방법 논문

실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

DOI:

10.3791/56250

⸱

2018년 3월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 높은 실행 비용 ofmicrochip 기반 분석에 절약 목적으로 레이블 없는 세포 분석기 장착 상업 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 설명 합니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 마이크로 칩의 반복된 사용을 가능 하 게 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다.

초록

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레이블 없는 세포 기반 분석 결과 유리한 그것 때문에 생 화 확 적인 연구 실험 동물의 사용을 요구 하지 않습니다. 고아 한 생 화 확 적인 분석 실험 보다 생리 적 조건 하에서 세포에 대 한 보다 동적인 정보를 제공 하는 기능 때문이 라벨 무료 실시간 셀 분석 결과 전기 임피던스 원리에 따라 과거 동안 더 많은 관심 유치는 10 년입니다. 그러나, 그것의 실용적인 활용 비싼 소모품 일회용 골드 마이크로칩이 세포 분석기에 사용 되는 측정의 상대적으로 비싼 비용으로 인해 제한 된 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 상업 레이블 없는 세포 분석기 장착 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 개발 했습니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다. 제안 된 메서드는 테스트 되었고 세 번 이상 중생 및 상업적인 전자 번호판의 반복된 사용에 대 한 효과적인 것으로 표시 실시간 세포 분석 실험의 높은 운영 비용에 저장 연구를 도움이 될 것입니다.

서론

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레이블 없는 셀 기반 기술 proteomics1,2의 측면에서와 같은 분석으로 검사 목적을 위해 지난 10 년간 급속 한 성장을 목격 했다 때문에 그것의 효율적인 갈수록 많은 실험 과정, , 마약 배달3, 등4,5 비교 셀 분석, 프로토 이전 Giaever 및 동료에 의해 개발 된6 라벨 무료 실시간 세포 분석 실험 목적으로 전통적인 생 화 확 적인 방법으로 정량 방식으로 세포 성장 또는 마이그레이션의 연속 측정을 허용 하는 셀에 연결 된 마이크로 칩의 표면에 전기 신호 변화를 기록 하는 원칙에 기반. 이 전략에 따라 실시간 셀 전기 임피던스 기반 탐지 원리를 사용 하 여 (RT-CES) 시스템은 도입된7,8 그리고 더 최근의 상업 실시간 세포 분석기 (RTCA) 감지 전자 출범 실험실 연구9에 대 한.

상업 실시간 세포 분석기 주로 incubated 세포 등 세포 증식, 마이그레이션, 생존, 형태학, 준수에의 생리 적 변화에서 결과 전기 임피던스의 evoked 신호에 세포 읽는다 고 마이크로 칩10,11의 표면. 이러한 전기 신호는 더 셀 상태를 평가 하기 위해 셀 인덱스 (CI) 라는 크기가 없는 매개 변수 변환 분석기. 마이크로 칩의 임피던스의 변화는 주로 전극/솔루션 인터페이스에 대상된 셀의 로컬 이온 환경을 반영합니다. 따라서, 세포 분석기의 분석 성능 핵심 감지 장치, 일회용 마이크로 (즉, 소위 전자 판, 예를 들어, 96/16/8-잘), 기준점과 골드 microelectrodes로 만들어진에 크게 의존 있고 외피 우물의 바닥에 인쇄. 금 microelectrodes 원에 선 형식 (그림 1)에서 조립 및 연결 된 셀3,12,13의 역동적이 고 민감한 탐지를 허용 하는 인큐베이션 우물의 표면적의 대부분을 커버 ,14. CI의 셀 칩, 더 많은 표면 적용의 경우 증가 하 고 세포 apoptosis의 결과로 toxicant에 노출 되 면 감소. 일회용 전자 격판덮개는 물가가 가장 비싼는 비록 실시간 세포 분석기 자주 사용 세포 독성11 neurotoxicity15 결정 클래식 끝점 방법 보다 더 많은 운동 정보를 제공 하 소모품입니다.

