방법 논문

RGB 및 식물 형질 및 생리 적 연구에 대 한 스펙트럼 루트 이미징: 실험적인 체제 및 프로토콜을 이미징

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DOI:

10.3791/56251

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2017년 8월 8일

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1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

이 논문에서

요약

실험 프로토콜은 RGB와 hyperspectral 화상 식물 루트 시스템을 성장 하는 토양의 평가 대 한 제공 됩니다. RGB 이미지 시간 시리즈 hyperspectral에서 chemometric 정보 검색의 조합 공장 루트 역학에 대 한 통찰력을 최적화 합니다.

초록

식물 루트 역학의 더 나은 이해 농업 시스템의 리소스 사용 효율을 개선 하 고 작물 재배 환경 스트레스에 대 한 저항 증가 필수적 이다. 실험 프로토콜은 RGB 및 루트 시스템의 hyperspectral 화상 진 찰에 대 한 제공 됩니다. 접근은 식물 자연 토양에서 완전 개발된 루트 시스템을 관찰 하는 더 긴 시간을 통해 성장 rhizoboxes를 사용 합니다. 실험 설정 됩니다 rhizobox 식물 물 스트레스를 평가 하 고 뿌리의 역할을 공부 하 고 궁 행. RGB 이미지 설치 시간이 지남에 루트 개발의 저렴 하 고 빠른 정량화에 대 한 설명 합니다. Hyperspectral 영상 RGB 색상 기반 임계 처리에 비해 토양 배경에서 루트 분할을 향상 시킵니다. Hyperspectral 화상의 특정 힘은 기능 이해에 대 한 루트 토양 시스템에 chemometric 정보 수집 이다. 이 고해상도 물 콘텐츠 매핑 보여 줍니다. 그러나 스펙트럼 이미징은 이미지 수집, 처리 및 분석 RGB 방식에 비해 더 복잡 합니다. 두 방법의 조합에는 루트 시스템의 포괄적인 평가 최적화할 수 있습니다. 루트 및 지상 특성을 통합 하는 응용 프로그램 예제는 식물 형질 및 식물 생리 연구의 맥락에 대 한 제공 됩니다. 루트 영상의 추가 개선 및 확장 스펙트럼 데이터에서 루트 영역 속성에 유추 이미지 분석 방법의 다른 광원을 사용 하 여 더 나은 조명 RGB 이미지 품질을 최적화 하 여 얻을 수 있습니다.

서론

뿌리의 저장 등의 식물에 대 한 몇 가지 필수 기능을 제공 동화 한다, 토양, 및 통풍 관 지구 식물의 앵커리지와 물과 영양소1의 전송. 진화 관점에서의 루트 축 형성 땅 식물2의 기원에 대 한 기본 전제 조건으로 간주 됩니다. 이 중요 한 역할에도 불구 하 고 역사적으로 뿌리 생물학 연구에만 한계 위치를 점령 했습니다. 그러나 더 최근에,, 거기는 증가 그림1에서 입증 공장 루트 시스템에 과학적인 관심사.

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그림 1: 루트 식물 과학에 있는 연구의 관련성.
루트의 수는 지난 년간 SCI 저널에 모든 게시 된 식물 연구의 연구를 관련. Scopus 키워드 "공장" 및 "공장 및 루트"를 사용 하 여에서 결과 검색 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

두 가지 주요 이유는 루트 연구의 최근 발전 기초를 가설 수 있습니다. 첫째, 지상파 식물 글로벌 변경3결과로 더 자주 환경 스트레스에 노출 됩니다. 농업 작물 생산의 맥락에서 그것은 세계적으로 약 30%의 농업 지역 물과 인4,5에 의해 제한 됩니다 추정. 수확량의 스트레스 감소는 세계적으로 낮은 50 %rainfed 농업 생태계6에 대 한 잠재적인 생산성의 추정 되어 상당한 수익률 격차에 대 한 주요 이유. 낮은 리소스 가용성, 외이 가난한 리소스 사용 효율, 즉 부족 한 수 식물의 사용 가능한 리소스7악용 관련이 있습니다. 이 다른 생태계에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 질산염 등 모바일 자원의 손실에 결과. 예를 들어 현재 글로벌 질소 이용 효율 478추정 됩니다. 더 나은 자원 사용 효율성 향상 된 관리 방법 및 재배 이므로 모두 높은 중요성의 성장 환경 지속 가능성 뿐만 아니라 농업 출력의 지속. 이 컨텍스트 식물에서 뿌리 향상 된 작물 및 자르기 시스템9,10에 대 한 주요 대상으로 간주 됩니다.

식물 뿌리에 최근 관심사에 대 한 두 번째 중요 한 배경 측정 방법에 기술적 진보 이다. 루트 방법을 두 가지 주요 과제에 의해 제한 오래 있다: 그들은 주로11, 세척 하 여 정량화에 대 한 격리 해야 했다 토양에서 성장 하는 식물에서 뿌리의 측정에 대 한 그로 인하여 방해 루트 축의 건축 배열. 발굴을 사용 하 여 제자리에 루트 관찰 함으로써 토양에서 뿌리의 자연 스러운 위치를 보존 하는 방법 식물 설명12사용 되 고 있다. 아직도 그들은 매우 시간이 걸리는 고 따라서 비교 구조 기능 루트 시스템 분석의 처리량 요구 사항을 충족 하지 않습니다. 다른 한편으로 높은 처리량 방법 루트 건축 측정 했다 주로 수행 인공 미디어에 묘 종 식물13 식물의 자연 성장과 환경 추정 의심14가.

루트 연구의 최근 붐 이미징 방법15에 사전에 긴밀 하 게 연결 된다. 접근 루트 연구에서를 이미징 세 가지 유형으로 대략 그룹화 될 수 있습니다. 우선 CT 및 MRI16같은 고해상도 3D 방법이 있다. 이러한 메서드는 가뭄 유도 xylem 폐색전증17와 같은 흙과 식물 뿌리의 상호 작용 과정 연구에 가장 적합 한. 일반적으로 그들은 그들은 상세한 관측을 허용 하는 비교적 작은 샘플에 적용 됩니다. 다른 크기의 냄비와 잘 루트 이미징에 대 한 CT와 MRI의 비교는18에 제공 됩니다. 둘째, 높은 처리량 이미징 방법19,20있다. 이러한 메서드는 대부분에 따라 일반적인 2D RGB 영상 인공 미디어 (젤, 발 아 종이)에 성장 하는 뿌리의 고대비 뿌리와 배경 사이의 비교적 간단한 해 부를 허용 하는 곳. 그들은 다른 작물 genotypes 표준화 된 인공 성장 조건13에서 종묘 루트 특성 중 높은 처리량 비교를 위해 적합 하다. Rhizobox 메서드는이 두 가지 방법 사이: 그들은 더 긴 기간 동안 토양에 성장 하는 뿌리의 2D 이미지를 사용 하 고 중간 처리량21,22. (2D) 루트 이미징에 대 한 최근 도전 캡처 또한 구조23의 설명 외에도 루트 기능 지표입니다.

현재 신문에서 우리는 rhizobox 성장 (i)는 저렴 하 고 간단한 주문 품 RGB 이미징 설치 및 (ii)는 더 복잡 한 적외선 이미징 설치 프로그램을 사용 하 여 루트 시스템 이미징을 위한 실험 프로토콜 제시. 이러한 두 설정에서 예제 결과 표시 되며 식물 형질 및 식물 생리 연구의 맥락에서 논의.

프로토콜

1. 식물 성장을 위한 라이조박스(Rhizoboxes)

참고: 본 실험 시스템은 뿌리 이미징을 위한 식물 재배용 리조박스(rhizobox)를 사용합니다. 먼저 박스의 설계와 사용된 배지에 대해 설명하고, 이어서 충전 절차에 대한 세부 사항을 제공합니다.

