이 문서는 하나 이상의 플라즈마 포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 (GSD) 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 세포 막 단백질의 검출에 대 한 프로토콜을 설명. 여기, 우리 토론 혜택과 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 이러한 접근을 사용 하 여 고려 사항.
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이 논문에서
요약
초록
형광 현미경 검사 법 및 세포 생물학에서 발전은 밀접 하 게 연관는 향상 된 셀룰러 이벤트 자주 하는 방법에 대 한 우리의 이해에 극적인 도약 선도 시각화 하는 기능 세포 기능. 개발 및 슈퍼 해상도 현미경의 상당 하 게 확장 했다 광학 해상도의 한계 ~ 250-20에서 nm. 생물학은 colocalization 회절 제한 된 지역 내에서 분자 상호 작용을 설명 하는 제한 된 더 이상, 오히려 그것은 이제 개별 분자의 동적 상호 작용을 시각화 수 있습니다. 여기, 우리 바닥 상태 고갈 고정된 셀 이미징에 대 한 현미경 검사 법에 의해 시각화 및 세포 단백질의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 두 개의 서로 다른 막 단백질, 바인딩과 그물 translocon, sec61β, 그리고 원형질 막 지역화 전압 개폐 L 유형 캘리포니아2 + 채널 (CaV1.2)의 요소에서 예제를 제공합니다. 논의 특정 현미경 매개 변수, 고정 방법, 사진 스위칭 버퍼 정립, 그리고 함정 및 이미지 처리의 과제.
서론
셀룰러 신호 반응 번역 세포질 응답을 시작 하는 내부 및 외부 환경 변화. 그들은 인간의 생리, 호르몬 및 신경 전달 물질 방출, 심장 박동, 시각, 수정, 및 인지 기능에 대 한 기초로 제공의 모든 측면을 통제 한다. 이러한 신호 폭포의 병 태 생리 조건 암, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 등의 형태로 심각한 결과 가질 수 있습니다. 수십 년 동안, 생물학과 의학 조사자 이용 형광 단백질, 프로브, 바이오 센서는 형광 현미경 기본 도구로 결합 세포 이들의 정확한 공간과 일시적인 조직 이해 하 신호입니다.
Epifluorescence, confocal, 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등의 광학 기술의 힘은 그들의 감도, 속도, 및 라이브 셀 이미징, 주요 한계는 호환 그들의 회절 제한 된 해상도, 의미 구조 또는 200-250 nm 보다 작은 단백질 복합물은 확인할 수 없습니다. 결정적 슈퍼 해상도의 이론적이 고 실용적인 개발 (예를 들면, 자극된 방출 소모 현미경 (호텔 위치1), 구조화 조명 현미경 (SIM2) 또는 확률론 슈퍼 해상도 (예: , photoactivated 지역화 현미경 (팜
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프로토콜
1. 세척 유리 Coverslips
- 샘플 처리 하기 전에 하루 1 시간에 대 한 코의 1 M 솔루션에서 sonicating 여 #1.5 유리 coverslips를 청소. 이것은 coverslips에 있을 수 있는 어떤 형광 오염 물질을 제거 합니다.
- 드 이온된 수와 coverslips에서 코를 철저 하 게 린스.
- 일단 코에 청소, 70% 에탄올 사용 하 여 준비까지 있는 coverslips 저장.
2. 코팅 유리 Coverslips
참고:이 섹션의 단계는 오염을 방지 하기 위해 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
- 집게를 사용 하 여 개별 coverslip 70% 에탄올 솔루션에서 제거 하 고 신속 하 게 과잉을 제거 하는 화 염. 장소 6 잘 플레이트에 coverslips. 없으면 문화 후드에 불타는 옵션, 고려 압력가 마로 소독은 coverslips 드 이온된 수 또는 적어도 30 분에 대 한 문화 후드에 자외선에서 살 균 세 정 후
- 세포의 접착을 투입, 살 균 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온에서 1 h와 coverslips 코트....
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결과
소개에 명시 된 여러 다른 슈퍼 해상도 현미경 이미징 형식 있습니다. 이 프로토콜은 GSD 슈퍼 해상도 영상에 집중 한다. 대표 이미지와 지역화 지도 그림 2 및 그림 3에 나와 있습니다.
