Myelinating oligodendrocytes는 급속 한 활동 전위 전파 및 신경 생존을 촉진합니다. 여기에 설명 된은 organotypic에 형광 단백질의 oligodendrocyte 특정 식에 대 한 프로토콜 후속 시간 경과 화상 진 찰과 뇌 조각입니다. 또한, 흠 없는 수 초를 시각화에 대 한 간단한 절차 제공 됩니다.
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방법 논문
시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상
이 논문에서
요약
초록
전기 절연 및 myelinating oligodendrocytes의 영양 지원에 의존 하는 신경. Oligodendrocytes의 중요성에도 불구 하 고 현재 뉴런, 공부 하는 데 사용 하는 고급 도구 oligodendrocyte 연구원 촬영 부분적으로 있다. 셀 형식-특정 바이러스 성 변환에 의해 얼룩 라이브 세포 기관이 역학을 공부 하는 유용한 접근 이다. 이 문서 변환 adeno 관련 바이러스 (AAV)의 transcriptional 통제 미토 콘 드 리아 타겟된 형광 단백질을 위한 유전자를 나르는 여 organotypic 뇌 조각에서 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아를 시각화에 대 한 프로토콜 설명 myelin 기본적인 단백질 발기인입니다. Organotypic 코로나 마우스 뇌 조각을 만들기 위한 프로토콜을 포함 합니다. 다음에 미토 콘 드리 아의 시간 경과 영상에 대 한 절차는 다음과 같습니다. 이러한 메서드는 다른 세포로 옮겨질 수 있다 그리고 세포 myelin 칼 집에서 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다. 마지막으로, 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)에 의해 생활 조각에 흠 없는 myelin의 시각화에 대 한 쉽게 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 코어 불필요 한 장비를 필요 하며 라이브 이미징 동안 myelin 칼 집을 식별 하려면 유용할 수 있습니다.
서론
뇌의 백색 질은 신경 세포 축 삭은 수 초, oligodendrocytes에 의해 형성 된 특수 확장된 원형질 막에에서 싸여 구성 되어있습니다. Myelin는 신속 하 고 안정적인 활동 전위 전파 및 myelinated 축 삭의 장기 생존을 위한 필요 그리고 myelin의 손실 신경 장애를 일으킬 수 있습니다. 그들의 중요성에도 불구 하 고 oligodendrocytes의 속성은 덜 알려진 비교 신경와 이다. 따라서, 적은 도구 oligodendrocytes 공부에 대 한 개발 되었습니다.
라이브 셀 세포의 영상 같은 미토 콘 드리 아, endoplasmatic 그물 (응급실) 또는 다른 기공을 구조 유용할 수 있습니다 시간이 지남에 세포에서 동적인 변화를 공부 하. 전통적으로, 생활 oligodendrocytes의 이미징 monocultures1,2에서 수행 되었습니다. 그러나, 단에 oligodendrocytes 소형 myelin, 표시 되지 않습니다 그리고 organotypic 또는 급성 뇌 조각 있을 수 있습니다, 따라서, 더 나은 옵션 지역화 및 세포의 움직임을 공부 하는 경우. 작은 세포 myelin 칼 집에 있는 단백질의 지역화는 myelinated 축 삭과 주변 myelin 칼 집 사이 짧은 거리 때문에 전하실 수 있습니다. 따라서, 가벼운 현미경 immunostaining 절차 혼자 myelinated 축 삭에 myelin 칼 집에 세포 사이 차별을 공간 해상도 있지 않습니다. 이 셀 형식 관련 발기인에 의해 구동 세포 기관이 대상 형광 단백질을 위한 유전자와 바이러스 성 변환에 의해 해결 될 수 있습니다. 이점은 셀 및 스파스 식 세포 기관이 현지화 및 역학의 정확한 평가 가능 하 게 있다. 유전자 변형 동물 같은 한 세포 기관이 대상 셀 특정 식3을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 생산 및 유전자 변형 동물의 유지 보수 비용이 이며 일반적으로 바이러스 성 방법으로 얻을 수 있는 스파스 식 제공 하지 않습니다.
설명 하는 방법을 여기 미토 콘 드 리아-타겟 형광 성 단백질 (dsred 또는 녹색 형광 단백질, GFP)와 oligodendrocytes (MBP-미토-dsred 또는 MBP-미토-GFP) 시각화를 myelin 기본적인 단백질 발기인에 의해 구동의 바이러스 성 변환 사용 organotypic에 있는 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아 두뇌 조각. 또한, 다른 형광 단백질 (GFP 미토-dsred 함께 사용 또는 tdtomato 미토 GFP를 사용한) 세포질에서의 표현 myelin 칼 집의 세포질 구획을 포함 하 여 세포 형태학의 시각화를 가능 하 게 하는 데 사용 됩니다. 프로토콜은 organotypic 뇌 조각 (드 Simoni와 유, 20064,5설명 하는 프로토콜의 수정된 버전)를 만들기 위한 절차를 포함 됩니다. 우리는 다음 미토 콘 드 리아 운동 공부 시간 경과 이미징 절차를 설명 합니다. 이 절차는 영상 매체, 영상 중 마약 또는 다른 중간 변경의 쉬운 응용 프로그램을 가능 하 게 설정의 지속적인 교류와 직 립 confocal 현미경을 사용 합니다. 시간 경과 화상 진 찰 절차는 아래에 설명 된 살아있는 조각을 유지 하기 위한 몇 가지 여분의 장비와 함께 어떤 confocal 현미경에 수행할 수 있습니다. 프로토콜에는 이미지를 최적화 하 고 phototoxicity를 줄일 여러 팁을 포함 되어 있습니다.
