실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

요약

이 프로토콜 높은 실행 비용 ofmicrochip 기반 분석에 절약 목적으로 레이블 없는 세포 분석기 장착 상업 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 설명 합니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 마이크로 칩의 반복된 사용을 가능 하 게 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다.

초록

레이블 없는 세포 기반 분석 결과 유리한 그것 때문에 생 화 확 적인 연구 실험 동물의 사용을 요구 하지 않습니다. 고아 한 생 화 확 적인 분석 실험 보다 생리 적 조건 하에서 세포에 대 한 보다 동적인 정보를 제공 하는 기능 때문이 라벨 무료 실시간 셀 분석 결과 전기 임피던스 원리에 따라 과거 동안 더 많은 관심 유치는 10 년입니다. 그러나, 그것의 실용적인 활용 비싼 소모품 일회용 골드 마이크로칩이 세포 분석기에 사용 되는 측정의 상대적으로 비싼 비용으로 인해 제한 된 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 상업 레이블 없는 세포 분석기 장착 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 개발 했습니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다. 제안 된 메서드는 테스트 되었고 세 번 이상 중생 및 상업적인 전자 번호판의 반복된 사용에 대 한 효과적인 것으로 표시 실시간 세포 분석 실험의 높은 운영 비용에 저장 연구를 도움이 될 것입니다.

서론

레이블 없는 셀 기반 기술 proteomics^{1,2의 측면에서와 같은 분석으로 검사 목적을 위해 지난 10 년간 급속 한 성장을 목격 했다 때문에 그것의 효율적인 갈수록 많은 실험 과정,} , 마약 배달³, 등^4,5 비교 셀 분석, 프로토 이전 Giaever 및 동료에 의해 개발 된^{6 라벨 무료 실시간 세포 분석 실험 목적으로 전통적인 생 화 확 적인 방법으로} 정량 방식으로 세포 성장 또는 마이그레이션의 연속 측정을 허용 하는 셀에 연결 된 마이크로 칩의 표면에 전기 신호 변화를 기록 하는 원칙에 기반. 이 전략에 따라 실시간 셀 전기 임피던스 기반 탐지 원리를 사용 하 여 (RT-CES) 시스템은 도입된^7,8 그리고 더 최근의 상업 실시간 세포 분석기 (RTCA) 감지 전자 출범 실험실 연구⁹에 대 한.

프로토콜

주: 일반적으로, 재생성 프로세스 포함 한다 트립 신 소화와 에탄올과 물으로 헹 구는 단계. 소화 시간이 사용 하는 셀의 수에 따라 변경 하 고 사용 하는 셀의 수는 실험 목적에 따라 다를 수 있습니다. 광학 및 전기 화학적 방법을 사용 하 여 재생 조건 최적화 재생성 된 마이크로 칩을 확인 하는 것이 좋습니다. 실험 기간 동안 가용성과 불용 성 화학 물질 관련 되어있을 수 있습니다, 그리고 여기 재생 절차의 두 가지 일반적인 경우가 자세히 나와 있습니다.

1입니다. 재생 솔루션의 준비

참고: 준비 하 고 무 균 조건 하에서 모든 솔루션을 처리.

1. 신선한 0.25% (g/v) trypsin 솔루션을 준비 합니다. 트립 신 구입 하거나 갓 다음과 같이 준비 될 수 있습니다.
   1. 트립 신 pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 ml의 0.25 g을 분해.
   2. 트립 신 완전히 어떤 거품 형성을 방지 하도록 낮은 속도로 솔루션 4 ^oC. 볶음에 해산 될 때까지 솔루션을 저 어.
   3. Biosafety 두건에서 0.22 μ m 필터 솔루션을 필터링 합니다.
2. 절대 에타 ....

결과

골드 마이크로 칩의 표면 특성:이 프로토콜에 사용 되는 재생 절차는 그림 1에 설명 했다. 그림 2 는 미세한 표면 신선한의 사진 및 광학 현미경에 의해 전자 번호판을 다시 생성. 같이 그림 2A 에 그림 2C, 현미경 관찰 표시 했음을 사실상 마이크로 칩의 광학 속성에 차이가 신선한 사이 표면 하 고 전자 번호판을 취급. 셀 상태의 평가 대 한 편리한 셀에 포함 된 독 소 루비 분자의 자발적인 형광을 사용 하 여, 우리 (그림 2B 와 그림 2D 재생성 후 골드 마이크로 칩에 배양된 세포의 유사한 동질성을.......

