Method Article

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

DOI:

10.3791/56253

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1The Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Chemistry, Tsinghua University, 2Institute of Chemical Materials, China Academy of Engineering Physics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기는 키토 산 기반의 주 사용 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 손쉬운 준비에 설명 합니다. 하이드로 겔의 기계적 강도 및 3D 세포 배양에서의 응용 프로그램을 조정 하는 방법은 제시 하는.

Abstract

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프로토콜 키토 산 기반 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 준비 하기 손쉬운 효율적이 고 다양 한 메서드를 제공 합니다. 하이드로 겔 합성된 benzaldehyde 종료 폴리머 gelator와 글리콜 키토 산의 솔루션을 혼합 하 여 준비 되 고 hydrogels 실 온에서 몇 분에 효율적으로 얻을 수 있습니다. 글리콜 키토 산, 폴리머 gelator, 및 물 내용 사이 다양 한 비율에 의해 다른 겔 화 시간 및 강성 다목적 hydrogels 얻을 수 있습니다. 손상, 그것의 외관 및 계수, crosslinkages로 동적 것 유대의 가역 때문에 히드로 복구할 수 있습니다. 이 자체 healable 속성에는 히드로 주입 과정 후 필수 대량 하이드로 겔을 압착된 조각에서 자체 치유 될 수 있기 때문에 주사 될 수 있습니다. 하이드로 겔 멀티 동적 것 유대의 다른 평형 상태 때문에 많은 바이오-액티브 자극에 반응 이기도합니다. 이 히드로 바이오 호환으로 확인 됐다 고 L929 마우스 fibroblast 세포 포함 된 다음과 같은 표준 절차 이었고 셀 확산 쉽게 3D 세포 배양 과정에 의해 평가 되었다. 히드로 셀에 대 한 3D 환경의 생리 적 모방 이익이 되었다 다른 연구에 대 한 조정 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 다중 응답, 자체 healable 및 주 사용 속성을 함께 hydrogels 마약과 셀 미래 바이오-의료 응용 프로그램에 대 한 여러 사업자로 잠재적으로 적용할 수 있습니다.

Introduction

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Hydrogels는 많은 양의 물과 부드러운 기계적 성질, 가교 된 고분자 재료 그리고 그들은 많은 바이오-의료1,2에 사용 되었습니다. Hydrogels는 vivo에서세포에 대 한 생리 적인 환경에 매우 비슷한 부드럽고 젖은 환경을 제공할 수 있습니다. 따라서, hydrogels 3D 셀 문화3,4건설 하는 가장 인기 있는 기계 중 하나가 되고있다. 2D 페 트리 접시 세포 배양에 비해, 3 차원 세포 배양 한 세포 외 기질 (ECM) 유사 문의 확산 및 감 별 법 목적5조립 하는 셀에 대 한 microenvironment 제공 하 신속 하 게 전진 했다. 또한, hydrogels 천연 고분자를 포함 하 수 증식 및 분화3셀 바이오 호환 및 추진 환경을 제공 하 고 있다. 합성 중합체에서 파생 된 Hydrogels 동물 유래 단백질 이나 바이러스 같은 복잡 한 영향을 제외 그들의 간단 하 고 명확한 구성 선호 됩니다. 3D 세포 배양에 대 한 모든 히드로 후보자, 중 hydrogels 쉽게 준비 하 고 일관 된 속성을 항상 선호 됩니다. 하이드로 겔의 다른 연구 요구 사항에 맞게 속성 조정 시설 뿐만 아니라6으로 중요 하다.

여기 우리는 글리콜 키토 산 기반의 히드로 동적 것 화학, 3D 셀 문화7다목적 히드로 플랫폼을 사용 하 여 손쉬운 준비 소개. 이 방법에서는, 잘 알려진 바이오 호환 글리콜 키토 산 하이드로 겔의 네트워크의 프레임을 설정 하는 데 사용 됩니다. 아미노 그룹은 hydrogels8의 crosslinkages로 동적 것 유대를 형성 하는 폴리머 gelator로 종료 benzaldehyde 폴 리 에틸렌 글리콜과 반응. 동적 것 유대 형성 하 고 기계적으로 조정 가능한 가교 된 네트워크9,,1011hydrogels 부여 주변 역 고 responsively 분해 수 있습니다. 높은 물 내용을, 바이오 호환 재료, 및 조정 가능한 기계적인 힘는 하이드로 겔 3D 셀 문화12,13L929 세포에 대 한 발판으로 성공적으로 적용 됩니다. 여기에 프로토콜 등 폴리머 gelator 합성, 히드로 준비, 셀 포함, 3D 세포 배양 절차를 자세히 설명 합니다.