  1. 리조박스 설계
    1. 15 mm 두께의 회색 PVC로 뒷판과 측면 프레임을 제작하여 리조박스(그림 2)를 만듭니다. 박스 크기는 30 mm x 10 mm로 합니다. 전면 창으로는 6 mm 광물 유리를 사용하며, 이는 측벽에 나사로 고정된 금속 레일을 통해 PVC 프레임에 부착합니다.
    2. 과잉수의 배수를 위해 바닥 프레임에 3개의 구멍을 뚫습니다. 이 구멍들은 선택적으로 플라스틱 나사를 사용하여 막을 수 있습니다.
    3. 충전 전, PC 다중벽 시트를 삽입하여 리조박스의 내부 직경(10 mm에서 30 mm 사이)을 조절합니다. 전체 시스템의 무게(토양 제외 리조박스 무게 13.2 kg)를 줄이기 위해 대부분의 작물에 대해 10 mm의 내부 공간을 권장합니다.

PVC, 유리, 다중벽 시트가 포함된 벽 구조도; 배수 설계; 치수 표시됨.
그림 2: 라이조박스(Rhizobox) 실험 시스템 및 구성 요소.
왼쪽 그림은 라이조박스(rhizobox)의 치수를 보여주며, 오른쪽 그림은 그 구성 요소를 보여줍니다. 구성 요소로는 측면 프레임이 포함된 회색 PVC 백 플레이트, 전면 무기 유리, 가변 내부 직경을 위한 다중벽 시트, 그리고 전면 유리를 후면 구획에 고정하기 위한 금속 앵글이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 배지
    1. 2 mm 입자 크기로 체질한 현장 토양(본 실험에서는 석회질 체르노젬의 실트 로암 표토 사용)으로 라이조박스를 채웁니다.
    2. 라이조박스를 열고, 미리 적신 배지를 사용하여 수평 상태에서 내부 구획(측면 프레임이 있는 후면 플레이트)에 배지를 채웁니다. 상단 개구부를 통해 배지를 부어 수직 상태로 채울 때 발생하는 미세 입자와 조대 입자 간의 층 형성 및 분리를 방지하기 위해 수평으로 채워야 합니다.
    3. 채우기 전에 배지를 미리 적십니다. 배지의 종류(특히 실트 및 점토 함량)에 따라, 표면 도말 및 구조 저하를 방지하기 위해 함수량이 0.12-0.18 cm3*cm-3를 초과하지 않도록 합니다. 배지를 라이조박스에 채운 후, 사전 혼합 시의 함수량과 목표 함수량의 차이만큼 물을 추가합니다.
      참고: (오븐) 건조 배지로 채운 후 전체 수량을 나중에 추가하는 방식은 배지의 강한 침하와 큰 균열을 유발할 수 있으므로 권장하지 않습니다.
  2. 단계별 충전 예시
    1. 목표 함수량을 정의합니다. 여기서는 식물이 수분 부족을 겪지 않는 초기 80% 식물 가용 수분(PAW)으로 설정했습니다.
    2. 배지의 포장 용수량(FC)과 영구 위조점(PWP)을 결정합니다. 여기서는 라이조박스와 동일한 높이(10 cm)의 PVC 튜브를 사용하여 FC를 구합니다.
      1. 튜브 바닥을 작은 배수 구멍이 있는 마개로 막고, 미세 배지로 인해 구멍이 막히는 것을 방지하기 위해 자갈 1 cm를 추가한 후, 라이조박스에 사용한 것과 동일한 용적 밀도(1.3 g cm-3)로 배지를 채웁니다.
      2. 배수가 일어날 때까지 튜브에 물을 포화시키고, 증발을 막기 위해 상단 개구부를 랩으로 덮은 상태에서 이틀 동안 평형 상태가 되도록 둡니다(결과적으로 얻어진 함수량이 정의상 포장 용수량과 동일합니다). 본 실험의 토양에서 얻은 포장 용수량 값은 0.357 cm3 cm-3였습니다.
        참고: PWP에서의 함수량은 표준 토양 물리 방법(예: 압력판 측정24) 또는 질감 기반 토양 전이 함수25를 통해 미리 알고 있어야 합니다. 사용된 토양의 경우 이 값은 0.12 cm3 cm-3와 같습니다.
      3. 압력판 추출법으로 FC를 측정할 때도, 라이조박스의 기하학적 구조(높이 100 cm = 10 hPa)에 대응시키기 위해 매트릭스 포텐셜 h=-30 hPa가 아닌 h=-10 hPa에서의 함수량을 측정하십시오.
      4. 80% PAW에서의 함수량(WC)을 계산합니다: WC (cm3 cm-3) = 0.80 (FC-PWP) + PWP. 본 실험에 사용된 토양의 수리학적 한계치에서 80% PAW일 때의 체적 함수량은 0.31 cm3 cm-3가 됩니다.
      5. 라이조박스 부피 2850 cm3 (너비 30 cm, 내부 공간 1 cm, 높이 95 cm, 관수를 위해 상단 5 cm는 배지를 채우지 않고 비워둠)에 필요한 물의 양을 계산합니다. 20 °C에서 물의 밀도가 1.0 g cm-3일 때, 물의 부피는 83.5 cm3이며 이는 83.5 g과 같습니다.
    3. 라이조박스를 채울 용적 밀도(db)를 정의합니다. 여기서는 일반적인 농경지 토양에서 발견되는 값에 해당하는 1.3 g cm-3로 설정했습니다. 이 db에서 2850 cm3의 라이조박스 부피를 채우는 데 필요한 건조 배지의 양은 건조 토양 3705 g입니다.
    4. 건조 토양 3705 g에 물 40 g을 추가하여 중량 함수량 0.108 g-1 (체적 함수량 0.14 cm3 cm-3에 해당)가 되도록 미리 적시고, 부드럽게 섞어 균일한 수분 분포를 얻습니다. 입자 크기를 2 mm 이하로 유지하기 위해 큰 덩어리는 수동으로 부숩니다.
    5. 미리 적신 토양을 열려 있는 라이조박스에 채우고, 박스의 내부 부피를 덮는 폴리스티렌 시트(30 x 10 x 1.5 cm)를 사용하여 부드럽게 다져 1.3 g cm-3의 균일한 db를 구현합니다.
    6. 분무기로 표면에 분사하여 나머지 물의 양(483.2 g)을 추가함으로써 목표 함수량인 0.31 cm3 cm-3를 달성합니다. 표면 구조의 저하를 방지하고 균일하게 적시기 위해 입자 크기가 작게 분사되도록 합니다. 분사하는 동안 박스를 저울 위에 두어 배지에 실제로 추가된 물의 양을 모니터링하십시오.
    7. 물이 재분배되도록 10분 동안 둔 후, 표면에 유리를 누르고 측면 금속 레일로 고정합니다. 적신 배지가 채워진 라이조박스의 최종 평균 무게는 17818 ± 68 g(라이조박스 무게 13230 g + 건조 토양 3705 g + 물 83 g)이었습니다.
      참고: 수평 박스에 채워진 균일한 함수량은 박스가 최종 위치로 세워질 때 결과적인 포텐셜 구배에 따라 재분배됩니다. 이는 기하학적 구조(높이)에 따른 모든 식물 성장 포트에서 발생하는 물리적 과정이므로, 실험자는 포트의 수리학적 특성26을 인지하고 있어야 합니다.

2. 기후실 설정

  1. 식물의 최적 성장을 위해 40(청색) 및 60(적색) nm에서 스펙트럼 피크를 가지며 450 μmol m-2 s-1의 균일한 조도를 제공하는 8개의 LED 램프를 기후실(그림 3)에 설치합니다.