지금까지, 아니 사용할 수 있는 메서드는 아마도 사실은 피 솔루션 또는 초 산 등의 가혹한 재생 조건 관련된16,17, 는 전자 판의 재생을 위한 되었습니다. 18, 하 금 마이크로 칩의 전기 상태를 변경할 수 있습니다. 따라서, 골드 칩의 표면에서 부착 세포와 다른 물질을 제거 하는 온화 하 고 효율적인 방법 전자 판 재생 프로세스에 대 한 바람직한 것입니다. 우리는 최근 일회용 전자 번호판 비 부식성 시 약을 사용 하 여 재생 하기 위한 프로토콜을 개발 하 고 재생성된 칩 광학 뿐만 아니라 전기 화학 방법19특징 이었다. 트립 신, 에탄올 등 쉽게 구할 수 있고 온건 실험실 시 약을 사용해 서, 우리는 두 가지 주요 유형 생성에 성공적으로 적용 되는 불리 한 효과 없이 상업적인 전자 접시를 다시 생성 하는 일반적인 방법 설립 전자 판의 RTCA (16, L8) 사용.

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프로토콜

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주: 일반적으로, 재생성 프로세스 포함 한다 트립 신 소화와 에탄올과 물으로 헹 구는 단계. 소화 시간이 사용 하는 셀의 수에 따라 변경 하 고 사용 하는 셀의 수는 실험 목적에 따라 다를 수 있습니다. 광학 및 전기 화학적 방법을 사용 하 여 재생 조건 최적화 재생성 된 마이크로 칩을 확인 하는 것이 좋습니다. 실험 기간 동안 가용성과 불용 성 화학 물질 관련 되어있을 수 있습니다, 그리고 여기 재생 절차의 두 가지 일반적인 경우가 자세히 나와 있습니다.

1입니다. 재생 솔루션의 준비

참고: 준비 하 고 무 균 조건 하에서 모든 솔루션을 처리.

  1. 신선한 0.25% (g/v) trypsin 솔루션을 준비 합니다. 트립 신 구입 하거나 갓 다음과 같이 준비 될 수 있습니다.
    1. 트립 신 pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 ml의 0.25 g을 분해.
    2. 트립 신 완전히 어떤 거품 형성을 방지 하도록 낮은 속도로 솔루션 4 oC. 볶음에 해산 될 때까지 솔루션을 저 어.
    3. Biosafety 두건에서 0.22 μ m 필터 솔루션을 필터링 합니다.
  2. 절대 에타 놀을 사용 하 여 75% 에탄올을 준비 합니다. 절대 에탄올 75 mL 부피 플라스 크에 부 어 하 고 볼륨 100 mL에 도달할 때까지 이온된 수를 추가 합니다. 필요한 경우 더 살 균을 수행 합니다.

2. 부 화 및 전자 번호판에 A549 세포의 확산

참고: 전자 판 16 형식과 L8는 모두 만든 기준점과 골드 microelectrodes 외피 우물의 바닥에 있고 인쇄의. 전자 판 L8 8 웰 스는 전자 판 16 16 웰 스는. 16 전자 판의 우물이 라운드 동안 전자 판의 L8 우물이 둥근된 사각형. 8 각 전자 판의 볼륨 잘 약 830 µ L 이며 각 전자 판 16 잘 약 270 µ L입니다.