히드로 동적 것 crosslinkages, 다중 응답 다양 한 바이오-자극 (산/pH, 비타민 B6 파생 pyridoxal, 단백질 papain, 등)을 포함 하 여, 히드로 것을 나타내는 때문에 여러 가지 다른 기능을 보여 줍니다. 8생리 적 조건 분해를 유도 한다. 하이드로 겔은 또한 자체 healable 고 주 사용는 히드로 최소한의 침략 적 주입 방법을 통해 관리 될 수 및 약물 및 세포 배달14,15에서 얻을. 추가 하 여 기능 첨가제 또는 특정 미리 디자인 된 폴리머 gelators는 히드로 얻고 자기, 온도, pH, 등16,17, 이행할 수 있는 같은 특정 속성에 호환 되는 요구 사항 연구의 넓은 범위. 이러한 속성 주 사용 하는 하이드로 겔의 잠재 능력 약물과 생체 외에서 그리고 vivo에서 생물 의학 연구 및 응용 프로그램에서 셀에 대 한 여러 사업자 공개.

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Protocol

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주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 증기 두건 및 개인 보호 장비 (보호 안경, 보호 장갑, 랩 코트, 등)의 사용을 포함 하 여 화학 실험을 수행할 때 적절 한 안전 관행을 사용 하십시오. 프로토콜 처리 기술 (살 균, 세포 복구, 셀 뿌리고, 세포 동결, 셀 얼룩, 등) 표준 셀 필요.

1. 준비의 Hydrogels

    benzaldehyde의 합성 종료 디 기능성된 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG DF)
      사전 건조 목이
    2. 폴리머
      1. 4.00 g PEG (MW 4000, 1.00 mmol), 무게 둥근 바닥 플라스 크 (250 mL)에 그것을 전송 하 고 톨루엔 (100 mL) 추가.
        참고: 다른 분자 무게를 가진 다른 구슬 하이드로 겔 형성을 위해 일할 수 있지만 다른 강성으로 이어질 것입니다.
      2. 열 열 총 (또는 핫 플레이트 약 40 ° C) 약간에 의해 모든 고분자를 분해 하는 데 도움이 솔루션. 모든 고분자 분해 후 모든 용 매를 제거 하는 증발 기를 사용 합니다. 이 분해 과정과 건조을 고분자 말린된 나무 못을 두 번 반복.
        주의:이 주의 연기 후드에서 수행 되어야 합니다. 톨루엔은 인화성.
    3. 말뚝의 benzaldehyde 종료 반응
      1. 플라스 크를 자력 및 tetrahydrofuran (THF, 100 mL)을 추가 하 고는 교 반기를 사용 하 여 말뚝을 분해. 모든 고체를 완전히 해산 솔루션 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6.0 mmol)과 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0.6 m m o l)을 순차적으로 추가.
      2. 추가 N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol)를 솔루션에 추가 건조 튜브 무수 CaCl 2 플라스 크에 가득. 실 온에서 교 반 아래 반응 계속 (~ 20 ° C) 약 12 헤 대 한
    4. 후 반응 과정
      1. 반응이 완료 된 후 진공 하 여 솔루션에서 생성 된 백색 고체를 필터링. 솔루션을 아래 흰색 고체 침전을 교 반 찬 diethyl 에테르 (500 mL)에 붓으십시오. 필터에 의해 모든 백색 고체를 수집 하 고 증기 두건에서 고체 건조.
      2. 는 THF에 흰색 고체를 다시 해산, 모든 불 용해성 백색 고체 필터링, 흰색 고체 침전을 신선한 찬 diethyl 에테르에 솔루션을 붓는 다 고 그것을 건조. 2 ~ 3 배,이 과정을 반복 하 고 진공 건조 오븐 (20 ° C, 0.1 mbar) 그들을 완전히 건조에 흰색 고체를 배치. 최종 제품으로 백색 분말을 수집: benzaldehyde 종료 DF 못.
  1. Hydrogels의 준비
    1. 튜브 (10 mL) DF 못 (0.11 g, 0.028 mmol, 0.22 g, 0.055 mmol, 0.44 g, 0.110 mmol)의 다른 양을 무게 이온된 수 (5.0 mL), 추가 하 고 소용돌이 또는 자력 교 반기를 사용 하 여 도움말 폴리머 분해.
    2. 글리콜 키토 산 (0.495 g, 10 -3 mmol x 6.18) 튜브 (50 mL), 이온된 수 (15.0 mL)에 녹이 고 몇 분 동안 소용돌이 사용 하 여 균질 키토 산 용액 (3 wt %).
    3. 글리콜 키토 산 용액 (0.2 mL, 3 wt %)와 추가 DF 못 솔루션 (0.2 mL) 순차적으로 튜브 (2.0 mL). 소용돌이 사용 하 여 몇 분에 솔루션 양식 hydrogels 균질 혼합. 다른 기계적인 힘의 hydrogels 수 있도록 표 1의 비율에 따라.
      참고: 튜브 반전 메서드를 사용 하는 하이드로 겔은 이미 형성 여부 확인.
  2. 유동성 분석
    1. 병렬 강판으로 회전 고분자에 유동성 분석 수행 (직경: 20 m m). 겔 화 테스트에 대 한 낮은 접시에 글리콜 키토 산 용액 (0.2 mL, 3 wt %)를 확산. 다음, 키토 산 솔루션 표면에 고르게 dropwise DF 못 수성 솔루션 (0.2 mL, 2 wt %)를 추가 하 고 신속 하 게는 피 펫과 혼합. 낮은 위 격판덮개를 아래로 하 고 테스트 시작
    2. 하이드로 겔에 대 한 ' s 강성 테스트를 원형으로 한 히드로 컷 (직경: 20mm) 저장 모듈러스를 측정 (G ') 주파수 분석 1% 변형에 대 한 값. 전형적인 G ' 6.3 rad s 값 − 1 표 1에 나열 됩니다.
      참고: 동적 본드는 히드로의 안정화를 위해 하이드로 겔 형성 후 하이드로 겔 0.5 h의 유동성 분석 수행.
    3. 는 하이드로 겔에 대 한 ' s 자체 healable 속성 테스트 조각 하는 하이드로 겔을 잘라 하 고 필수적인 부분에 자체를 함께 조각 수집. 원을 만들기 위해 하이드로 겔 조각 잘라 (직경: 20mm) 유동성 분석을 수행 하는 고분자에.