식물 스트레스 실험 도식; LED 설정, 기상 관측소, 기공 전도, 증기압 결핍 도표.
그림 3: 스트레스 실험을 위한 라이조박스(rhizobox)가 설치된 기후 챔버.
(A) LED 조명, 기상 관측 장비 및 PC(잎 습도계 기록용)가 포함된 챔버 전체의 왼쪽 모습; 라이조박스(rhizobox)를 고정하는 금속 프레임의 근접 촬영 오른쪽 모습 45 ° 경사각 및 빛으로부터 라이조박스(rhizobox) 유리창을 차단하기 위해 사용된 나무판. (B) 대기 요구도(높음/낮음)와 토양 수분 가용성(높음/낮음)의 차이에 따른 스트레스를 네 단계로 결합한 사탕무 스트레스 실험입니다. 평균 기공 전도도를 나타내는 녹색 막대는 식물의 스트레스 반응을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 식물 및 실험 조건에 맞게 주변 환경 매개변수를 설정하십시오. 본 실험에서는 조명을 위해 14시간 광주기와 10시간 암주기를 적용합니다. 식물 정착 단계 및 스트레스 처리 시작 전까지 온도는 낮 20° C, 밤 15° C로 설정하고 상대 습도는 50 ± 8%로 유지하십시오.
  2. 적절한 금속 프레임을 사용하여 라이조박스(rhizobox)를 45° 경사로 배치하십시오. 이는 굴중성으로 인해 뿌리가 유리 표면을 향해 최대한 성장하도록 유도합니다.
  3. 뿌리 영역을 어둡게 유지하고 유리 표면을 통해 투과되는 빛으로 인한 조류 성장을 방지하기 위해 유리창을 나무판으로 덮으십시오.

3. 사탕무 예시 설정 및 처리

  1. 근수가 나올 때까지 인큐베이터 내 20 °C에서 젖은 여과지 위에 사탕무 종자를 3일 동안 예발아시킵니다. 이는 생존 가능한 식물을 파종하기 위함입니다.
    참고: 발아력이 높은 식물의 경우 예발아가 필요하지 않으며, 이를 통해 파종 시 근수가 손상될 위험을 방지할 수 있습니다. 그러나 과피가 두꺼운 사탕무 종자의 경우 불발아 종자의 위험이 높으며, 예발아는 토양 직접 파종에 비해 근수 출현을 현저히 가속화합니다.
  2. 드라이버를 사용하여 라이조박스 중앙에 약 1.5 cm 깊이의 작은 구멍을 뚫고, 핀셋을 이용해 근수가 아래를 향하게 하고 유리창 옆에 위치하도록(초기 가시성을 높이기 위함) 종자 하나를 배치한 뒤 흙으로 살짝 덮습니다.
  3. 관수 중 토양 떼알 구조의 붕괴를 방지하고 증발 손실을 줄이기 위해 토양 위에 0.5 cm 두께의 미세 자갈(2-4 mm) 층을 추가합니다. 출현을 용이하게 하기 위해 종자가 배치된 곳의 토양 표면에는 자갈을 두지 않습니다.
  4. 정착을 촉진하기 위해 물 10 g을 추가합니다.
  5. 실험적 스트레스 처리가 시작되기 전까지 정착 및 초기 성장 단계 동안, 초기 수분 함량인 80% PAW를 유지하도록 2-4일마다 라이조박스에 관수합니다.
    1. 라이조박스의 무게를 측정하고 각 개별 박스의 초기 무게에 도달할 때까지 물을 추가하여 필요한 관수량을 결정합니다. 수동 관수 시에는 물을 주는 동안 표면 구조가 손상되지 않도록 피펫을 사용하십시오.
  6. 설정된 설계에 따라 기후실 내에 라이조박스를 배치합니다. 여기에 보고된 프로토콜은 완전 무작위 설계(CRD)에서 5회 반복으로 6가지 사탕무 품종을 대상으로 한 실험을 기반으로 합니다.
    1. 무게 측정 및 관수를 위해 금속 홀더에서 라이조박스를 꺼낼 때마다 위치를 변경합니다. 이는 기후실 내부의 잔류 (광) 불균일성에 의한 영향을 방지하기 위함입니다.
  7. 스트레스 처리 시작 시점과 스트레스 유형을 정의합니다. 여기서는 다음과 같은 설정(그림 4)을 사용합니다.
    1. 뿌리가 라이조박스 깊이의 약 75%를 차지하고 잎 측정을 위해 캐노피가 충분히 발달한 BBCH 15(잎 5개 전개) 단계에서 측정을 시작합니다. 새로운 설정에 적응하고 측정을 수행할 수 있도록 각 단계를 최소 3일 동안 유지합니다.
    2. 비스트레스 관찰의 경우, 최적 토양 수분(80% PAW)과 주변 조건(온도 20° C/15° C, 상대습도 rH 50 ± 8%)을 유지하여 낮 시간의 포차(VPD)를 1.28 ± 0.1 kPa로 설정합니다(참조. 그림 3 C).
    3. 토양 수분은 80% PAW로 유지하면서, 온도를 27°C/20°C로 높이고 rH를 35%로 낮추어 대기 요구도를 낮 시간 VPD 2.45 ± 0.4 kPa까지 높입니다.
    4. 이후 관수를 중단하여 라이조박스를 수분 함량 0.215 cm3 cm-3에 해당하는 40% PAW까지 건조시킵니다. 대기 요구도가 낮은(VPD 1.28 kPa) 초기 주변 조건으로 재설정합니다.
    5. 대기 요구도를 VPD 2.45 kPa로 높이고 토양 수분을 40% PAW로 유지하여 스트레스를 결합합니다.