  1. A549 세포 배양
    1. 로스웰 파크 기념 연구소-1640 매체 (RPMI-1640) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보충에 문화 A549 세포 세포 배양에서 페니실린 스 요리.
    2. 셀 밀도 ~ 75%에 도달 하면 세포를 통과 다음 1 × PBS 부착 셀 레이어를 세척 하 고 세포를 트립 신을 제거 하 5 분에 대 한 179 × g에서 0.25 %trypsin 솔루션 37 oC. 원심 분리기에서 1 분 동안 trypsinize. 10 mL 매체 더 문화에 대 한 셀 이나 다른 실험 resuspend.
      참고: 셀 중간에 resuspended의 솔루션은 여기 셀 서 스 펜 션 버퍼로 지정 됩니다.
    3. 10 µ L에 밖으로가 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. RPMI-1640 매체를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 버퍼 30000-80000 셀/mL 셀 서 스 펜 션 버퍼는 실험에 대 한 준비를 더 희석.
  2. 확산/세포 독성 실험 및 데이터 수집
    1. 전자 판 16 및 두고는 biosafety에 30 분 동안 평형에 대 한 후드의 각 화를 50 µ L (150 µ L 전자 접시 L8) 셀 매체를 추가 합니다. 수동으로 실시간 세포 분석기 37 oc.에 CO2 배양 기에서 16 전자 플레이트를 삽입
    2. 컴퓨터에서 실시간 세포 분석기 프로그램을 시작 합니다. 그것의 기본에 실험 패턴 설정 페이지 "모델 실험" 선택 하 고 이름을 실행 분석 결과.
    3. 레이아웃 페이지에 해당 우물 실험에 포함 된 편집 상자에 셀 유형, 수 및 마약 이름 같은 정보를 입력을 선택 합니다. 일정 페이지에서 실험 단계 추가 다음 각 단계 및 실시간 데이터 수집 간격의 실행 시간 (예를 들어,: 12, 24 또는 48 h)를 선택 합니다.
      참고: 여기, 단계 1과 2의 간격은 1 분 및 15 분 후.
    4. 파일을 저장 하 고;의 셀 인덱스 페이지에 미디어의 배경 임피던스를 측정 하기 위해 "시작" 버튼을 클릭 결과 데이터는 자동으로 공제 됩니다. 그래프 잘 페이지에 모든 잘 곡선을 방문 수 있습니다. 음모 페이지에 추가 우물과 시간 셀 인덱스의 그래프를 보여주는 것입니다.
    5. 셀 확산 실험을 위해 첫째로 프로그램을 일시 중지 하려면 "일시 정지" 버튼을 클릭 합니다. 그리고 전자 접시 꺼내 실 온에서 잘 당 100 µ L A549 세포 현 탁 액 버퍼를 추가 합니다. 셀 부 화 우물의 바닥에 정착 하도록 biosafety 두건에서 30 분 동안 접시를 남겨 주세요.
    6. 실시간 세포 분석기 역에서 전자 접시를 수동으로 삽입 합니다. 실험을 계속 "시작" 버튼을 클릭 합니다.
      참고: 음모 페이지 분석기 지속적으로 기록 셀 인덱스 값 또는 실험을 통해 곡선.
    7. 실험 완료 되 면 음모 페이지를 입력 하 고 실험 파일을 엽니다. 모든 테스트 인큐베이션 우물과 평균 수 또는 의약품 추가 또는 분석 실험 사이 변이 줄이기 위해 매체를 변경 하기 전에 마지막으로 정규화 결과 셀 인덱스 커브를 선택 합니다. 데이터 분석 페이지에 EC50 또는 IC50는 산출 될 수 있다

3입니다. 전자 번호판의 재생

참고: 각 헹 구는 단계에 대 한 전자 판에 솔루션 혼합 철저 하 게 (5-10 배)를 피 펫을 사용 하 여.