2. Hydrogels에 3D 세포 배양

  1. 히드로 겔 화 솔루션의 준비
    1. 세포 배양 (RPMI-1640, 2.0에에서 추가 무게 DF 말뚝 (0.44 g, 0.11 mmol) 무 균 튜브 (4.0 mL) mL), 및 소용돌이 또는 교 반기를 사용 하 여 고분자 폴리머 솔루션 (20 wt %)를 분해 하는 데 도움이. 주사기 (10.0 mL)에서 솔루션을 로드 하 고 다음 미크론 박테리아 못 벗어난 필터 (0.22 μ m)를 통해 그것을 전달 하 여 소독.
    2. 는 글리콜 키토 산 (0.165 g, 10 -3 mmol x 2.06) 무 균 튜브 (15.0 mL)에 무게, 셀 문화 미디어 (RPMI-1640, 4.0 mL), 그리고 글리콜 키토 산 용액 (4.0 wt %)를 폴리머 분해 있도록 소용돌이에 추가. 주사기 (10.0 mL)에서 솔루션을 로드 하 고 0.22 μ m 박테리아 못 벗어난 필터와 필터.
  2. Hydrogels에서 세포 배양
    주의: 수행 모든 세포 조직 문화 후드에서 관련된 절차. 살 균 기술의 기본 지식으로 예상 된다.
    1. 세포 현 탁 액
      1. RPMI-1640 년에 문화 L929 세포의 준비 중간 보충 10 %FBS, 5% 페니실린 (10 mL)는 페 트리에서 접시 (직경 10 cm), 및 37 ° C, 5% CO 2에서 품 어. 매체를 사용 하기 전에 매일 변경.
      2. Trypsin (0.025 w/v %)과 EDTA를 포함 하는 PBS를 가진 L929 세포를 수확 (0.01 w/v %), 다음 원심 (70 x g, 5 분) 하 고 다시 RPMI 1640 매체 (1.0 mL)에 셀을 일시 중지. 셀 피 세 보드의 표준 동작을 사용 하 여 계산을 수행 합니다. 다시 셀을 셀 농도 조정 중단 ~ 3.75 × 10 6 셀/mL.
    2. Hydrogels에 셀 캡슐화
      1. L929 세포 정지 (0.4 mL, 10 6 세포 mL -1 x 3.75) 글리콜 키토 산 용액 (0.4 mL) 튜브 (4.0 mL) 소용돌이 의해 혼합. 공초점 레이저 페 트리 접시의 중앙에 L929/글리콜 키토 산 용액 (0.8 mL)를 플라스틱 (직경 2.0 cm). DF 못 솔루션 (0.2 mL) 같은 그릇에 플라스틱 하 고 부드럽게 솔루션을 조합 하 여 하이드로 겔 형성 유도 플라스틱.
        참고: 페 트리 접시를 기울임으로써 하이드로 겔 형성 평가.
      2. 직접 세포 배양에 대 한 추가 히드로 위에 RPMI 1640 문화 미디어 (1.0 mL)의 추가 금액. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO 2)에서 포함 하는 셀 hydrogels (1.0 mL, 1.5 wt % 글리콜 키토 산, 4.0 wt %DF 못, 1.5 × 10 6 세포 mL -1)을 넣고 매일 매체를 변경. 하루 1, 3, 5, 및 7 셀 캡슐화 후에 셀 이미징에 대 한 준비.
