 형광 값;에 상승의 이전 발병 형광; 증가의 b) 빠른 속도 그리고 c) 높은 피크 형광 값. 거꾸로 형광 현미경 검사 법에 의해.......

토론

면역 세포 이동의 정량화는 간단한를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 신속한 분석 실험 체 외에서 그리고 vivo에서모두. 혈 청에 의해 인간 monocytes MCP-1 그라디언트 및 확대에 대 한 응답에서의 chemotaxis 생체 외에서 설명합니다. Vivo에서, 기증자 murine splenocytes 차동 표시 했다 고 입양 전송 다음 받는 사람 동물에서 발견 했다.

몇 시간 포인트 샘플링의 장점이 플레이트 리더를 사용 하 여 (자주 매일 30 s) 및 셀 자동화 마이그레이션의 정량. 이 평가 및 개인 우물의 수동 계산의 더 노동 집약적인 방법 피하에 대 한 단일 시간 지점을 선택 하는 필요성을 obviates. 또한,이 방법은 현미경 검사 법에 의해 수집 될 수 있다 보다 더 동적 정보를 제공 합니다. 분석 하는 동안 그것는 셀 아래쪽 챔버에 삽입을 떨어질 것 이다 형광 강도에 기여 하지 것 이다 유.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
소 태아 혈청	ATCC	30-2020
세포 배양 플라스크	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	여기: 485nm, 방출: 520nm
세포 문화 접시	Corning	1007
24 웰 플레이트	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin 인서트	Corning	CB354597
15 mL 원뿔형 튜브	Corning	352097
소 혈청 알부민	세포 신호 기술	9998S
인간 재조합 MCP-1	Peprotech	300-04
성인 소 혈청	시그마	B9433
HBSS; 페놀 레드 없음	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e 플레이트 리더	분자 장치
올림푸스 IX71 도립 형광 현미경	올림푸스 Isothesia
	Henry Schein 동물 건강	11695-6776-2	이소플루오란 마취
셀 스트레이너 40um 나일론	팔콘 코닝	352340
ACK 용해 버퍼	품질 생물학적	118-156-101
CellTracker 오렌지 CMTMR 염료	Thermo Fisher Scientific	C2927	여기: 541nm, 방출: 565nm
CellTracker Green CMFDA 염료	Thermo Fisher Scientific	C2925	여기: 485nm, 방출: 520nm
5ml 주사기	BD 주사기	309646
1ml TB 주사기	BD 주사기	309625
THP-1 세포주	ATCC	TIB-202
브릴리언트 바이올렛 421 안티 마우스 CD3 항체	Biolegend	100228	여기: 405nm, 방출: 421nm
브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD19 항체	Biolegend	115540	여기: 405nm, 방출: 603nm
96웰 원형 바닥판	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		유세포 분석기

칼슘과 마그네슘이 함유된