  1. 사례 1: 대 한 세포 독성 평가 안티 -암 약물
    1. 2 절에서 설명한 대로 전자 판에 씨앗 A549 세포.
    2. 먼저 셀 중간에 항 암 약물 독 소 루비 염 (DOX) 해산. 천천히 (DOX의 최종 농도 30 µ g/mL)는 세포에 DOX를 추가 피 펫을 사용 하 여. 2 절에 설명 된 대로 CI를 기록 합니다.
      참고: 사용 하는 전자 판 실험 완료 후 즉시 생성 했다. 이 경우에, DOX는 녹는 화학 프로토콜에 따라 전자 판의 재생은 상대적으로 쉽게 처리 하 고 아무 추가 단계는 필요.
    3. 재생
      1. 실시간 세포 분석기 역에서 세포를 포함 하는 전자 접시를 꺼내. 실내 온도에서 살 균 biosafety 두건에서 사용된 전자 접시를 놓고 문화 매체를 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 혼합 합니다. 모든 매체에 밖으로 플라스틱.
      2. 실 온에서 3 번 전자 번호판 200 µ L 이온된 물으로 린스.
      3. 1-2 h 37 oc.에 인큐베이터에 (200 µ L/물론)에 대 한 신선한 0.25 %trypsin 전자 판에 남아 있는 세포를 소화 소화 완료 되 면 5-10 시간 사용 하 여 피 펫 및 모든 솔루션을 피펫으로 실 온에서 biosafety 두건에서 부 화 솔루션을 혼합.
      4. 각각, 다음과 같이 200 µ L 에탄올 및 200 µ L 물, 전자 플레이트 린스: 이온된 수 2 회, 100% 에탄올 2 회; 75% 에탄올 2 번; 저온 2 번. 멸 균 거 즈 또는 실내 온도에 나머지 물을 가만히 따르다 휴지에 전자 접시 반전.
      5. 자외선 소독 biosafety 후드 실 온에서 1-2 h에 대 한 재생된 전자 판.
        참고: L8 전자 판의 재생에 대 한 모든 솔루션의 볼륨을 두 번.
  2. 사례 2: 마약 배달 mesoporous 소재를 사용 하 여입니다.
    1. 5.6의 평균 기 공 크기 막대 같은 mesoporous 실리 카 재료를 사용 하 여 이전에 보고 된20마약 배달 매트릭스로 nm.
      참고: 여기, 전자 판 세포에 약물 방출 효과 모니터링 하는 데 고용 되었다.
      1. 전자 판 각의 부 화 솔루션으로 mesoporous 자료를 추가 합니다. 실리 카 재료 가용성과 전자 판에서 촉진 되지 않는, 접시 같이 씻어.
    2. 사례 1에 설명 된 대로 단계 3.1.3.1-3.1.3.3를 수행 합니다.
    3. 실 온에서 biosafety 두건에서 200 µ L 이온된 물으로 마이크로 칩을 한 번 린스.
    4. 실 온에서 200 µ L 절대 에탄올과 마이크로 2 번을 씻어.
    5. 실 온에서 200 µ L 75% 에탄올과 마이크로 칩을 한 번 씻어.
    6. 각 잘에서 75% 에탄올의 250 µ L을 추가 하 고 실 온에서 씰링 필름 전자 접시를 봉인.
    7. 2 분 동안 114 x g에서 회전 시키십시오 그리고 전자 판 빈. 멸 균 거 즈 또는 실내 온도에 나머지 물을 가만히 따르다 휴지에 전자 접시 반전.
    8. 한 번 3.2.5-3.2.7 단계를 반복 합니다.
    9. 자외선 소독 biosafety 후드 실 온에서 1-2 h에 대 한 재생된 전자 판.
      참고: L8 전자 번호판을 rinsing 때 모든 솔루션의 볼륨을 두 번.

4입니다. 재생 효과의 평가

  1. 재생성 된 전자 플레이트 표면의 광학 특성
    1. 사용 강철 신선한의 외피의 하단 부분을 신중 하 게 분해 숟가락과 전자 플레이트 포함 된 재생성 짓고 금 microelectrodes. 플라스틱 장갑을 착용, 신중 하 게 강철 스푼을 사용 하 여 전자 판에서 마이크로 칩이 포함 된 부분을 닦으십시오.
    2. 유리 현미경 슬라이드의 가운데에 두 부분을 놓고21CCD 검출기 장착 하는 라만 현미경으로 결과 라만 스펙트럼을 수집 합니다.
      참고:는 분석기 633 nm 레이저 장착 했다 고 스펙트럼 파장 500-3500 c m-1의 범위에서 30 s 레이저 노출의 간격에 기록 되었다. 광학 이미지 라만 현미경으로 10 배 눈 렌즈 50 x 목표를 사용 하 여 얻은 했다. 그림 1A 와 그림 1C 또한 설치 된 라만 현미경 장치를 사용 하 여 얻은 했다.
    3. 신선 하 고 재생성에 항 암 약물 이해 후 연결 된 세포의 생존 능력을 평가 하 전자 번호판, 사용 confocal 레이저 스캐닝 현미경 DOX 분자 A549 흡수의 자발적인 형광을 모니터링 하.
      1. 셀 (신선 하 고 재생성 전자 번호판 A549 세포)를 사용 하 여 흡수 DOX의 자발적인 형광을 기록 하는 63 X 객관적이 고 485 nm 여기 파장으로 오일.
  2. 재생성 된 전극의 전기 화학 행동
    참고: 상업 전자 판의 수동 숨기는 어렵고 확인 표면 전기 상태의 평가 대 한 좋지 않은, 프로토콜의 재생 효율은 평가 테스트로 일반 골드/유리 탄소 전극 (GCE)를 사용 하 여 플랫폼, 전기 화학 임피던스 분광학 (EIS) 수행 되었다. Au 전극 및 GCE의 직경 3 m m. 전기 데이터 3 전극 시스템으로 전기 화학 분석기에 의해 가져온는 임피던스 측정에서 10 mV 진폭의 교류 전류 (AC) 신호를 사용 하 여 실시 했다는 넓은 주파수 0.01 hz에서 100 kHz의 범위.
    1. 측정 전에 모든 입자를 제거 하는 물에서 쥡니다 뒤 닦는 피복에는 알 루미나 슬러리와 거울 같은 표면에 Au 전극과 GCE 폴란드어.
    2. 그래서 0.5 M H2에서 Au 전극 활성화4. 설명된22로 10 m m 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된 KCl 전해질 솔루션 맨 Au 전극과 GCE의 EIS 데이터를 가져옵니다.
    3. 2.1.2 및 2.1.3 재고 A549 세포 솔루션을 준비 합니다. Au 전극과 GCE의 표면에 10 µ L 세포 현 탁 액을 드롭. Au 전극 및 GCE 3 h. Au 전극의 얻을 EIS 데이터에 대 한 37 oC 인큐베이터에서 셀 수정 GCE에 10mm KCl 전해질 솔루션 1 m m K3[Fe(CN)6]를 포함 하는 셀으로 품 어.
    4. 전극을 측정 EIS 및 프로토콜을 사용 하 여 다시 생성 합니다.
      1. Au 전극 담가 그리고 GCE 셀 수정 0.5-2 0.25 %trypsin h. Au 전극과 GCE 부드럽게 물으로 씻어 4 번. 린스 부드럽게 절대 에탄올과 전극 4 번. Au 전극 immerge와 ~ 5 분에 대 한 75% 에탄올에 GCE 린스 75% 에탄올과 부드럽게 칩 4 번.
      2. 10mm KCl 전해질 솔루션 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된 재생성 Au 전극과 GCE의 EIS 데이터를 가져옵니다.