4. 뿌리 이미징 방법

  1. 각의 장점을 활용하고 목표로 하는 정보에 따라 영상법들을 결합하십시오.
    1. 뿌리 성장, 구조 및 형태를 시간에 따라 추적하기 위해 가시광선(VIS) 범위의 RGB 이미징을 적용하며, 이는 암묵적으로 빈번한 측정을 필요로 합니다. RGB 이미징의 장점은 (i) 낮은 비용, (ii) 빠른 이미지 획득, (iii) 낮은 하드디스크 공간 요구 사항(이미지 크기: 48 MB) 및 (iv) 고해상도(3648 x 5472 픽셀)입니다.
    2. 뿌리와 토양의 화학계량학적 특성이 필요한 경우에는 NIR 범위의 초분광 이미지(HSI)를 사용하십시오. 장점은 (i) 뿌리와 토양 배경 간의 분할을 위한 분광 특성을 제공하고, (ii) 물리화학적 시스템 특성(예: 토양 수분 함량, 뿌리 연령)에 접근할 수 있다는 점입니다. 단점은 (i) 더 긴 스캔 시간(라이조박스당 약 16분), (ii) 방대한 데이터 세트 크기(라이조박스 이미지당 13.7 GB), (iii) NIR 카메라의 낮은 해상도(320 x 256 픽셀), 그리고 (iv) 데이터 분석의 높은 복잡성입니다.
  2. RGB 뿌리 이미징
    1. 이미징 박스(그림 4주변광을 차단하고 카메라 위치를 고정하는 장치는 폭 1m, 높이 1m의 금속 프레임과 프레스보드로 마감된 측벽으로 구성됩니다. 전면부에서 라이조박스(rhizobox)로부터 80cm 떨어진 두 지점에 카메라를 고정하십시오.
      1. 투명 접착 테이프로 라이조박스(rhizobox) 프레임에 줄자를 부착하고, 이미징 박스의 홀더에 라이조박스를 배치하십시오.
      2. 라이조박스(rhizobox)로부터 80cm 거리에 설치된 4개의 24W 형광등 튜브를 사용하여 라이조박스를 조명하십시오. 또한, 뿌리와 (밝은 색상의) 배지 배경 사이의 대비가 낮은 경우에 뿌리의 자가 형광을 이용한 대체 조명으로 사용할 수 있도록 4개의 15W UV 튜브를 라이조박스에서 20cm 거리에 설치하십시오.
      3. 약 3cm의 중첩 구간을 두어 라이조박스(rhizobox)의 상단과 하단 절반을 촬영하도록 두 장의 이미지(상단 및 하단 위치)를 찍으십시오.
    2. 이미징 박스의 각 위치에 퀵 릴리스 플레이트로 고정된 디지털 단렌즈 반사식 카메라를 사용하여 RGB 이미지를 획득하십시오.
      1. 형광등 튜브를 사용할 때 다음 설정을 적용하십시오. 치수, 조명 및 카메라 모델의 변경 사항에 맞춰 이 예시 설정을 조정하십시오.
        1. 카메라 렌즈의 자동 초점과 손떨림 보정 기능을 끕니다. 카메라를 수동 모드로 설정하십시오.
        2. ISO 속도를 50으로 설정하십시오. 셔터 속도를 13으로 설정하십시오. 조리개를 5.6으로 설정하십시오.
        3. 미러 잠금을 해제하십시오. 화이트 밸런스를 자동 화이트 밸런스로 설정하십시오.
      2. UV 튜브 조명을 위해 다음 설정을 사용하십시오:
        1. 카메라 렌즈의 자동 초점과 손떨림 보정 기능을 끕니다. 카메라를 수동 모드로 설정하십시오.
        2. ISO 속도를 10으로 설정하십시오. 셔터 속도를 13으로 설정하십시오. 조리개 값을 5.6으로 설정하십시오.
        3. 미러 잠금을 해제하십시오. 화이트 밸런스를 형광(Fluorescence)으로 설정하십시오.
    3. 사진 편집기(예: Adobe Photoshop)를 사용하여 라이조박스(rhizobox) 상단과 하단의 RGB 이미지를 하나의 이미지로 병합하십시오. 라이조박스 측면 프레임의 측정 테이프를 사용하여 겹치는 대상(뿌리 및 토양 특성)을 조정하십시오.
      1. 각 3648 x 5472 픽셀 크기의 두 개의 개별 이미지를 흰색 배경의 3648 x 1094 픽셀 크기 새 파일에 복사하십시오.
      2. 한 이미지의 레이어 불투명도를 60%로 낮추고 이미지의 겹치는 부분(측정 테이프, 객체)을 정렬하십시오. 그 후 레이어 불투명도를 10%로 복원하십시오.
      3. 이미지의 자를 기준으로, 뿌리가 없는 이미지 상단에 정확히 1cm 길이의 빨간색 선 두 개를 추가하십시오. 이 선들은 이후 이미지 분석 단계에서 이미지의 길이를 정확한 치수로 조정하는 척도로 사용됩니다.
      4. 모든 레이어를 병합하고 자르기 도구를 사용하여 토양이 채워진 창 외부의 이미지 부분을 제거하십시오.
      5. 추후 분석을 위해 이미지를 tiff 파일로 저장하십시오.
      6. UV 조명을 사용한 이미지의 경우, 툴바를 사용하여 저장하기 전에 색상을 그레이스케일로 변환하십시오. 조정 사항-검정색 & 하얀색, 그리고 미리 정의된 것을 선택하여 고대비 블루 필터
    4. 뿌리와 토양 배경 간의 분할 및 관심 뿌리 특성(예: 길이, 표면적, 직경, 분지)의 정량을 위해 모든 뿌리 분석 소프트웨어(사용 가능한 도구는 www.plant-image-analysis.org 참조)를 사용하십시오. 본 과정에서는 WinRhizo를 사용합니다.
      1. rhizobox tiff-image 소프트웨어를 여십시오.
      2. 이미지에 추가된 스케일 바를 사용하여 이미지의 길이 척도를 보정하십시오.
      3. 선택 색상 기준 선택 항목이 있는 분석 메뉴에서 뿌리 & 배경 구분.
      4. 뿌리와 토양(배경)에 해당하는 색상 클래스가 포함된 보정 파일을 정의하십시오. 여기서 사용된 예시 이미지의 경우 (참조 그림 8) 세 가지 뿌리 색상 등급(노후 측근, 신생 측근, 주근)과 세 가지 토양 색상 등급이 정의됩니다.
      5. 그레이스케일 이미지(UV 조사)의 경우 (i)를 선택하십시오. 회색조 레벨 기반, 그리고 (ii) 검은색 배경의 창백한 뿌리 ~에서 뿌리 & 배경 구분 메뉴를 사용하고 세분화를 위해 국소 Lagarde 강도 임계값을 사용하십시오.
      6. 결과가 저장된 데이터 파일을 엽니다.
      7. 분석을 실행한 후, 불일치하는 영역(예: 가장자리)이 있는지 확인하십시오. 이 경우 제외 영역을 설정하고 분석을 다시 시작하십시오. 분류되지 않은 뿌리의 경우, 색상 클래스를 추가하고 분석을 다시 시작하십시오. 뿌리로 잘못 분류된 요소의 경우, 다음을 활성화하거나 증가시키십시오. 파편 & 거친 가장자리 필터링 옵션