마지막으로, 반사율 Confocal 현미경 검사 법 (코어)으로 흠 없는 수 초를 시각화 하는 빠르고 간단한 방법을 설명 합니다. 이 라이브 이미징 동안 myelin 칼 집을 식별 하려면 유용할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 여러 기술을 어떤 얼룩 필요 없이 이미지 myelin를 개발 되었습니다 하지만 대부분의 필요 특정 장비 및 전문6,,78. 여기에 설명 된 절차 myelin 칼 집의 반사 속성을 사용 하 여 고 스펙트럼 Confocal 반사율 현미경의 단순화 된 단일 여기 파장 버전 (점수, 있는 몇몇 파장 레이저 결합 되어 수 초를 시각화) 9. 코어 488 nm 레이저와 470-500 nm 대역 방출 필터 또는 가변 배기 필터 어떤 confocal 현미경에서 할 수 있습니다.
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프로토콜
여기에 설명 된 절차 노르웨이 동물 연구 기관에 의해 승인 되었습니다. 공급 업체 및 카탈로그 번호 소모품 및 기타 필요한 장비는 문서의 끝에 재료 목록에서 사용할 수 있습니다.
1. 준비의 Organotypic 조각
참고:이 제조 법 두 마우스 강아지를 사용 하 여 산 후 하루에 7-9 (p 7-9), 두 개의 6-잘 문화 접시에 나누어 24 organotypic 슬라이스를 따르. 살 균 후드에서 모든 절차를 수행 해야 달리 명시 하지 않는 한 그리고 nitril 또는 라텍스 장갑을 사용 해야 합니다. 셀 문화 학년 재료만을 사용 해야 합니다.
- 압력솥 병, 해 부 도구 (1 큰가 위, 1 작은 위, 1 큰 편평한 주걱, 1 작은 둥근 하 고 날카롭게 주걱 및 1 집게, 참조 자료 자세한 내용은 목록), 펫, 피 펫 팁 및 슬라이스 준비를 위해 사용 하는 조직 잎사귀 유리.
- 유리 펫의 절반 큰 열기와 함께 사용 해야 합니다, 좁은 엔드 끊다.
- 다이아몬드 선 침와 펜 (사용 가능한 경우) 어디 유리 축소 시작 지점 바로 아래 피 펫 주위. 니트 릴 장갑으로 또는 이와 유사한 다음 피펫으로의 뾰족한 끝을 놓습니다. 작업 벤치에 대하여 밀어 피펫으로 여 조심 스럽게 팁 끊다.
- 다음 모래 종이의 조각에 문 지르고 하 여 깨진된 끝을 무디게 하거나 분 젠 버너에 약간 녹기. 깨진된 펫 고무 전구 뀌 깨진 엔드와 컷된 뇌 조각을 전송 하 사용 되 고 대형 오픈 엔드 솔루션/조각 감동.
참고:이 메 마른 후드에서 수행 되지 않습니다 하 고 사전에 여러 일을 할 수 있습니다.
- 문화 요리를 준비.
참고:이 하루 전에 슬라이스 또는 슬라이스 하기 전에 최소한 2 시간을 할 수 있습니다.- 소계 소독 (PTFE) 멤브레인 (" 색종이 "). 두 살 균 집게를 사용 하 여 주변의 파란색 플라스틱 조각에서 단일 색종이 제거 하 고 96% 에탄올 (EtOH)를 포함 하는 배양 접시에 두 번 찍기로 소독. 그런 다음 색종이 건조 살 균 큰 페 트리 접시에 평평 하다.
참고:는 색종이 친수성 PTFE 막 문화 삽입에 막 비슷합니다. 색종이 사용 하 여 단일 조각 옮겨질 수 있다 쉽게 삽입에서 현미경 설치 집게와는 색종이 해제 하 여 때문에 라이브 이미징 에이즈 (4.8을 참조 하십시오. 자세한 내용은). 또는, 뇌 조각 색종이 (있는 조각에 연결 됩니다 직접 문화 삽입의 막) 없이 경작 될 수 있습니다. 이 경우에, 막 삽입 현미경 목욕 조각을 전송 하 메스 잘라 해야 합니다. - 문화 매체의 1 mL을 추가 (시 약 제조 법 ' 테이블) 6-잘 문화 요리의 각 잘.
- 장소 한 문화에 각 잘 소독 집게를 사용 하 여 삽입 합니다. 삽입 하 고 문화 매체 사이의 기포 방지.
