인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

요약

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

초록

Chemotaxis는 특정 화학 그라데이션¹따라 마이그레이션. 발산은 해부학과 시간적 특이성²세포질 매매 홍보 혈 cytokines. Chemotaxis는 세포의 중요 한 기능 그리고 양이 많게 될 수 있는 다른 면역 세포에 생체 외평가. 이 원고 chemotaxis의 평가 허용 하는 방법에 설명 합니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, 셀 라인 및 기본 셀을 포함 하 여 다양 한 셀 형식에 대 한. 생체 외에서플레이트 기반 포맷 허용 몇 가지 조건 동시에 비교 실시간, 1-4 헤 체 외에서 분석 결과 조건 주 작동 근 그리고 길 항 근, 소개를 조작할 수 있습니다 내에서 완료 될 수 있습니다 그리고 뿐만 아니라 chemokinesis에서 chemotaxis 차별화는 임의 운동. Vivo에서 인신 매매 평가, 대 한 면역 세포는 여러 형광 염료로 표시 고 입양 전송에 사용 될 수 있습니다. 셀의 차동 라벨 혼합된 셀 인구 함으로써 분산 감소 하 고 적절 하 게 구동된 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동일한 동물에 소개 될 수 있습니다. 1 시간 만큼 적게 발생 하는 림프 조직으로 마이그레이션 하 고 여러 조직 구획을 샘플링할 수 있다. Cytometry 조직 수확에 따라 여러 종류의 세포 철새 패턴의 급속 한 양적 분석 할 수 있습니다.

서론

강력한 면역에는 부상, 감염에 적절 하 게 응답 하 고 생성 하는 self-tolerance 세포 유형의 수많은 복잡 한 시간적 및 공간 조정을 필요 합니다. 여러 다스 chemokine 수용 체와 그들의 해당 ligands 발견 되었습니다 하 고 특정 셀에 의해 특징이 제공 분자 기계 장치는 특정 시간에 특정 조직으로 지시 될 수 있다. 따라서, 공부 chemotaxis 및 마이그레이션 면역학 연구의 필수적인 구성 요소 이다. 실제로, 설명 체 외에서 분석 결과 가속 C C 19와 21 발산³으로 T-세포의 chemotaxis 혈 공동 인자를 식별 하기 위해 심사 도구로 사용 최근 했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 면역 세포 chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 정량적 평가 허용 하는.

Boyden (셀 이동과 침략) 챔버 분석 결과 셀 마이그레이션^4,5을 평가 하기 위한, 재현, 저렴 하 고 빠른 방법입니다. 표준 분석 결과에서 상단 챔버 셀, 시드 고 낮은 챔버로 셀 이동에서 다공성 삽입으로 구분 됩니다. 원하는 시간에 셀 삽입의 밑면 마이그레이션한 고정 고 가벼운 현미경 검사 법에 의해 정량에 대 한 스테인드 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 측정 동적 데이터 수집 하는 걸로 단일 끝점으로 데이터 수집을 제한 하 고 분석을 위한 최적의 시간 점을 결정 광범위 한 최적화를 요구할 수 있습니다. 여기, 여러 적응 chemotaxis에서 생체 외에서의 실시간, 양적 및 다중화 측정을 허용 하는 설명 합니다.

Vivo에서 학문에 대 한 기능 끝점 사용 됩니다, 즉 주어진된 조직에 세포의 특정 축적. 사전 분류 기증자 세포 입양 전송을 통해 받는 사람 동물에 소개 된다. 이러한 기증자 세포 이후에 받는 조직 수확 후 cytometry로 식별할 수 있습니다. 또한 다른 종류의 세포는 단일 받는 사람 동물 내에서 인신 매매의 결정에 대 한 수 있도록 공동 상표 전략이 이다. 이 방법은 셀 주입, 및 생리 간 동물 다양성에 대 한 계정에서 동물 간 편차를 제거합니다.