UV 및 할로겐 램프를 이용한 식물 이미징 설정; 뿌리 및 캐노피 분석용 라이조박스 홀더와 카메라 마운트.
그림 4: RGB 라이조박스(rhizobox) 사진 촬영을 위한 이미징 박스.
광원이 내부에 설치된 라이조박스(rhizobox)가 부착되어 이미징을 수행하는 전면의 왼쪽 모습; 카메라가 장착된 후면의 오른쪽 모습. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 초분광 뿌리 이미징
    1. 하드웨어 설정
      1. 하이퍼스펙트럼 뿌리 이미징 시스템을 사용하여 (그림 5)는 (i) 90 nm에서 170 nm의 분광 범위를 가지며 320 x 256 픽셀의 해상도와 10Hz의 프레임 속도를 갖춘 열전 냉각 방식의 14비트 단색 NIR 카메라와 (ii) 90 nm에서 250 nm의 분광 범위 및 3.6 nm의 분광 해상도를 갖춘 이미징 분광기로 구성된다. 할로겐 선형 조명원(50 W 할로겐 스폿 4개)을 다음의 형태로 배치한다. 45°/-45° 기하학적 구조. 이미징 센서를 2축 위치 제어 시스템에 장착하십시오. 스캔 창의 크기는 240 x 10 mm이며, 즉 라이조박스(rhizobox)의 각 가장자리 30 mm 영역은 이미지에 포함되지 않습니다.
      2. 다음 항목들을 위해 Matlab 스크립트로 시스템을 제어하십시오: (i) 화이트 및 다크 표준 획득, (ii) 카메라 적분 시간 설정, (iii) 공간 해상도(픽셀 크기 0.1 mm; 픽셀 크기 1.0 mm) 및 분광 해상도(해상도 3.6 nm의 모든 2개 분광 밴드; 해상도 14.8 nm의 54개 밴드로 평활화된 스펙트럼) 선택, (iv) 라이조박스(rhizobox) 상의 스캔 영역 정의.
      3. 이미지를 SIF 파일로 저장하십시오. 대용량 파일 저장 시 발생할 수 있는 문제를 방지하기 위해, 스캔된 각 이미지 스트라이드(리조박스당 9개 스트라이드)를 4개의 세그먼트(30mm 길이 3개, 10mm 길이 1개)로 나누어 저장하십시오. 각 파일 이름은 스트라이드 번호(1~9), 파트 번호(1~4), 그리고 날짜 및 시간(YYYY.MM.DD HH:MM:SS)을 포함하여 고유하게 지정하십시오. 리조박스 전체 스캔에는 13.7 GB의 하드디스크 공간이 필요합니다.
    2. 영상 획득 및 분석.
      참고: 그림 6 이미지 획득, 분할 및 분석 단계를 보여줍니다.
      1. 영상 획득은 최적의 영상 품질을 위한 카메라 설정 선택과 스캔 파라미터 정의로 구성됩니다.
        1. 카메라 소프트웨어에서 라이조박스(rhizobox) 스캔과 화이트 표준물질(white standard)에 대한 카메라 통합 시간을 결정하십시오.
          1. 이미징 GUI를 열고 뿌리가 있는 라이조박스(rhizobox) 위치로 카메라를 이동시키십시오.
          2. 밝은 대상(예: 뿌리)을 향한 카메라의 적분 시간을 조정하여, 소프트웨어에 표시되는 히스토그램에서 카메라 전체 동적 범위의 약 85%가 사용되도록 합니다. 카메라 포지셔닝 시스템을 이동시켜 화이트 표준물을 대상으로 설정한 후 동일한 과정을 반복하십시오. 그런 다음 카메라 소프트웨어를 종료하십시오.
        2. Matlab Imaging GUI를 열고 현재의 rhizobox 스캔을 위한 모든 설정을 수행하십시오. 여기에 보고된 데이터의 경우, 다음 설정을 사용하십시오:
          적분 시간 화이트 표준: 10
          라이조박스 통합 시간: 40
          분광 해상도: 전체 해상도 (즉, 2개의 좁은 범위 분광 밴드)
          전체 공간 해상도(픽셀 크기 0.1mm)
          1. 매 이미징 실행 전(예: 하루 한 번)에 다크 표준(dark standard)과 화이트 표준(white standard)을 획득하십시오. 다크 표준은 카메라 노이즈를 나타내며, 화이트 표준은 최대 반사율을 나타냅니다. 이 데이터는 전처리 과정 중 이미지 정규화에 필요합니다.
          2. 라이조박스 전체를 스캔할지 또는 일부만 스캔할지를 정의하십시오. 본 사례에서는 라이조박스 전체를 이미징합니다. 그 후 스캔을 시작하십시오.
      2. Matlab 스크립트를 사용하여 이미지를 처리하십시오. 스크립트에 의해 수행되는 작업들이 설명되어 있습니다.
        참고: 스크립트는 현재 문서화되지 않은 버전이며 교신 저자로부터 받을 수 있습니다. 적절한 문서화 작업이 완료된 후, 교신 저자의 소속 기관 웹사이트(www.dnw.boku.ac.at/pb/)에서 다운로드할 수 있을 예정입니다.
        1. 뿌리가 포함된 라이조박스 중심으로부터 4개의 스트라이드 부분을 병합하여 전체 이미지 스트라이드를 구성하십시오.
          참고: 이 단계에서는 전체 라이조박스(즉, 9개 스트라이드 전체)의 분광 이미지를 사용할 필요가 없으며 권장되지도 않습니다. 파일 크기로 인해 Matlab의 각 계산 단계가 매우 오래 걸릴 수 있으며, 하나의 중앙 스트라이드에 포함된 정보만으로도 이미지 분석의 초기 단계에는 충분하기 때문입니다.
        2. 획득한 암표준(dark standard) 및 백색 표준(white standard)을 사용하여 이미지를 정규화하되, 스캔 중 파일에 자동으로 저장되는 백색 표준 및 리조박스(rhizobox) 스캔의 서로 다른 적분 시간을 고려하십시오.
        3. 선택적으로 평활화 필터를 적용하여 이미지의 노이즈를 제거하십시오. 현재 스크립트는 3x3 커널 중간값 필터링과 다중 산란 보정을 제공합니다. 여기에서 제시된 이미지 평가에는 필터가 적용되지 않았습니다.
        4. 모든 기록된 분광 밴드에서 이미지를 표시하여 1차적인 통찰을 얻고, 관심 영역을 선택하기 위해 표시할 파장을 결정하십시오.참조. 이미지 분할).
      3. 다음 단계들이 포함된 별도의 스크립트를 사용하여 뿌리와 토양 배경 사이의 세그멘테이션을 수행하십시오.
        1. 분할을 위한 분광 특성을 찾기 위해 뿌리와 토양의 관심 영역(ROI)을 선택하십시오. 이전에 뿌리와 토양 간의 대비가 좋은 것으로 확인된 파장에서 표시된 이미지 상에 자유형 선택 도구를 사용하여 ROI를 표시하십시오. 여기서는 뿌리에 세 개의 ROI(노후 및 신생 측근, 원뿌리)를, 토양에 두 개의 ROI(건조 지역, 습윤 지역)를 설정하십시오.
        2. 선택된 ROI와 함께 사각형을 표시하고 나머지 부분은 검은색 마스크로 처리하며, 모든 파장에서 선택된 ROI 이미지를 시각화하십시오.
        3. 스펙트럼 강도가 0인 픽셀(검은색 픽셀)을 포함하는 이미지 매트릭스의 모든 행을 제거하십시오.
        4. 분할(segmentation)을 위해 뿌리와 토양 관심 영역(ROI)을 하나의 전경(뿌리) 및 하나의 배경(토양) 행렬로 병합하십시오.
        5. 뿌리 전경과 토양 배경 사이의 최적의 분리도를 제공하는 분광 밴드(단일 스펙트럼 강도 또는 분광 비율)를 탐색함27Bhattacharyya 거리를 사용하여 뿌리와 토양의 결과 픽셀 히스토그램 간의 차이를 정량화하십시오.28.
        6. 히스토그램을 구분하는 임계 강도 값을 선택하십시오.
        7. 선택한 임계값을 원본 이미지에 적용하여 이진 이미지를 생성합니다. 이를 통해 임계값보다 강도가 낮은 모든 픽셀은 0으로, 강도가 높은 픽셀은 1로 설정됩니다(스크립트에 의해 자동으로 수행됨).
        8. 이진 이미지를 tiff 파일로 저장하십시오.
      4. 이진 이미지를 열고 뿌리 특성을 분석하십시오. (i)를 선택하십시오. 회색조 수준 기반, 그리고 (ii) 검은색 배경의 창백한 뿌리 ~ 내에 뿌리 & 배경 구분 메뉴 및 사용법 전역 강도 임계값 (이미지는 이미 이진화되었습니다).
      5. 하이퍼스펙트럼 데이터로부터 수분 함량을 매핑하기 위해 보정 데이터 세트를 확보하고, 이를 라이조박스(rhizobox) 이미지에 보정 식에 적용하십시오.
        1. 폴리스티렌 시트를 사용하여 라이조박스(rhizobox)를 5cm 간격의 구획으로 나누어 토양(동일한 배지 및 밀도)으로 채웁니다.b (실험에 사용된 대로) 서로 다른 함수율에서(그림 8).
        2. 토양과 혼합할 각각의 물 양을 계산하고 구획을 채웁니다(전체 rhizobox에 대해 1.3절에서 설명한 것과 동일한 절차).
        3. 식재된 리조박스(rhizobox)에 사용한 것과 동일한 설정으로 캘리브레이션 리조박스를 스캔하십시오.
        4. 스크립트를 사용하여 다음 단계를 수행하십시오.
          1. 수중 교정 박스에서 얻은 보폭의 네 부분을 하나의 보폭으로 병합하고, 암전 및 백색 표준물질을 사용하여 이를 정규화하십시오.
          2. 함량별로 수분 함량이 다른 각 구획에서 직사각형 상자를 선택하여 구조체 배열에 저장하십시오.
          3. 수분 함량 구획을 가장 잘 구분하는 분광 특성을 결정하십시오. 이는 인접한 수분 함량의 평균 스펙트럼 간 강도 차이의 전역 최댓값을 찾는 탐색 알고리즘을 통해 수행됩니다.
          4. 보정용 라이조박스의 각 수분 함량 구획에 대해 이 특성의 평균 스펙트럼 강도 값을 계산하십시오.
          5. 직접 측정한 함수량과 그에 해당하는 분광 정량자 사이로 회귀 방정식을 도출하십시오.
          6. 리조박스(rhizobox) 이미지에서 뿌리로 분류되지 않은 각 픽셀과 위에서 결정된 수분 함량과 가장 밀접한 관련이 있는 분광 특성(밴드)에 대해 회귀 방정식을 적용하십시오.