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결과

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골드 마이크로 칩의 표면 특성:이 프로토콜에 사용 되는 재생 절차는 그림 1에 설명 했다. 그림 2 는 미세한 표면 신선한의 사진 및 광학 현미경에 의해 전자 번호판을 다시 생성. 같이 그림 2A 에 그림 2C, 현미경 관찰 표시 했음을 사실상 마이크로 칩의 광학 속성에 차이가 신선한 사이 표면 하 고 전자 번호판을 취급. 셀 상태의 평가 대 한 편리한 셀에 포함 된 독 소 루비 분자의 자발적인 형광을 사용 하 여, 우리 (그림 2B 와 그림 2D 재생성 후 골드 마이크로 칩에 배양된 세포의 유사한 동질성을...

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토론

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우리는 몇 가지 가능한 방법17,23,24,25,26 표 1에 마이크로 칩을 다시 생성에 대 한 요약. 기본적으로, 이러한 방법은 상대적으로 가혹한 실험 조건 면역 단지 SPR 칩에 사용 되는 등 강한 분자-분자 상호 작용의 존재 때문에 칩의 완전 한 재생을 달성에 참여. 그러나, 이러한 가혹한 실험 조건 RTCA에 사용 되는 기준점과 골드 마이크로 칩의 표면 특성에 대 한 매우 해로울 수 있습니다. 따라서, 온화 하 고 효율적인 방법을 제시 재생 전략의 개발에 주요 고려 했다. 동등 하 게 중요 한 다른 요소는 이러한 일회용 마이크로 표적된 암 세포와 함께 자주 사용 되는 때문에 환경 문제입니다.

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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일 국가 자연 과학 재단의 중국 (U1703118), 프로젝트 우선 순위 학술 프로그램 개발의 장쑤 등 교육 기관 (PAPD), 강 소 Shuangchuang 프로그램, 주 키의 오픈 펀드 자금에 의해 지원 되었다 화학/바이오 센 싱 및 Chemometrics (2016015)와 Biomacromolecules (2017kf05)의 국가 연구소 및 Jiangsu Specially-Appointed 교수 프로젝트, 중국의 실험실