참고: 저장 하려면 돈과 환경, 그것은 재사용 문화 삽입 가능입니다. 이것은 철저 한 rinsing 증류수 H 2 O (dH 2 O)에 의해 행 해질 수 있다 70% 부 화 뒤 EtOH 재사용까지 24 h의 최소. 새로운 문화에 대 한 준비를 할 때 건조 자외선 (UV) 15-30 분에 대 한 조명 아래 셀 문화 접시에 삽입 - 각 문화에 장소 2 (멸 균 및 건조) 색종이 삽입 합니다. 최소한의 오버랩을 삽입의 가장자리 쪽으로 색종이 놓습니다.
- 5% CO 2와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 넣어.
- 소계 소독 (PTFE) 멤브레인 (" 색종이 "). 두 살 균 집게를 사용 하 여 주변의 파란색 플라스틱 조각에서 단일 색종이 제거 하 고 96% 에탄올 (EtOH)를 포함 하는 배양 접시에 두 번 찍기로 소독. 그런 다음 색종이 건조 살 균 큰 페 트리 접시에 평평 하다.
- 거품 찬 절 개 매체 (시 약 제조 법 ' 테이블) bioxide 가스 (95% O 2 /5%CO 2). 유지 하기 위해 솔루션 불 임, 연결 튜브 가스 실린더에서 무 균 주사기 필터 (0.22 μ m 기 공 크기).
- 몇 주사기의 다른 쪽 끝 필터 살 균 튜브를 멸 균 유리 피 펫에 연결. 유리 피 펫 솔루션에서, parafilm으로 놓고 가스에 설정 합니다. 얼음에 해 부 매체를 계속
- 해 부/슬라이스 영역 준비.
참고: 이상적으로,이 이렇게 할 수 살 균 후드. 이 가능 하지 않으면는 vibratome 작업 벤치에 남아 있을 수 있습니다. 이 경우에, 머리 그물 및 얼굴 마스크를 사용 하는 것이 좋습니다.- Agarose 젤의 직사각형 조각 (약 2 c m x 0.5 c m)를 잘라 단일에 지 면도날을 사용 하 여 (시 약 제조 법 ' 테이블)는 긴 면 vibratome 블레이드 vibratome 단계에 접착제이 고.
- 모든 표면 및 70% EtOH vibratome 부분과 압력가 티슈 물티슈로 닦아 청소.
참고: 그것은 중요 한 뇌 조직 접촉 될 모든 조각을 EtOH 세포를 손상 시킬 수 있습니다 이후 완전히 건조는. - 는 vibratome를 살 균 면도날을 연결 하 고는 vibratome이이 기능 있으면 진동 검사.
- 압력가 조직 함께 후드에서 장소 압력가 마로 소독 해 부 도구 정리, 4 개의 작은 접시, 라운드 지 메스, 고무 전구, (제 1.1 참조) 두 개의 오픈 엔드 유리 펫 2 유리 펫 슈퍼 접착제 (분무 EtOH) 고.
- 버블링 된 해 부 중간 부는 4 개의 작은 접시와 vibratome 보트로.
참고:이 단계 에서만 수행 되어야 해 부 직전 이후이 시점에서 중간 하지 부풀어 또는 얼음에 보관
- Dissect 및 마운트 두뇌.
참고: 건강 한 조각을 얻으려면이 단계 수행 되어야 합니다 신속 하 고 정확 하 게. 연습이 필요 하다.- 로컬 지침에 따라 neckor의 전위에 의해 동물 # 1를 안락사와 다음 큰가 위로 목을 벨.
- 사용 하 여 작은 날카로운가 위, 신속 하 게 코에 목에서 화살 절 개 하 여 피부를 제거 하 고 옆으로 당겨 두개골을 공개.
- 화살 봉합, 정면 뼈와 lamboid 봉합 (뇌와 소 뇌 사이 국경)의 실내 부분 측면 절 개 뒤 따라 잘라.
- 집게를 사용 오픈 벤드 두개골 각 측에. 두개골 신경 두뇌의 복 부 측에서 날카로운 주걱 삽입 하 고 부드럽게 주걱을 옆으로 이동 하 여 뇌에서 차단 된다.
- Rostral 소 뇌를 잘라 코로나를 단일에 지 면도날을 사용 하 여.
참고:이 컷 슬라이스 잘립니다 각도 결정 합니다. 그것은, 따라서, 각에서 만들어질. - 뇌 두개골과 절 개 매체를 포함 하는 작은 페 트리 접시에 플립.
- 반복 단계 1.6.1.-1.6.4. 동물 #2 및 장소에 대 한이 뇌 두 번째 페 트리에서 접시.
참고: 동물 살 균은. 후드의 1 개의 측에 해 부를 수행 하 고 두뇌는 두개골에서 제거 되 면 다음, 깨끗 한 반대편으로 이동. - 장갑 변경.
- 연결 두뇌 vibratome 단계: 탑재 된 agarose 젤 앞 단계로 슈퍼 접착제의 얇은 층을 추가. 큰 편평한 주걱으로 갓 커트와 (꼬리) 뇌 #1 쪽을 잡고 주걱 및 복 부 측 연결 감동 (과 되 게 가능한 한 가까이) agarose 젤.
- 부드럽게 집게의 세트로 주걱을 추진 하 여 접착제에 두뇌 배치. #2 뇌에 대 한 충분 한 공간을 두고 있는지 확인 하십시오.