프로토콜

모든 절차는 록펠러 대학에 의해 승인 되었다 ' 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 모든 동물은 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.

1. 체 외에서 Chemotaxis

1. 문화 THP-1 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 4-(2-hydroxyethyl)-1 보충 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640)에 ⁶- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES; 25 m m) (미디어 완료), 0.5-1.0 x 10 ⁶ 셀/mL 사이 밀도 유지.
2. 에는 35 m m 세포 배양 접시, 30 분에 대 한 calcein acetoxymethyl (calcein-오전; 2.5 µ M) 또는 37 ° C에서 완전 한 미디어에 적합 한 형광 성 염료 다른 조건 당 3.5 x 10 라벨 ⁵ THP-1 셀
   참고: 염료 세포 막 투과성 및 라이브 셀 라벨와 호환 되어야 합니다.
3. 사전 따뜻한 플레이트 리더를 37 ° c.
   참고: 뿐만 아니라 온도 제어, 하단-읽기 기능이입니다 또한 필요. 마이그레이션 단계 1.10.2 정량화에 대 한 플레이트 리더를 대안에 대 한 참조 셀.
4. 셀 라벨는 하는 동안 준비 시험 접시와 낮은 챔버.
   1. 사용 24-잘 조직 배양 플레이트, 잘 당 한 상태. 3 중에 수행 하는 각 조건.
   2. 행 크의 추가 750 µ L ' s Buffered 소금물 (HBSS) 24-잘 접시에 25 mM HEPES 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼. 이 기저 제어 상태 역할을 합니다. 비교 조건, 750 µ L에서 아래쪽 챔버에 전체 볼륨을 항상 유지에 대 한
      1. 다른 사용 우물.
         참고:이 예제에서는 인간 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 역할을 chemotaxis ⁷에 대 한 긍정적인 제어 합니다.
      2. 어셈블 시 혼합물 25 mm HEPES HBSS, BSA (0.1%), 및 MCP-1을 결합 하 여
         (75 ng/mL). 성인 소 혈 청을 사용 하 여 (2.7 %v / v) 추가 긍정적인 컨트롤로 MCP-1.
         참고: Chemokine 및 chemokine 농도 연구에서 혈 축에 따라 달라 집니다. 동결 건조 된 MCP-1 최종 농도 50 μ g/mL의 재고 솔루션 BSA (0.1%)와 증류수에 resuspended 이다. 이 작업 솔루션 10 μ g/mL의 물에 희석 수 있습니다. 더 낮은 약 실에이 솔루션의 5.6 μ 추가.
   3. 아래쪽 챔버의 구성이 완료 된 후 삽입 탭 플레이트의 노치와 정렬 있도록 각 잘 다공성 삽입 장소.
      참고: 삽입에 대 한 적절 한 기 공 크기를 선택 하십시오. Monocytes, lymphocytes 3 μ m의 기 공 크기를 잘 수행합니다. 일부 세포 유형 및 chemokine 시스템은 최적의 마이그레이션에 대 한 매트릭스 코팅 표면이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 측정 THP 1 monocyte chemotaxis MCP-1으로, fibronectin 또는 콜라겐 코팅 삽입은 것이 좋습니다. 정량에 대 한 플레이트 리더, 삽입 있어야 빛 impermeant 코팅, 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 레이트, 등 비 마이그레이션의 탐지를 방지 하기 위해 상단에 셀 챔버 ⁸.
5. Calcein 오전와 30 분에 대 한 셀을 잠복기 후 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 2 분에 대 한 1000 x g에서 원심 분리기 세포 육안으로 직접 검사 calcein-오전 ( 그림 1)의 확인을 셀.
6. 신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기를 사용 하 여 제거 합니다. 혈 청 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m와 보완에 레이블된 셀을 씻어. 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.
7. Resuspend 셀 세럼 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m로 보완. 셀 및 셀 10 ⁶ 셀/mL x 1.0-1.5의 최종 농도에 볼륨 조정.
8. 삽입 (위 약 실)에 세포 현 탁 액의 분배 250 μ.
9. 모든 상단 챔버 채워 졌, 부드럽게 접시를 올리고 마이그레이션 및 탐지를 방해할 수 있는 공기 방울의 존재에 대 한 밑면을 검사 후. 거품을 제거 하려면 먼저 다음 다시 삽입 위치를 제거해 보십시오. 실패할 경우 27 G 니 들을 사용 하 여 거품을 찔린 다음 삽입 위치를.
10. 37 ° C에 미리 데워 진된 플레이트 리더에 접시를 놓습니다.
11. 취득 형광 읽기 1-3 분 간격 아래에서
    . Calcein 오전에 사용 하 여, 형광 흥분 및 방출 파장에서 설정 485 nm와 520 nm, 각각. 셀 유형 및 chemokine 시스템에 따라 chemotaxis 일반적으로 이상의 1-4 h ( 그림 2A) 발생 합니다.
    1. 연속 측정 하는 대신 485에는 거꾸로 형광 현미경 ( 그림 2B) 흥분 하 고 빛의 감지를 사용 하 우물 이미지 플레이트 리더를 사용 하 여 및 520 nm, 각각. 낮은 확대를 사용 하 여 삽입의 밑면의 대부분을 잡으려고. ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 ⁹ 이미지를 처리 하 여 셀을 계량.