광학 분석을 위한 분광계 설정; 할로겐 조명, 라이조박스, 전원/모션 제어 장치.
그림 5: 초분광 뿌리 스캐너.
스캐너의 주요 구성 요소가 표시되어 있습니다. 작은 사진은 라이조박스(rhizobox)를 촬영하는 동안의 카메라 모습을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

초분광 이미지 분석 도식: 획득 설정, 분할, 수분 매핑, 화학계량학적 분석.
그림 6: 초분광 뿌리 이미징 단계.
하이퍼스펙트럴 뿌리 영상 촬영은 (i) 영상 획득, (ii) 영상 분할, (iii) 스펙트럼 데이터 분석의 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

종자 발아 실험; 폴리스티렌 및 발아지 상의 수분 구배.
그림 7: 수분 보정용 라이조박스(Rhizobox).
rhizobox는 폴리스티렌 시트로 구분되어 수분 함량이 서로 다른 배지가 채워진 구획들로 구성되어 있습니다. 건조 구획에 배치된 발아지는 토양 입자가 인접한 구획으로 씻겨 들어가지 않도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

5. 응용 사례

참고: 정량적 뿌리 정보는 식물 표현형 분석(품종 비교) 및 식물 생리학 연구 맥락에서 적용됩니다. 다음의 지상부 데이터는 이러한 사례를 예시하기 위해 보고되었습니다.

  1. 엽면적: 실험 중 선택된 단계에서 잎의 길이와 너비를 대리 지표로 사용하여 비파괴적으로 엽면적을 측정합니다. 또는 캐노피 이미지를 사용할 수 있습니다29.
    1. 실험 종료 시, 엽면적계를 사용하여 잘라낸 잎의 면적과 함께 잎의 길이 및 너비를 측정합니다. 데이터 쌍에 회귀 방정식을 적용하여 비파괴 측정법을 보정합니다.
  2. 건물량: 실험 종료 시, 가위로 식물을 절단하여 지상부 건물량을 측정하며, 오븐에서 105 °C로 24시간 동안 건조합니다.
  3. 기공 전도: 엽포로미터를 사용하여 기공 전도도를 측정합니다. 측정 전, 센서가 주변 환경 조건과 평형을 이룰 수 있도록 장치를 기후 챔버 내에 최소 1시간 동안 보관하고, 기후 챔버의 주변 설정이 변경될 때마다 장치를 보정합니다. 식물당 최소 3장의 잎에서 측정값을 얻습니다.

결과

RGB 및 HS 이미징 기반의 뿌리 분할에 대한 예시 결과가 제시됩니다. 분광 이미징의 경우, 고해상도 수분 매핑의 예시가 제공됩니다. 마지막으로, 이미지 기반 뿌리 데이터가 적용되는 과학적 맥락을 보여주는 결과가 제시됩니다.

RGB 기반 뿌리 측정

그림 8은 설탕무 품종 Ferrara의 RGB 뿌리 이미지 시계열을 보여줍니다. 해당 이미지들은 라이조박스(rhizobox)의 불균일한 조명으로 인한 일부 아티팩트를 나타내며, 왼쪽 가장자리를 따라 더 밝은 영역이 보이고 상단 이미지와 하단 이미지의 겹치는 영역에서 서로 다른 밝기가 관찰됩니다.

RGB 뿌리 성장 연구, 사탕무 'Ferrara', 20-35일차, 타임랩스 분석, 성장 도표.
그림 8: RGB 이미징을 통한 뿌리 성장 시계열.
사진은 파종 후 경과일(DAS)이 서로 다른 사탕무 품종 Ferrara를 보여줍니다. 이미지의 왼쪽 부분과 상단 및 하단 이미지 사이에 조명이 균일하지 않아 발생한 일부 아티팩트가 관찰됩니다. 스케일 바, 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9는 파종 후 일수(DAS) 35일째인 Ferrara 품종에 대해 색상 임계값 설정을 기반으로 한 뿌리 분할의 세부 사항을 보여줍니다. 참조용으로 (그림 9A), 그래픽 태블릿을 사용하여 모든 뿌리를 수동으로 추적한 이진 이미지가 사용되었습니다. 완전히 발달하여 밀집된 사탕무 뿌리 시스템 전체를 수동으로 추적하는 데 소요된 시간은 약 4시간이었습니다. 그림 9B는 오래된 측근이 존재하는 이미지 상단의 선택된 영역을 상세히 보여줍니다. 이 영역에서는 여러 뿌리 축이 색상 임계값으로 분류되지 않았습니다. 반대로 흰색의 어린 뿌리가 지배적인 하단(그림 9C)에서는 색상 기반 분할을 통해 모든 뿌리 축이 적절하게 분류되었습니다. 이진화된 뿌리 시스템(그림 9D)의 왼쪽에는 조명 아티팩트로 인한 검은색 영역이 나타나며, 이는 정량 분석을 실행하기 전 제외 영역으로 정의되었습니다. 그림 9E는 DAS 35일째 Ferrara의 RGB 이미지 중 레드 채널에서 선택된 특성(뿌리 대 토양)의 해당 픽셀 히스토그램을 보여줍니다. 뿌리 픽셀(파란색)은 밝은 어린 측근, 어두운 오래된 측근, 그리고 주근에 해당하는 세 개의 피크를 뚜렷하게 보여줍니다. 오래된 측근과 토양 배경 간의 중첩이 매우 강하여, 일부 뿌리 축이 분류되지 않는 결과로 이어졌습니다(참조 그림 9B).

뿌리 유형의 히스토그램 분석 및 토양 구분을 포함한 RGB 색상 기반 뿌리 분할 도식.
그림 9: 색상 임계값을 이용한 뿌리 분할.
(A) 그래픽 태블릿을 이용하여 수동으로 분할한 뿌리 체계, (B) 상단과 [나머지 부분]에 분절이 불량하게 된 오래된 뿌리 축 영역 (C) 이미지 하단에 적절하게 분할된 어린 축들이 있으며, (D) 색상 기반 임계값 처리(thresholding)를 통해 얻은 이진 이미지. (E) RGB 이미지의 선택된 특징에 대한 픽셀 히스토그램. 뿌리는 서로 다른 뿌리 유형이 표시된 파란색 막대로 나타냈으며, 토양은 빨간색 막대로 나타냈다. A와 D의 스케일 바는 2 cm, B와 C의 스케일 바는 1 cm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

수동으로 분할한 참조 이미지에서 정량화된 결과 총 가시적 뿌리 길이는 1534.1 cm인 반면, 색상 기반의 자동 분할에서는 총 뿌리 길이가 1427.6 cm로 나타났습니다.

여기 제시된 사례의 경우, UV 조명을 이용한 그레이스케일 이미지는 이점을 제공하지 않았으며 컬러 임계값 설정보다 성능이 낮았습니다(뿌리 길이: 1679.7 cm). 오래된 뿌리는 분할 수 없었으며, 아마도 UV 램프의 낮은 광강도로 인해 이미지에 더 많은 노이즈가 발생한 것으로 보입니다. 하지만 자동 형광이 강한 어린 뿌리와 밝은 배경 기질의 경우에는, 모래를 배경 기질로 사용한 다른 실험에서 얻은 이미지(그림 10)에서 볼 수 있듯이 UV 조명이 여전히 대안이 될 수 있습니다.

형광 현미경; 뿌리 구조; 왼쪽: 청색 톤의 공초점 이미지, 오른쪽: 명시야 이미지.
그림 10: 밝은 배경에서 뿌리를 시각화하기 위한 UV 조사.
석영사로 채워진 리조박스(rhizobox)에서 성장 중인 듀럼밀 뿌리 체계의 예시. 리조박스는 다음의 조명 조건하에 촬영되었습니다. (A) UV 광선 및 (B) 형광등(주광색). 스케일 바, 2 cm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

HSI 기반 뿌리 측정

그림 1은 세 개의 뿌리 ROI(오래된 측근, 어린 측근, 주근)와 두 개의 토양 ROI(리조박스의 상단 및 하단)에 대한 평균 스펙트럼을 보여줍니다.