참고: 그것은 중요 한 단계로, 하지만 과도 한 접착제 없이 두뇌 연결 잘 되어이 절단을 방해 수.
- 부드럽게 집게의 세트로 주걱을 추진 하 여 접착제에 두뇌 배치. #2 뇌에 대 한 충분 한 공간을 두고 있는지 확인 하십시오.
- 뇌 # 1의 장착 후 즉시 사용 하 여 큰 주걱 위에 뇌 해 부 중간의 몇 방울을 추가. 이 뇌를 축축한 유지, 접착제를 강화 하 고 두뇌의 양쪽에 고정에서 그것을 방지.
- 단계 1.6.7 1.6.8 반복. 두뇌 #2.
- Vibratome 보트에 단계 연결.
- 230 µ m 두께 코로나 조각 잘라 진폭을 1-1.5 m m, 85 Hz의 주파수와 0.2 m m의 속도/1.4 m m rostral와 Bregma에 꼬리 2.1 m m 사이 약 수집 조각 s..
- 수집 조각 후 오픈 엔드 유리 펫 (제 1.1)을 사용 하 여 각 조각 잘라 왔다. 절 개 매체를 포함 하는 배양 접시에 분할 영역을 전송 합니다. 둥근된 메스를 사용 하 여 두 개의 반구를 나누어 두 조각 조각 잘라.
- 모든 조각 절단 됩니다 때 장소 조각 문화 요리.
- 인큐베이터 (한 시간에 하나씩) 문화 접시 꺼내.
- 는 색종이의 각 하나의 슬라이스를 전송 신중 하 게 오픈 엔드 유리 펫을 사용 하 여.
참고: 슬라이스는 색종이 중간 평평 하다 한다. 이 몇 가지 기술이 필요합니다. 그러나, 일부 조각이 완벽 한 있다면, 그것은 그들을 떠나에 인큐베이터에 모든 슬라이스를 가능한 한 빨리 얻는 것이 중요으로 그들을 이동 하려고 시간을 보내고 보다 더. - 유리 피 펫 (뾰족한 끝) 사용 하 여 부드럽게 제거 초과 매체는 슬라이스를 건드리지 않고.
참고: 조각 해야 하지 수에 몰두 액체는 인큐베이션 기간 동안. 따라서, 그런 조각 (매체의 박막 아직도 조각 커버 됩니다) 공기에 노출 되는 과잉 매체 발음 해야 합니다. 액체에 포장 되어 남아 있는 조각 것입니다 일반적으로 건강 한 또는 죽을 (4 우리의 관측). - 모든 색종이 한 조각 일단 인큐베이터에 접시에 이동.
- 단계 1.7.8 반복.-1.8.4. 요리 #2.
- 문화 매체 변경.
참고:이 이루어져야 한다 (하루 1 생체 외에서, DIV1) 슬라이스 후 일 그리고 다음 2-3 일 마다.- 예 열 물 목욕 이나 인큐베이터에서 배양.
- 살 균 후드를 사용 하 여 진공 흡입 또는 일반 피 펫 멸 균 팁 문화 매체 각 우물에서 발음. 이 부드럽게 (30도)에 의해 요리 팁과 문화 삽입의 가장자리에 피 펫 팁을 배치 이루어집니다.
- 각 잘 (떠나 계속 매체에 덮여 삽입의 하단에 충분 한 매체)에서 약 800 µ L을 제거 합니다. 그런 다음, 각 음을 미리가 열된 매체의 800 µ L 추가 깨끗 한 피 펫을 사용 하 여. 다음 셀 문화 인큐베이터에서 다시 요리를 놓습니다.
2. 바이러스 성 변환
관심, 앞에서 설명한 10 , 11의 플라스 미드와- 구매 또는 AAVs.
참고:이 프로토콜 사용을 설명 합니다. AAV serotype 2/8 (AAV 2/8)의 미토 콘 드리 아 들고 대상 dsred 또는 GFP myelin 기본적인 단백질 발기인 12의 transcriptional 통제 리포터 유전자로 (AAV2/8 MBP_mito_dsred 또는 AAV2 / 시각화 oligodendrocyte 미토 콘 드리 아를 8 MBP_mito_GFP) AAV 2/8 일반 CAG 발기인에 의해 구동 하는 리포터 유전자로 GFP 또는 tdtomato를 들고 (AAV 2/8 CAG_GFP 또는 AAV 2/8 CAG_tdtomato) oligodendrocyte 세포질을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 따라서, AAV 2/8 CAG_GFP와 AAV2/8 MBP_mito_dsred의 조합을 준다 빨간 미토 콘 드리 아 및 oligodendrocytes, 녹색 세포질 반면 AAV2/8 MBP_mito_GFP와 AAV 2/8 CAG_tdtomato 녹색 미토 콘 드리 아와 붉은 세포질 제공. 구문에 설명 되어 있습니다 더 자세히 다른 곳 13. - 하루 7 체 외 (DIV7)에 transduce는 AAVs와 oligodendrocytes.