2. Murine Lymphocytes 입양 전송

1. 기증자 세포의 준비
   1. Anesthetize 8-12 주-isoflurane 마 취 (1-3%)는 기화 기를 사용 하 여 오래 된 C57BL/6J 남성 기증자 쥐. 발가락-핀치에 의해 마 취의 적절 한 깊이 확인.
   2. 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 메스와 중간 절 개를 만들고 상단 왼쪽된 복 막 공간에서 비장을 찾습니다. 삭제할 모든 비장 고 완벽 한 미디어 (RPMI 10 %FBS 25mm HEPES 보충, 1 mL/비장) 얼음에 합니다. 잘린에 의해 마 취 기증자 동물을 안락사.
   3. 단일 셀 펜션과 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 완전 한 미디어 (1 mL /spleen)로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.
   4. 추가 4 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 버퍼 볼륨과 lyse 적혈구를 실 온에서 5 분 동안 품 어.
   5. 1000 x g 실 온에서 2 분 동안에 세포를 원심 고 상쾌한 삭제. 적혈구는 펠 릿에 남아, 경우 ACK 세포의 용 해 버퍼에서 resuspend, 실 온에서 5 분 동안 품 어, 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 상쾌한 삭제.
   6. Resuspend 2 5 10 ⁷ 셀/mL, x의 농도에 완전 한 미디어에 셀 다음 40 µ m 나일론 메쉬 셀 파편 제거를 통해 세포 현 탁 액을 변형.
   7. 레이블 1 형광 염료와 호환 10 ⁷ 셀/받는 사람 마우스 x 셀 생활과 그 5-chloromethylfluorescein diacetate (최종 농도 2 μ M) ¹⁰ 등 이후 고정 시 유지 될 것 이다 . 30 분 동안 37 ° C에서 품 어
      참고: 하나 이상의 세포 인구를 추적 하려면 추가 셀 인구와 다른 형광 성 염료를 사용 합니다. 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) 벤 조일와 기증자 세포의 부분을 표시 하는 예를 들어,) 아미노) tetramethylrhodamine (최종 농도 2 μ M) ¹¹.
   8. 추가 4 볼륨 HBSS 보충 25mm HEPES, 다음 2 분 및 폐기 상쾌한 1000 x g에서 원심 분리기. HBSS HEPES 25 m m 1 x 10 ⁸ 셀/mL의 최종 농도에 보충에 펠 릿을 resuspend.
      1. 하나 이상의 형광 염료를 사용 하는 경우 계속 주입 직전까지 분리 하는 세포 인구.
      2. 이후의 흐름 cytometry 보상 통 솔루션 (1 mL)을 각 색의 세포의 작은 약 수 (10 μ) 전송.
2. 림프 톨의 전송
   1. 8-12 주 Anesthetize-isoflurane (1-3%);는 기화 기를 사용 하 여의 오래 된 C57BL/6J 남성 받는 사람 마우스 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 동물에 수의 연 고를 적용 ' 건조 방지 하기 위해 s 눈.
   2. 짧게 소용돌이 기증자 세포 (1 s) 및 1 mL 주입 주사기 27 g, 바늘, 0.5에 해당 하는 경우 차동 레이블이 세포 인구를 결합.
      1. 이후의 흐름 cytometry 분석 통 솔루션 (1 mL) 혼합된 셀의 작은 약 수 (10 μ) 전송.