뿌리 분광 분석 그래프, 정규화된 반사율 대 파장, 토양 및 뿌리 비교.
그림 1: 뿌리와 토양의 평균 스펙트럼.
뿌리(세 가지 뿌리 유형) 및 토양(리조박스의 상단과 하단)의 관심 영역(ROI)에서 얻은 스펙트럼. 뿌리와 토양 사이의 최적 분할 기준을 결정하기 위해 관심 영역을 선택한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

주근 및 어린 측근은 대부분의 스펙트럼 대역의 강도 면에서 배경과 상당히 다르다는 것이 분명합니다. 노년 측근의 경우 강도 차이가 훨씬 낮게 나타납니다. 시각적으로 추론할 수 있는 특징은 수분 흡수 영역(1450 nm) 주변의 스펙트럼 기울기가 서로 다르다는 점입니다. 이 영역에서 뿌리 스펙트럼의 기울기는 토양 스펙트럼에 비해 더 높습니다. 또한, 100 nm 주변 영역에서 주근 및 어린 측근의 스펙트럼 변화가 확인되지만, 이는 노년 측근에서는 나타나지 않습니다.

그림 12A는 전경-배경 대비가 가장 강한 분광 비율을 식별하는 검색 알고리즘의 결과를 보여줍니다. 1476 nm와 1076 nm에서의 스펙트럼 비율은 뿌리와 토양 사이의 최적의 분리 성능을 제공합니다. 뿌리 전경 및 토양 배경 픽셀에 대한 결과 히스토그램은 그림 12B에 나타나 있습니다. 일부 중첩이 있으나, 대부분의 픽셀은 토양 배경으로부터 명확하게 분리됩니다. 히스토그램에 바이모달 가우시안 곡선을 피팅하고 정량화를 위해 Bhattacharyya 거리를 사용한 결과, 7.80의 값이 얻어졌습니다. 3.0보다 높은 값은 신뢰할 수 있는 분리가 가능한 강한 이미지 대비를 나타냅니다28.

파장 강도 분석을 위한 스펙트럼 히트맵 및 히스토그램; 광학 방출 데이터 분석.
그림 12: 다양한 분광 밴드 비율에 따른 뿌리 전경과 토양 배경의 반사율 차이 및 분할에 사용된 분광 비율에서의 픽셀 히스토그램.
(A) 밝은 색상(노란색)은 전경과 배경 사이의 높은 대비를 나타내며, 어두운 색상(파란색)은 낮은 대비를 나타냅니다. 노이즈로 인해 처음 15개 밴드는 제거되었습니다. 빨간색 선은 대비가 가장 높은 밴드 비율을 나타냅니다. (B) 분절 분광비에서의 뿌리(청색)와 토양(적색)의 픽셀 히스토그램. 청색 막대는 뿌리를, 적색 막대는 토양을 나타냄. 강도 값은 분광 밴드 160 대 분광 밴드 49의 비율에 해당함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

이진 이미지(그림 13)는 히스토그램 거리27로부터 계산된 1.08 값의 전역 강도 임계값을 식별된 스펙트럼 비율에 적용하여 생성되었습니다. 이 이미지의 뿌리 길이를 분석한 결과 총 길이는 157.3 cm로 나타났으며, 이는 수동으로 추적한 참조 이미지와 비교하여 단 1.5%의 오차만을 나타냅니다.

신경망 구조도; 수지상 돌기 나무; 현미경 이미지; 뉴런 연결성 시각화
그림 13: 사탕무 품종 Ferrara의 뿌리 체계 이진 이미지.
이미지는 전역 스펙트럼 임계값을 적용하여 얻었습니다. 스케일 바(좌측 하단 모서리), 2 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

색상 기반 정보에 비해 분광 정보를 사용했을 때 뿌리 분절 성능이 향상되었지만, HS 이미징의 주요 목적은 화학계측 이미지 특성을 분석하는 것입니다. 이는 라이조박스 이미지의 수분 함량을 매핑함으로써 예시될 수 있습니다.

그림 14A는 서로 다른 수분 함량의 토양이 채워진 보정용 라이조박스(cf. 그림 7) 내 구획들의 평균 스펙트럼을 보여준다. 구획 간의 스펙트럼 형태는 유사하며, 즉 여기서는 스펙트럼 비율이 반드시 더 안정적인 분류 기준을 제공하는 것은 아니다. 따라서 인접한 수분 함량 간의 평균 차이가 최대화되는 단일 스펙트럼 밴드(1680 nm)에서의 강도가 최적의 분리 기준으로 확인되었다. 이 스펙트럼 파장에 대한 결과 픽셀 히스토그램은 그림 14B에 나타나 있다.

스펙트럼 분석 그래프; (A) 흡수 스펙트럼, (B) 습윤-건조 상태에 따른 강도 분포.
그림 14: 함수량 보정을 위한 분광 특성.
(A) 함수율이 서로 다른 보정용 라이조박스(rhizobox) 내 9개 수분 구획의 평균 스펙트럼; (B) 인접 구획 간의 평균 거리가 최대인 밴드 216에서 수분 구획의 픽셀 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

1680 nm에서의 평균 픽셀 강도와 측정된 수분 함량의 관계가 그림 15에 나타나 있습니다.

토양 수분 그래프; 지수, 선형 적합. 함수량 대 반사율; 포장 용수량, 영구 위조점.
그림 15: 분광 반사율과 체적 함수량의 관계.
그림은 측정된 함수율과 분광 반사율의 데이터 쌍을 보여주며, 가장 높은 함수율(빨간색 삼각형)을 제외한 데이터에 대해 피팅된 경험적 곡선(선형 및 지수형)이 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

분광 강도를 통해 더 높은 함수량을 구분하는 것은 어려워집니다. 약 0.30 cm3 cm-3까지의 함수량에 대해서는 높은 R2 값을 갖는 유의미한 회귀 분석(선형 또는 지수형)을 적용할 수 있습니다. 더 습한 토양 조건은 강도 값으로 신뢰성 있게 예측할 수 없습니다. 0.30 cm3 cm-3보다 높은 함수량에서 반응이 감소하며 반사율과 함수량 사이에 지수 관계가 나타나는 유사한 거동이 다른 연구30에서도 발견되었습니다.

수분 함량의 세밀한 매핑이 포함된 라이조박스(rhizobox) 이미지가 그림 16에 나타나 있습니다. 네 가지 측면에서 주목할 점이 있습니다. 첫째, 라이조박스의 뿌리가 있는 부분에서 수분 함량이 낮은 영역이 관찰됩니다. 둘째, 가장 강한 고갈 현상은 단일 뿌리 축의 인근에 집중되어 있습니다. 셋째, 표면에 뿌리 축이 보이지 않는 곳에서도 고갈 구역이 나타나는데, 이는 뿌리가 토양 속에 숨겨져 있는 영역임을 나타냅니다. 넷째, 추가적인 이미지 처리 없이 진행한 수분 매핑은 응집된 토양으로 인해 얼룩덜룩한 모습으로 나타납니다. 이는 응집체 규모에서의 불균일한 수분 함량 분포를 나타낼 수도 있지만, 표면 형태가 이미지 품질에 미치는 영향일 수도 있습니다. 화학계량학적 이미지 처리 기술은 스펙트럼 이미지에서 이러한 형태학적 영향을 극복할 수 있는 방안이지만31, 여기에서 사용된 Matlab 스크립트에는 아직 구현되지 않았습니다.

뉴런 구조 도식; 신경망 분석에서의 수지상 돌기 분지 상세도.
그림 16: 라이조박스(rhizobox)의 수분 함량 매핑.
진한 파란색은 수분 함량이 높은 영역을 나타내며, 녹색에서 적색으로 이어지는 영역은 수분 함량이 낮은 영역을 나타냅니다. 식물 뿌리가 이미지 위에 검은색으로 겹쳐져 있습니다. 스케일 바(왼쪽 하단 모서리), 2 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

응용 사례

그림 17은 이미지 분석을 통한 정량적 뿌리 특성과 지상부 측정값의 관계를 나타냅니다.