주의: AAVs 작업에 대 한 안전 규정을 따릅니다. 적절 한 훈련 및 필요한 Biosafety 수준 승인 되었는지 확인 합니다. 모든 다음 포인트 장갑 및 실험실 외 투를 사용 하 여 클래스 2 biosafety 내각에 밖으로 실행 되어야 한다. 여기, 조각의 피 질 영역으로 AAV의 응용이 보여주는 최고의 복구 영역으로, 설명 되어 있습니다.- Dilute 미리가 열된 (37 ° C)에서 AAV 문화 매체. 2 × 10 9 게놈 사본/mL (GC/mL) 주위 희석 조각 내의 단일 셀의 이미지를 가능 하 게 oligodendrocytes의 스파스 변환 얻을 것이 좋습니다. 그러나, 조종사 다른 titers를 사용 하 여 특정 실험에 적합 불리고 oligodendrocytes의 밀도 보장 하기 위해 수행 되어야 합니다. 두 개의 다른 AAVs 사용 하는 경우 그들은 해야 동일한 솔루션에 혼합 하며 동시에 조각에 추가.
- 약 1.3 µ L 희석 AAV 각 조각 추가: 피 펫 팁의 외부는 건조 있는지 확인 하십시오. 1.3 µ L 플라스틱 AAV 희석을 누르고 위의 피 질, 피 펫 피 펫 팁 (약 1 m m 거리) 슬라이스를 건드리지 않고 최대한 가까이.
- 그런 다음 천천히 밀어 피펫으로에서 솔루션. 솔루션 분할 접촉, 피 펫 팁 전체 피 질 영역에 걸쳐 솔루션 피 위로 옮깁니다.
주:이 절차 필요 이상에 대 한 후드에서 분할 영역을 유지 하지 않으려면 최대한 빨리 수행 되어야 한다. 당시 한 접시에 이렇게 고 인큐베이터에 접시 # 2에 시작 하기 전에 첫 번째 접시를 넣어. 몇 가지 연습과 꾸준한 손이 필요는 조직 손상 없이 AAV의 만족 스러운 배포를.
- 직 립 형광 현미경 셀 연구소에서 사용할 수 있는 경우에, 단백질 식 현미경 접시를 배치 하 여 문화에 시간 동안 확인할 수 있습니다.
참고: 접시 지켜지면 안 된다 인큐베이터에서 2-5 분 이상.
3. 시간 경과 영상
참고: 때마다 형광 표식 식 레벨은 충분 한 조각 보고 건강에 이미징 수행할 수 있습니다 (일반적으로 DIV11-14).
- 현미경, 관류 및 난방 올바르게 설정 버블링 된 이미징 솔루션 열 입력 고 목욕을 종료할 수 있도록 확인.
참고: 다양 한 솔루션 목욕 챔버에 대 한 존재. 간단한 버전은 여기 표시 됩니다.- -고 무딘된 주사기 바늘 (~ 45 ° 굽은) 재미 있는 블루-압정/압정으로 욕조의 양쪽에 연결 된에 의해 욕실의 콘센트.
- 튜브 연동 펌프, 난방 관 히터 유닛, 그리고 목욕에 입구 주사기 바늘을 통해 통해 지속적으로 버블링 된 이미징 솔루션의 병에서가 하는 것을 확인 하십시오.
- 는 주사기 바늘 콘센트에 다른 튜브를 연결합니다. 이 튜브 연동 펌프를 통해, 그리고 다시 병의 이미징 솔루션 (또는 폐 병)가.
- 이미징 솔루션 거품 (시 약 제조 법 ' 테이블) bioxide 가스.
참고:이 sta 되어야rted 적어도 15 이미징 하기 전에 분 하 고 실험을 통해 계속. - 차례 연동 펌프와 히터 및 목욕 최적의 목욕 온도 (37 ± 0.5 ° C)를 통해 실행된 솔루션. 온도 단위에 연결 된 온도계 센서 목욕 솔루션에 빠져들은 확인 하십시오.
- 현미경, 형광 램프 및 적절 한 레이저. 샘플에 대 한 적당 한 빛을
- 설정 경로.
참고:이 현미경 설치 및 프로브에 따라 달라 집니다. Confocal 현미경을 사용 하는 방법의 일반적인 지식이 필요 하 고 여기 처리 되지 것입니다. - 물 침수 목표를 사용 하 여 적절 한 확대와 숫자 조리개 (없음). 우리는 40 x 물 침수 계획 apochromat 목표 (없음 1.0)을 사용 하 여.
- 오픈 시간 경과 비디오에 대 한 약 2-2.5 µ m의 광학 섹션을 달성 하기 위해 작은 구멍. 이 시간 동안 초점 이동 하는 미토 콘 드리 아의 발생을 감소 시킨다.
- 목욕에 전송 organotypic 조각:
- 작은 플라스틱 페 트리 접시에 이미징 솔루션 또는 문화 매체의 한 방울을 추가.
- 살 균 후드, 막에서 한 organotypic 슬라이스를 전송 사용 살 균 겸 삽입 드롭. 겸 해야만 터치는 색종이 조각 하지.
- 페 트리 접시에 뚜껑을 넣어.
- 인큐베이터에서 다시 조각의 나머지를 포함 하는 문화 접시를 넣어 즉시.