그림 2 와 ER 단백질, mCherry-Sec61β, 위에서 설명한 메서드를 사용 하 여 처리 페 COS-7 셀을 보여 줍니다. 그림 2A -2B TIRF 모드 (A)에서 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 고 GSD 획득 모드 (B)를 사용 하 여 응급실의 이미지의 비교를 허용........
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토론
회절 한계를 넘어 이미지를 허용 하는 기술의 최근 폭발 공간과 시간에서 신호 하는 포유류 세포의 복잡성에 새로운 윈도우를 제공 했다. 이러한 기술에는 폭풍, 호텔 위치, 팜, GSD, 시뮬레이션, 및 그들의 이체 (예를 들어, dSTORM, FPALM) 포함 됩니다. 이러한 기술 뒤에 과학자의 독창성 빛의 회절을 경 세 하는 물리학의 법칙에 의해 부과 된 한계를 우회 하 것을 허용 했다. 이 거 대 한 성취에도 불구 하 고 이러한 기술 각각을 슈퍼 해상도 달성 하기 위해 타협의 어떤 종류 하 게 있으며, 따라서, 한계가 있습니다. 세포 생물학과 biophysicists 노력에 대 한 이상적인 상황 최적의 감도, 높은 해상도 빠른 인수, 아니 photobleaching입니다. 또한, 하나는 동물에서 세포를 제거 하 여 우리가 본질적으로 그들을 변경 하 고 잠재적으로 분자 역학을 변경 인식 하 고 있어야 합니다. 따라서, 수 동적, 수퍼 해상도 기술 개발 퀘스트 라이브 셀, 생활, 동물 호흡에서 단일 분자 이미징에 .......
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공개 사항
저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.
감사의 글
이 작업은 R.E.D. (15SDG25560035)에 AHA에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자 박사 페르난도 산타나 그의 Leica SR GSD 3D 현미경의 사용을 위해 친절 하 게 제공 FP1 항 체에 대 한 박사 요하네스 지옥 인정 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | 커버 글라스 |
| 1.5 커버 글라스 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | 세포 성장/가공/이미징 |
| 10x | PBS Thermo Scientific | BP3994 | 탈이온수로 1배로 희석 |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| 을 커버하기 위한 세포 접착 보조Sigma | 114956-81-9 | 유리를 덮는 세포 접착 보조 | |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | 심실 근세포 배양 배지 |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | 배지 보충제 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Sigma | P4333 | 배지 보충제 |
| : 0.05 % 트립신 -EDTA | Corning | 25-052-CL | 세포 배양 용액 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection 시약 |
| Ca2 + - free PBS | Gibco | 1419-144 | 세포 배양 |
| 100 % 메탄올 | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | 세포 고정 |
| 파라 포름 알데히드 | 전자 Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| 글루타르알데히드 | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA 또는 기타 차단 솔루션 대안 |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | 세포 투과를 위한 세제 |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | 선물 | N/A | Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | 1차 항체 |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | 2차 항체 |
| Alexa Fluor 568 염소 anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | 2차 항체 |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | 시료 장기 보관을 위한 미생물 성장 방지 |
| 카탈라아제 | 시그마 | C40 | 광스위칭 완충액 성분 |
| 포도당 산화효소 | 시그마 | G2133 | 광스위칭 완충액 성분 |
| 트리스 | 시그마 | T6066 | 광스위칭 완충액 |
| 성분 베타-메르캅토에틸아민 염산염 | 피셔 | BP2664100 | 광스위칭 완충액 성분 |
| &베타;-메르캅토에탄올 | 시그마 | 63689 | 광스위칭 버퍼 성분 |
| NaCl | Fisher | S271-3 | 광스위칭 완충 성분 |
| 덱스트로스 | 피셔 | D14-212 | 광스위칭 완충 성분 |
| 유리 우울증 슬라이드 | Neolab | 1 – 6293 | 샘플 마운트 |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | 커버 유리 |
| 밀봉 sec61β- mCherry 플라스미드 | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D 현미경 | Leica | ||
| ImageJ | |||
| 세척 블록 용액 | PBS의 20 % SEA 블록 | ||
| 차 항체 배양 용액 | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEA 블록, PBS | ||
| 2 차 항체 배양 용액 | PBS의 1:1000 |
참고문헌
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G.
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