식물 성장 데이터 분석; 뿌리 길이, 표면적 비율, 건조 중량, 기공 전도 그래프.
그림 17: 뿌리 데이터의 전형적인 적용 사례.
(A) 그리고 (B) 표형 분석 맥락에서 지상부-지하부 식물 특성 분석에 사용되는 뿌리 정보를 보여줍니다. (A) 사탕무 품종 Ferrara의 뿌리 성장을 나타내며, (B) 잎-뿌리 면적 비율을 이용하여 라이조박스(rhizobox)에서 재배된 6종의 설탕무 품종을 비교합니다(1회 반복 실험 데이터). (C) 그리고 (D) 식물 생리학 연구에서 발견되는 특성 간의 기능적 관계입니다. (C) 엽면적 대 뿌리 면적 비율이 건물 생산 및 에 영향을 미치는 것을 보여줍니다. (D) 뿌리 표면적과 기공 전도도의 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 17A 및 17B는 지상부와 지하부의 포괄적인 식물 특성 분석에 중점을 둔 표현형 분석과 관련이 있습니다. 그림 17A는 사탕무 품종 Ferrara의 뿌리 성장을 보여줍니다(참조: 이미지의 경우 그림 8 확인). 뿌리 체계의 확장은 특정 생육 기간 동안 주어진 토양 부피를 탐색하는 품종의 능력을 나타냅니다. 그림 17B는 6가지 사탕무 품종의 잎 대비 뿌리 표면적 비율을 보여주며, 이는 식물의 공급(뿌리)과 수요(잎) 사이의 균형에 대한 기술자를 제공합니다.

그림 17C 및 17D는 생리적 연구에서 관심 대상인 기능적 관계의 사례를 보여줍니다. 그림 17C에서 잎-뿌리 표면적 비율은 실험 중 형성된 건조 중량과 관련이 있으며, 이는 건조 중량 축적의 제한 요인으로서 동화 표면의 지배적인 역할을 나타냅니다. 비교적 높은 R2 값에도 불구하고 유의성이 부족한 것은 여기서 사용된 쌍 데이터의 수(n=6)가 적기 때문입니다. 그림 17D는 뿌리 표면적이 더 넓은(흡수 능력이 향상된) 품종이 실험 과정 동안 평균적으로 더 높은 기공 전도도를 보인다는 것을 밝혀줍니다. 더 넓은 뿌리 면적이 수분 추출을 유지함으로써 기공 개방 시간을 연장하는 것으로 보입니다.

토론

프로토콜 루트 시스템 이미징 성장 하는 토양에 대 한 두 개의 상호 보완적인 접근을 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 실험 결과 대 한 중요 한 단계는 관측 창에 꽉 루트-토양 접촉을 제공 하 고 공기 간격을 방지 하는 전면 유리에도 동종 기판 레이어를 보장 하는 rhizoboxes의 작성 이다. 이것의 비교적 좋은 체질된 흙을 사용 하는 주요 이유는 < 2: 골 재 사이의 공 극으로 관찰 창에서 더 높은 표면 형태에 더 큰 집계 결과. 루트 팁 탈수의 위험이 높은, 외이 물 매핑31에 대 한 더 복잡 한 이미지 처리 기법을 필요합니다.

프로토콜의 수정 따라서 rhizoboxes의 향상 및 빠른 작성에 초점을. 현재 시간을 작성 하는 것은 상자 당 약 30 분입니다. 또한 측 및 더 나은 RGB 이미지에 대 한 조명 동질성을 최적화 하기 위해 수정에서 영상에 대 한 두 개의 유리창와 rhizoboxes의 사용은 테스트. 추가 하드웨어 확장 또한 평면 optodes32 rhizobox 시스템으로33 이미징 커패시턴스의 통합을 좋습니다. 그러나 이것이 현재 업그레이드 활동 넘어입니다.

소프트웨어 수정 퓨즈 상단 및 하단 RBG 이미지34자동 이미지 등록에 초점. Hyperspectral에 대 한 이미징 고급 자동된 기능 추출 SVMs35 테스트와 같은 더 민감한 감독된 대상 탐지 방법으로28 접근 한다. 그로 인하여 hyperspectral 데이터는 잠재적으로 여러 토양, rhizosphere 및 루트 속성36의 평가 대 한 허용. 개발 (세미)는 것 또한 건축 특성 (분기 주파수, 각 분기) 뿐만 아니라 rhizobox 루트에 따라 이미지 루트 시스템 분석기37 형태학 계량의 수정된 된 버전 (길이, 직경, 표면)에 대 한 소프트웨어 automatized.

3D 이미징 접근에 비해 프로토콜의 주요 제한은 표면 표시 루트 및 rhizosphere 속성 제한입니다. 그러나 그것은 보이는 루트 특성 전체 루트 시스템21에 대 한 신뢰할 수 있는 프록시는 증명 되었습니다. Rhizobox 기술은 전통적인 파괴적인 샘플링 (세척) 동적 성장 전체 루트 시스템 특성 대 표시의 관계를 확인 하려면 이미징의 끝에와 쉽게 결합 된다. 이 관계는 종21중 다 수, 파괴적인 샘플링 다른 작물 종으로 어떤 새로운 형질 시리즈에 대 한 표시 특성에서 신뢰할 수 있는 유추 되도록 것이 좋습니다.

여기에 제시 된 프로토콜의 주요 장점은 현실적인 성장 조건 (토양), 일시적으로 해결 RGB 이미지와 루트 기능 (예: 물 통풍 관) hyperspectral 화상 진 찰에서 chemometric 및 rhizosphere 데이터를 통해 유추에 대 한 상대적으로 높은 잠재적인 처리량의 조합입니다. 그로 인하여 방법 유추 제한 높은 처리량 경종 및 비-토양 루트 방법14, 그것은 부분적으로 덜 실험적인 복잡성과 고급 3D 방법15에 비해 높은 처리량으로 업무 프로세스에 대 한 깊은 형질 통찰력을 허용 하는 동안 이미지를 극복 한다.

곧 실험 프로토콜 mycorrhiza 루트 시스템 개발 및 토양 구조, 질소 및 탄소 관련 된 덮개 작물 종의 형질 루트 특성에 관해서는 뿐만 아니라 콩의 기능에의 효과 연구 하는 데 사용 됩니다 사이클링.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 프로젝트 번호 P 25190 B16 (가뭄 저항의 뿌리)를 통해 오스트리아 과학 기금 FWF에서 자금을 인정 합니다. Hyperspectral 이미징 인프라의 설립은 연방 정부의 낮은 오스트리아 (토지 러시아) K3-F-282/001-2012 프로젝트를 통해에 의해 재정적으로 지원 되었다. AGRANA 연구에서 받은 사탕 실험에 대 한 추가 자금 & 혁신 센터 GmbH (ARIC). 저자는 실험과 원고의 영어 교정 기술 지원에 대 한 크레이그 잭슨을 감사합니다. 우리 또한 인정 설립 RGB 영상 설치에 공헌한 Markus Freudhofmaier 조세 프 Schodl rhizobox 설치의 건설에 대 한 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r Bodenkultur실험용 빌더
LED 램프 ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
형광등 튜브 HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
UV 광 튜브 Eurolite 45cm 슬림 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 확장 버전 12.0 x 32어도비 시스템즈 소프트웨어 아일랜드 Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013리젠트 인스트루먼트 Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR 카메라XenicsXEN-000105
분광기 Imspector N25ESpecim
초분광 이미징 스캐너Carinthian Tech Research AG실험적 빌더초분광 이미징 스캐너 및 소프트웨어
Matlab R2106aMathworks의 설계 및 조립이미지 처리, 신호 처리 및 통계 및 기계 학습용 도구 상자 포함
AP4, PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C, 면적 측정기,LI-COR
BASF, 스티라뒤르, 폴리스티렌 시트, Obi, Baumarkt9706318다양한 유형의 폴리스티렌 시트 또는 수분이 다른 토양을 분리하는 기타 재료를 사용할 수 있습니다
, , ,, .

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