- 가지고 페 트리 접시를 현미경을 포함.
- 는 현미경 목욕탕에 슬라이스를 전송 하는 동안 연동 펌프를 해제 합니다. 첫째, 집게를 사용 하 여 슬라이스 배양 접시에서 목욕 (는 색종이 뜰 것 이다)의 상단에 색종이 해제. 그들은 조각, 건드리지 않고는 색종이 터치는 색종이의 각 측에는 집게의 두 팁을 배치 그리고 목욕의 바닥에는 솔루션을 통해 색종이 밀어. 목욕 중간 색종이 센터.
- 슬라이스를 건드리지 않고는 색종이 위에 고정 앵커 (하프)를 사용 하 여 집게.
참고: 하프 부동 또는 목욕에서 표류에서 슬라이스를 방지 하는 데 사용 되는 말굽 모양의 플래티넘 앵커입니다. 급성 조각, 얇은 문자열 하프의 한쪽에서 다른 (음악 하프 닮은) 실행 합니다. Organotypic 슬라이스, 하프 줄 고 그런 방법으로 그것은 슬라이스를 건드리지 않고는 색종이 위에 놓을 수 있는 색종이의 크기에 맞게. - 연동 펌프 다시 켜.
- 샘플 다운 목표 낮은.
- 셀 및 이미지에 지역 선택.
참고:이 세포 독성을 일으킬 수로 빛을 레이저로 세포의 과도 한 노출을 피하 (포인트 아래 팁 참조).- 올바른 식과 건강 한-찾고 oligodendrocyte 찾을 수는 접 안경 및 형광 램프 사용. 일반적으로, oligodendrocytes 형광 단백질의 강한 overexpression를 건강에 해로운 표시. 건강에 해로운 oligodendrocytes blobby 외관, 프로세스 그리고 mitochondria 조각난 나타납니다. 건강 한 oligodendrocytes, 소마와 프로세스 나타납니다 부드러운 고 미토 콘 드리 아 다양 한 길이 (비록 일반적으로 훨씬 더 짧은 보다 신경 및 이다 13 , 14 , 15).
- 시야 가운데 관심의 셀 배치.
- 사용은 " 라이브 " 화면에 셀을 식별 하 고 선택 흥미로운 지역, 예를 들어, 몇 가지 기본 프로세스 또는 myelin 칼 집, 또는 단일 프로세스를 포함 하는 셀의 일부를 (Leica와 Zeiss 현미경)에 대 한 소프트웨어 기능 또는 myelin 칼 집.
참고: 가능한 프로세스/칼 집의 이미지를 수, 선택 x-y 방향에서 상대적으로 배치 하는 프로세스를 포함 하는 지역 플랫. - 의 관심 분야에 확대 (0.14-의 픽셀 크기와 이미지를 생산 하는 일반적으로 0.30 µ m).
- 사용 하는 " 지역 " 도구, 영역 주위로 사각형을 그린 고만 선택된 영역을 검사 하는 옵션을 선택. 만 선택된 영역을 검색 하 여 감소 된다, 따라서 시간과 레이저 노출 검색.
참고: 가로 사각형 영역 검색 됩니다 필요한 스캔된 라인의 수의 짧은 수직 지역 보다 더 빨리. 수직 사각형 영역을 검색 하는 경우 스캔 시간 검색 필드 (회전 도구를 사용 하 여) 90도 회전 하 여 감소 될 수 있다.
- 조정 레이저 파워 및 이득 미토 콘 드리 아에 좋은 볼.
참고: 필요한 최소 레이저 파워를 사용 합니다. 만약에 가능 하다 면, 증가 레이저 힘 보다는 이득 설정. 세포 독성을 일으키는 외에 너무 높은 레이저 전원 레이저 힘의 증가 한 백업은 시간이 지남에 이미지 개체 표 백제 또는 검색 하는 동안 얻을. 필요한 레이저 파워 및 이득 식 수준 및 현미경에 따라 달라 집니다. LSM700 confocal 현미경 이미지 dsred 20-40 µW의 힘에 555 nm 레이저를 사용 하는 우리 또는 tdtomato 및 488 nm 레이저 GFP (레이저 파워는 목표의 뒤 조리개에서 측정) 이미지를 20-30 µW에서 사용 됩니다. 이득 라이브 이미징, 높은 보통 GFP에 대 한 700-800과 850-980 dsred 및 tdtomato의 범위에서 설정 됩니다. 고 이득 디지털 오프셋 (오프셋 값이 0과 15 사이의 일반적으로 누워) 증가 하 여 좀 더 많은 배경 잡음을 일으킬 수 있습니다. 우리의 경험에는 더 나은 신호 대 잡음 MBP_mito_dsred 보다 제공 MBP_mito_GFP를 사용 하 여. - 선택 스캔 속도.
참고: 빠른 검사 속도 사용 하 여와 작은 스캔 영역을 그려서 스캔 시간을 최소화 (참조 4.10.5 아래 지점). 그것은 또한 양방향 스캔을 수행 하 여 시간을 스캔 저장할 수입니다. 그러나, 이것은 바람직하지 가난한 이미지 품질. - 세트 주파수 및 시간 경과 기록, 예를 들어 캡처 이미지 oligodendrocytes에 미토 콘 드리 아 이미징에 대 일 분의 총에 대 한 2 초 마다의 기간.