   3. 기증자 동물 발생 하기 쉬운 위치에 배치. 눈, 약간 내 다 눈알을 일으키는 등 피부에 가벼운 꼬리 압력 적용.
   4. Medially 바늘을 직접 하 고 각 받는 사람 마우스에 복고풍 orbitally 기증자 세포 현 탁 액의 100 µ L를 주입. 셀도 꼬리 정 맥을 통해 주입 할 수 있습니다.
   5. 는 점차적으로 주사 바늘을 철회 하 고 복구에 혼자 마우스를 놓습니다. 그것은 의식; 회복 될 때까지 동물을 모니터링 일단 완전히 복구 된 반환 동물 사회 주택.
3. 수집 및 분석
   1. 1 시간 후 anesthetize 한 기화 기를 사용 하 여 받는 사람 마우스 isoflurane 마 취 (1-3%)와 함께, 발가락-핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 비장 (또는 관심의 다른 조직) 수확 (2.1.2 단계.) 각 받는 사람 마우스와 완전 한 미디어 (1 mL/받는 사람)에 장소에서. 잘린에 의해 마 취 동물을 안락사.
      참고: 조직 수확 전에 더 긴 간격으로 적어도 24 h. 통해 조직 축적 증가
   2. 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액 및 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 완전 한 미디어로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.
   3. 추가 4 볼륨 ACK 세포의 버퍼링 하 고 실 온에서 5 분을 품 어. 실 온에서 2 분 동안 1000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 및 상쾌한 삭제.
   4. 얼룩에서 resuspend 셀 버퍼 (인산 염 버퍼 염 분 보충 1 %FBS). 셀 고 3 x 10 ⁷ 셀/mL의 최종 농도를 조정 합니다. 세포 현 탁 액의 100 µ L 하단 플레이트 라운드 96 잘 전송.
   5. Cytometry에 의해 분석을 위해 원하는 마커 (재료의 표 참조)에 대 한 얼룩 셀. 원하는 표시에 대 한 fluorophore 활용 된 항 체 (재료의 표 참조)를 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 4 ° C에서 품 어. 100 µ L를 추가 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.
   6. 200 µ L에 펠 릿을 resuspend 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.
   7. Resuspend 125 µ L 얼룩에 펠 릿 버퍼 및 표준 절차를 사용 하 여 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 수집.
      참고: 녹색 염료 488 nm 레이저에 의해 흥분 되 고 방출 505 530/30 dichroic 필터 감지. 주황색 염료는 561에 의해 흥분 및 방출 582/15의 dichroic 필터에 의해 검출 된다.
      1. 2.1.8.2 각 형광 성 염료에 대 한 보상에서 사용 저장 셀.
         참고: fluorophores 여기 및 라벨 염료의 방출 스펙트럼과 구슬 기반 보상을 사용 하 여 차선 보상 발생 합니다.
      2. 사용 하 여 단계 2.2.2.1에서에서 저장 된 입력된 셀의 비율을 정확 하 게 결정 경우 하나 이상의 레이블이 인구 ( 그림 3)를 사용 하 여 차동 입력된 셀을 표시. 레이블이 없는 셀 ( 그림 4)에 표시 된 계산의 비율에 따라 조직 특정 마이그레이션.