토론

우리는 몇 가지 가능한 방법^{17,23,24,25,26} 표 1에 마이크로 칩을 다시 생성에 대 한 요약. 기본적으로, 이러한 방법은 상대적으로 가혹한 실험 조건 면역 단지 SPR 칩에 사용 되는 등 강한 분자-분자 상호 작용의 존재 때문에 칩의 완전 한 재생을 달성에 참여. 그러나, 이러한 가혹한 실험 조건 RTCA에 사용 되는 기준점과 골드 마이크로 칩의 표면 특성에 대 한 매우 해로울 수 있습니다. 따라서, 온화 하 고 효율적인 방법을 제시 재생 전략의 개발에 주요 고려 했다. 동등 하 게 중요 한 다른 요소는 이러한 일회용 마이크로 표적된 암 세포와 함께 자주 사용 되는 때문에 환경 문제입니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쥐 : Sprague-Dawley	Charles River	Cat # 400
마우스 안티 쥐 CD11b 단클론 (클론 OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	패닝 : 1 : 1,000; 염색: 1:500
염소 다대장 항-IBA1	Abcam	Cat# AB5076	염색: 1:500
토끼 다클론 안티-Ki67	아브캠	Cat# AB15580	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 안티 마우스 594	Invitrogen	Cat# 11055	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 안티 염소 488	Invitrogen	Cat# A-21203	염색: 1:500
Alexa Fluor Donkey 안티 토끼 647	Invitrogen	Cat# A-31573	염색: 1:500
Triton-X (ICC 염색 시 세제)	Thermo Fisher	Cat# 28313
헤파란 설페이트	갈렌 실험실 용품	Cat# GAG-HS01
헤파린	시그마	Cat# M3149
펩톤	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
쥐 IL-34	R& D 시스템	Cat# 5195-ML/CF
양모 콜레스테롤	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
콜라겐 IV	코닝	Cat# 354233
올레산	케이맨 화학	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) 산	케이맨 화학제품	Cat# 20606
Calcein AM 염료	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
페니실린/ 스트렙토마이신	Gibco	Cat# 15140-122
글루타민	Gibco	Cat# 25030-081
N-아세틸 시스테인	Sigma	Cat# A9165
인슐린	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
나트륨 셀레나이트	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (고포도당)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
폴리-D-라이신	시그마	Cat# A-003-E
Primaria 플레이트	VWR	Cat# 62406-456
재고 시약	재구성	농도 사용	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100-20	° C
N-아세틸 시스테인	5 mg/mL H2O	1:1,000-20	°C; C
나트륨 셀렌 나이트	2.5 mg / mL H2< / sub>O	1:25,000-20	°C; C
콜라겐 IV	200 μ g/mL(PBS );	1:100-80	° C
TGF-b2	20 &무; g/mL(PBS );	1:10,000-20	°C; C
IL-34	100 &뮤; g/mL(PBS );	1:1,000-80	° C
양모 콜레스테롤	1.5 mg/mL 100% 에탄올	1:1,000-20	°C; C
헤파란 황산염	1 mg/mL in H2O	1:1,000-20	° C
올레산 / 곤도 산	곤도 산 : 0.001 mg / mL; 올레산: 100% 에탄올에서 0.1 mg/mL;	1:1,000-20	°C; C
헤파린	50 mg/mL PBS	1:100-20	° C
솔루션	레시피		Comments
관류 버퍼	50 μ g/mL 헤파린(DPBS++(PBS with Ca++ and Mg+ +)		차가울 때 사용
Douncing Buffer	200 μ 50 mL의 DPBS++ 때 사용하는 50 mL의 0.4% DNaseI의 L
	g/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5 &μ; g/mL N-아세틸 시스테인, 5 μ g/mL 인슐린, 100 μ g/mL 아포-트랜스페린 및 100ng/mL 아셀렌산		얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 접시에서 미세아교세포를 제거합니다.
콜라겐 IV 코팅	MGM 함유 2 μ g/mL 콜라겐 IV
미엘린 분리 완충액	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2		첨가 후 잘 섞습니다  CaCl2 및 MgCl2
TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 매체(TIC)	인간 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &mu를 함유하는 MGM; g/mL 양모 콜레스테롤, 10 μ g/mL 헤파란 황산염, 0.1 μ g/ml 올레산, 및 0.001 μ g/ml 곤도산		37°C로 예열된 매체에 콜레스테롤을 추가하십시오. C를 선택하고 1.5 이상을 추가하지 마십시오 μ g/mL 또는 침전됩니다. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 10% CO2로 TIC 배지를 평형화합니다.

우유 고형물에서 나온 얼음처럼 DPBSMicroglia Growth Medium(MGM)DMEM/F12 100 units/mL 페니실린을 함유하는 DMEM/F12;나트륨