참고: 주파수 및 내구는 관심사의 목표의 이동성에 따라 설정 되어야 합니다. 더 높은 주파수는 더 레이저 빛, 견본 노출 됩니다 하지만 빠른 이동 객체의 시간 경과 비디오 (예: 미토 콘 드리 아 및 미토 콘 드리 아에서 보다 훨씬 더 높은 속도로 더 자주 이동 하는 신경에 있는 총 시간 단축 필요 총 2 분 16 대 한 oligodendrocytes, 매초 몇 군데 일반적으로). - 시작 시간 경과 기록.
참고: mitochondria 초점 이동 및 녹음 하는 동안 몇 군데 지역에서 드리프트 있습니다. 진동과 움직임을 최소화 하기 위해 조정에서 및 목욕의 필요한 경우 펌프 속도 줄일 수. 작은 변화 초점 보통 여전히 발생합니다. 따라서, 영상 중 화면 연속 모니터링 하는 것은, 녹음 하는 동안 초점의 작은 조정 필요. - 셀의 미래의 식별을 위한 전체 셀의 z 스택 캡처하고 프로세스를 몇 군데.
참고: 더 나은 해상도, pinhole 해야 다시 z 스택 1 공기 단위. - 옵션: 흠 없는 수 초 시각화.
참고: oligodendrocytes (세포질) GFP로 불리고에 myelin 덮개 일반적으로 확인할 수 있습니다 직선으로 세포질 (세포질 능선)의 기본 과정 (참조 그림 2 A와 B)에 연결. 그러나, GFP 표정은 너무 약한 또는 세포질 마커 사용 되지 않습니다, 경우 설명에 따라 반사율 confocal 현미경 검사 법 (코어) 여 myelin 칼 집을 시각화 가능 하다.- 488에서 레이저 여기 소프트웨어에 새로운 빛 경로 설정 및 캡처 방출 예: 동일한 파장 주위 470-500 nm 빛.
- 조정 파워 레이저 고 myelin 표시 될 때까지 (에서 예를 참조 하십시오 < 강한 클래스 = "xfig "> 그림 3). LSM 510 메타 현미경을 사용 하 여, 우리가 일반적으로 사용 하 여 7-12 µW (목표의 다시 조리개에서 측정)의 레이저 힘.
- 옵션: immunostaining에 대 한 조각의 준비.
- 군데 셀 immunostaining, 후 식별 해야 합니다 경우 셀의 낮은 확대 이미지 (10 배)를 캡처하고 이미지에서 위치 화살표를 그려서 표시 또는 이와 유사한. 셀의 탐지를 원조 하는 것이 좋습니다 또한 셀의 위치를 나타내는 전체 조각의 수동 지도 그리는.
- 수정 실 온에 1 시간 동안 통에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 슬라이스.
주의: PFA 유해한입니다. 보호 착용을 사용 하 고 통풍 후드에서 사용. - PBS에서 1시 10분 정착 액을 희석 하 고 immunohistochemistry 17 설명 되어 있는 대로 시작까지 4 ° C에서 두고.
참고: 조각 몇 주 동안 희석된 정착 액에 남아 있을 수 있습니다, 비록 형광 사라질 수 있습니다. 정착의 10 일 이내 immunohistochemistry 수행 것이 좋습니다.
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결과
경작 하 고 위에서 설명한 대로 불리고 Organotypic 뇌 조각 대뇌 피 질의 oligodendrocytes mito_dsred와 GFP의 스파스 배포를 보였다. Olig2와 MBP에 대하여 항 체와 Immunostaining 확인 식 oligodendrocytes (그림 1)를 특정 했다.
라이브 이미징, 불리고 oligodendrocytes 병렬 (그림 1 및 그림 2A)에서 실행 되는 여러 myelin 칼 집의 그들의 독특한 형태에 의해 인식 되었다. Transduced oligodendrocytes에 영상 시간 경과 수행 하 여 기본 프로세스 및 myelin 덮개 (
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토론
여기서 설명 하는 organotypic 문화를 만들기 위한 프로토콜 드 Simoni와 유 (2006 년)5설명 하는 프로토콜의 수정된 버전18 이다. 가장 중요 한 변화는 아래 설명 된 했습니다. Tris 버퍼 문화 매체, 바이러스 성 변환 동안 인큐베이터 밖 때 조각의 생존과 셀 매체의 변화를 향상에 추가 됩니다. 색종이 대 한 살 균 절차 또한 변경 됩니다. 다른 프로토콜 압력가 마로 소독 하 여 색종이 소독 하는 동안 우리 권장 하지 않습니다이 때문에 그것은 여러 컬 색종이. 이러한 성장 조각 덜 건강 한 경향이 컬된 색종이 사용 하지 마십시오. 우리의 프로토콜 마우스를 사용 하 여, 아니 쥐, 그리고 해 마, 대신 피 문화 수정 우리는 얇은 조각 (230 µ m 대 300 µ m)에서 잘 작동. 출생 후 하루 10-20 쥐 및 쥐19, 문화에서 만든 myelination 봉우리로 쥐 p7-9 (...