결과

Calcein 오전 염료를 사용 하는 경우 셀의 시각적 검사 레이블 통풍 관 (그림 1)를 확인 합니다. 자동화 된 형광 판독 시간이 지남에 삽입의 아래쪽에 셀 교통으로 마이그레이션을 추적 합니다. 이러한 데이터는 명확 하 게 혈 청 (그림 2A)에 의해이 응답의 확대 뿐만 아니라 MCP-1으로 셀 이동의 유도 표시. 철새 자극의 강도 따라, 신호 증가 전에 적어도 15 분의 지연이 있다. 형광 신호 피크 하 고 점차적으로 거부할 수 있습니다. 이 셀 셀 위 약 실에서 마이그레이션 보다 더 빠른 속도로 낮은 챔버로 솔루션으로 통과 삽입의 밑바닥에 고착 하는 셀의 수에 있는 순수한 감소를 나타냅니다. 더 강한 철새 자극에 일반적으로 결과) 형광 값;에 상승의 이전 발병 형광; 증가의 b) 빠른 속도 그리고 c) 높은 피크 형광 값. 거꾸로 형광 현미경 검사 법에 의해...

토론

면역 세포 이동의 정량화는 간단한를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 신속한 분석 실험 체 외에서 그리고 vivo에서모두. 혈 청에 의해 인간 monocytes MCP-1 그라디언트 및 확대에 대 한 응답에서의 chemotaxis 생체 외에서 설명합니다. Vivo에서, 기증자 murine splenocytes 차동 표시 했다 고 입양 전송 다음 받는 사람 동물에서 발견 했다.

몇 시간 포인트 샘플링의 장점이 플레이트 리더를 사용 하 여 (자주 매일 30 s) 및 셀 자동화 마이그레이션의 정량. 이 평가 및 개인 우물의 수동 계산의 더 노동 집약적인 방법 피하에 대 한 단일 시간 지점을 선택 하는 필요성을 obviates. 또한,이 방법은 현미경 검사 법에 의해 수집 될 수 있다 보다 더 동적 정보를 제공 합니다. 분석 하는 동안 그것는 셀 아래쪽 챔버에 삽입을 떨어질 것 이다 형광 강도에 기여 하지 것 이다 유...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
소 태아 혈청	ATCC	30-2020
세포 배양 플라스크	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	여기: 485nm, 방출: 520nm
세포 문화 접시	Corning	1007
24 웰 플레이트	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin 인서트	Corning	CB354597
15 mL 원뿔형 튜브	Corning	352097
소 혈청 알부민	세포 신호 기술	9998S
인간 재조합 MCP-1	Peprotech	300-04
성인 소 혈청	시그마	B9433
HBSS; 페놀 레드 없음	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e 플레이트 리더	분자 장치
올림푸스 IX71 도립 형광 현미경	올림푸스 Isothesia
	Henry Schein 동물 건강	11695-6776-2	이소플루오란 마취
셀 스트레이너 40um 나일론	팔콘 코닝	352340
ACK 용해 버퍼	품질 생물학적	118-156-101
CellTracker 오렌지 CMTMR 염료	Thermo Fisher Scientific	C2927	여기: 541nm, 방출: 565nm
CellTracker Green CMFDA 염료	Thermo Fisher Scientific	C2925	여기: 485nm, 방출: 520nm
5ml 주사기	BD 주사기	309646
1ml TB 주사기	BD 주사기	309625
THP-1 세포주	ATCC	TIB-202
브릴리언트 바이올렛 421 안티 마우스 CD3 항체	Biolegend	100228	여기: 405nm, 방출: 421nm
브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD19 항체	Biolegend	115540	여기: 405nm, 방출: 603nm
96웰 원형 바닥판	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		유세포 분석기