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
쥐 : Sprague-DawleyCharles RiverCat # 400
마우스 안티 쥐 CD11b 단클론 (클론 OX42)Bio-RadCat# MCA275R패닝 : 1 : 1,000; 염색: 1:500
염소 다대장 항-IBA1 AbcamCat# AB5076염색: 1:500
토끼 다클론 안티-Ki67 아브캠 Cat# AB15580염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 안티 마우스 594InvitrogenCat# 11055염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 안티 염소 488InvitrogenCat# A-21203염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 안티 토끼 647InvitrogenCat# A-31573염색: 1:500
Triton-X (ICC 염색 시 세제)Thermo FisherCat# 28313
헤파란 설페이트갈렌 실험실 용품Cat# GAG-HS01
헤파린시그마 Cat# M3149
펩톤SigmaCat# P6838
TGF-β 2PeprotechCat# 100-35B
쥐 IL-34R& D 시스템Cat# 5195-ML/CF
양모 콜레스테롤Avanti Polar LipidsCat# 700000P
콜라겐 IV코닝 Cat# 354233
올레산케이맨 화학 Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) 산케이맨 화학제품 Cat# 20606
Calcein AM 염료InvitrogenCat# C3100MP
Ethidium homodimer-1InvitrogenCat# E1169
DNaseIWorthingtonCat# DPRFS
Percoll PLUSGE HealthcareCat# 17-5445-02
Trypsin SigmaCat# T9935
DMEM/F12GibcoCat# 21041-02
페니실린/ 스트렙토마이신GibcoCat# 15140-122
글루타민GibcoCat# 25030-081
N-아세틸 시스테인 SigmaCat# A9165
인슐린SigmaCat# 16634
Apo-transferrin SigmaCat# T1147
나트륨 셀레나이트SigmaCat# S-5261
DMEM (고포도당)GibcoCat# 11960-044
Dapi Fluoromount-GSouthern BiotechCat# 0100-20 
폴리-D-라이신 시그마Cat# A-003-E
Primaria 플레이트 VWRCat# 62406-456
재고 시약  재구성  농도 사용Storage
Apo-transferrin10 mg/mL in PBS 1:100-20° C
N-아세틸 시스테인5 mg/mL H2O 1:1,000-20°C; C
나트륨 셀렌 나이트2.5 mg / mL H2< / sub>O 1:25,000-20°C; C
콜라겐 IV200 μ g/mL(PBS );1:100-80° C
TGF-b220 &무; g/mL(PBS );1:10,000-20°C; C
IL-34100 &뮤; g/mL(PBS );1:1,000-80° C
양모 콜레스테롤1.5 mg/mL 100% 에탄올 1:1,000-20°C; C
헤파란 황산염1 mg/mL in H2O1:1,000-20° C
올레산 / 곤도 산곤도 산 : 0.001 mg / mL; 올레산: 100% 에탄올에서 0.1 mg/mL;1:1,000-20°C; C
헤파린50 mg/mL PBS 1:100-20° C
솔루션  레시피  Comments
관류 버퍼50 μ g/mL 헤파린(DPBS++(PBS with Ca++ and Mg+ +)차가울 때 사용
Douncing Buffer200 μ 50 mL의 DPBS++ 때 사용하는 50 mL의 0.4% DNaseI의 L
g/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5 &μ; g/mL N-아세틸 시스테인, 5 μ g/mL 인슐린, 100 μ g/mL 아포-트랜스페린 및 100ng/mL 아셀렌산얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 접시에서 미세아교세포를 제거합니다.
콜라겐 IV 코팅MGM 함유 2 μ g/mL 콜라겐 IV
미엘린 분리 완충액9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2첨가 후 잘 섞습니다  CaCl2 및 MgCl2
TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 매체(TIC) 인간 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &mu를 함유하는 MGM; g/mL 양모 콜레스테롤, 10 μ g/mL 헤파란 황산염, 0.1 μ g/ml 올레산, 및 0.001 μ g/ml 곤도산37°C로 예열된 매체에 콜레스테롤을 추가하십시오. C를 선택하고 1.5 이상을 추가하지 마십시오 μ g/mL 또는 침전됩니다. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 10% CO2로 TIC 배지를 평형화합니다.
우유 고형물에서 나온 얼음처럼 DPBSMicroglia Growth Medium(MGM)DMEM/F12 100 units/mL 페니실린을 함유하는 DMEM/F12;나트륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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