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공개 사항
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
감사의 글
우리는 린다 Hildegard Bergersen 및 액세스 Magnar Bjørås 세포 실험실 및 장비, 플라스 미드와 바이러스 생산 Janelia 분자 생물학 공유 리소스 직원 및 공원 Vervaeke 레이저 파워 측정에 대해 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이 건강 협회, 노르웨이 연구 위원회와 현미경 장비 Norbrain에 의해 투자 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로스 | 시그마 | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | 목욕 |
| 바이옥사이드 가스 | AGA | 105701 | |
| 브랜드 피펫 전구 | Sigma-Aldrich | Z615927 | 피펫 전구 |
| 분젠 버너 (액체 프로판 버너) | VWR | 89038-530 | |
| 히터 컨트롤러 용 케이블 어셈블리 | Warner Instruments | 64-0106 | 온도 조절기 - 온도계 부분 |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 인큐베이터용 |
| 커버 유리, 사각형 Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | 라이브 이미징을 위해 수조 아래에 부착합니다. 접착제 또는 바트롤륨 젤리로 밀봉하십시오. |
| D-(+)-글루코스 | 시그마 | G7021 | |
| 섬세한 집게 | Finescience | 11063-07 | 해부용 |
| 다이아몬드 스크라이버 펜 | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| 일회용 유리 파스퇴르 피펫 230mm | VWR | 612-1702 | 유리 피펫 |
| 양날 스테인리스 스틸 면도날 | 전자 현미경 과학 | #7200 | 비브라톰용 면도날 |
| Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| 여과지 서클 | Schleicher & Schuell | 300,220 | PFA Fun |
| tack | Loctite | 1270884 | 욕조의 인도어 및 아웃렛 위치를 연결/조정하는 데 사용 |
| 핸드 타월 C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, RC-41 챔버용 플랫, | 워너 인스트루먼트 | 64-1418 | 목욕에서 색종이 조각을 누르는 하프. 유기형 슬라이스와 함께 사용하기 전에 현을 잘라냅니다. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, 모델 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | 층류 후드 |
| 말 혈청, 열 비활성화 | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR 막, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | 색종이 조각 |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | 해부를 위한 끝이 뾰족한 작고 둥근 주 |
| Millex-GP 필터 장치 Millipore | SLGPM33RA | 주사기 필터 장치 | |
| 밀리셀 세포 배양 인서트, 30 mm | Millipore | PICM03050 | 세포 배양 인서트 |
| Minipuls 3 속도 제어 모듈 | GILSON | F155001 | 라이브 이미징용 연동 펌프 - 제어 모듈 부품(2-캐널 헤드에 연결) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta 표면 | 열 Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | 자이스 | 441452-9900-000 | 라이브 이미징에 사용되는 Water Immersion Objective. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| 파라필름 | VWR | 291-1211 | |
| 파라포름알데히드, 과립 | 전자 현미경 과학 | #19208 | |
| PC-R 관류 챔버 | SiSkiYou | 15280000E | 라이브 이미징용 |
| 욕조 페니실린-스트렙토마이신, 액체 | 인비트로젠 | 15070-063 | |
| 페트리 디쉬 140 mm | Heger | 1075 | 대형 페트리 접시 |
| 페트리 접시 92x16 mm | 사르스테트 | 82.1473 | 미디엄 페트리 접시 |
| 페트리디쉬 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | 소형 페트리 디쉬 |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Sigma | P4417 | PBS 정제 |
| R2 투 채널 헤드 | GILSON | F117800 라이브 이미징용 연동 펌프 - 두 채널 헤드 부분(제어 모듈 필요) | |
| 원형/평면 주걱, 스테인리스 스틸 | VWR | 82027-528 | 해부용 대형 주걱 |
| 모래종이 | VWR | MMMA63119 선택 사항, 깨진 유리 피펫 매끄럽게 하기 위해 | |
| 가위, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | 해부용 대형 가위 |
| 가위, 8,5 | Finescience | 14084-08 | 작고 날카로운 가위, 해부용 |
| 단일 가장자리, 보석 블레이드 | 전자 현미경 | Sciences#71972 | 단일 가장자리 면도날 |
| 단일 인라인 솔루션 히터 SH-27B | 워너 인스트루먼트 | 64-0102 | 온도 컨트롤러 - 히터 부품 |
| Steritop-GP 필터 유닛, 500 ml, 45mm | Millipore | SCGPT05RE | 살균 필터 솔루션 |
| 슈퍼 접착제, 정밀 | 록타이트 | , 1577386 | |
| 외과용 메스 블레이드 번호 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | 둥근 메스 블레이드 |
| 온도 컨트롤러 TC324B | 워너 인스트루먼트 | 64-0100 | 실시간 이미징을 위한 온도 컨트롤러 (솔루션 히터 및 케이블 어셈블리 필요) |
| Trizma 베이스 | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| 워터 재킷 인큐베이터 시리즈 II | Forma Scientific | 78653-2882 | 인큐베이터 |
참고문헌
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