    3. Hydrogels 주입 후에 3 차원 셀 후 문화, 준비 로드 셀 하이드로 겔 (1.0 mL 단계 2.2.2 참조) 주사기 (10.0 mL, 48 G 바늘)에. 하이드로 겔 형태의 후 천천히 confocal 영상에 대 한 페 트리 접시에는 히드로 주입. 위에 하이드로 겔 문화 미디어 (1.0 mL)의 추가 금액을 추가 하 고 매일 그것을 변경할. (37 ° C, 5% CO 2) 인큐베이터에서 배양 접시를 넣고 나중 이미징에 대 한 준비.
      주의: 검사 하 고 주사기의 안전 작업 프로토콜 따라.
  3. 세포 생존 능력 분석
    1. Confocal 관찰
      1. 2 번 PBS (1.0 mL)와 hydrogels 린스. Fluorescein diacetate (FDA, 0.5 mL, 0.05 mg/mL)와 15 분 동안 propidium 요오드 화물 (PI, 0.5 mL, 0.08 mg/mL) 솔루션 hydrogels 얼룩. 모든 용 매를 제거 하는 얼룩, 후.
      2. Hydrogels 488의 여기 파장에서 confocal 현미경을 사용 하 여 관찰 및 543 nm 라이브 시각화 및 죽은 세포, 각각. Z-스택 전체 셀의 동등한 배급을 확인 하기 위해 hydrogels의 모든 2 µ m 깊이 통해 받아.
        참고: FDA 얼룩 라이브 셀 동안 PI 죽은 세포 얼룩.
    2. 튜브 (4.0 mL)로 5 분 및 피 펫에 대 한 초 산 (HAc, 3 v %, 1.0 mL)와 히드로 (1.0 mL)을 저하. 원심 분리기 (70 x g, 5 분)에 의해 세포를 수집 하 고 다시 RPMI 1640 세포 배양 매체 (1.0 mL)에 셀을 일시 중단. 셀 보드를 계산 하는 혈액을 사용 하 여 계산 수행.

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Results

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하이드로 겔 준비 및 3D 세포 배양으로 그것의 사용에이 프로토콜의 프레 젠 테이 션이 회로도 그림 1에 제공 됩니다. 하이드로 겔의 내용과 다른 기계적인 힘으로 준비 하는 비율의 정보는 표 1에 요약 됩니다. 히드로 자체 healable 고 유동성 재산 저장 모듈러스 주파수 테스트 그림2에서 대 여 히드로 강성을 선물 한다. 셀 공초점 영상과 hydrogels 문화의 일 셀 번호 그림 3, 세포 생존 능력 및 세포 증식 3D 세포 배양을 통해 확인 되 게 됩니다. 그림 4 는 현미경 검사 법, confocal 이미지 및 세포의 확산 hydrogels 고통을 주입 및 후 문화에에서 포함 된 셀에 대 한 분석을 선물 한다. 높은 세포 생존 능력 및 세포 증식 세포는 히드로에 포함 된 파괴적...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

하이드로 겔이이 프로토콜 (그림 1)에 두 가지 주요 구성 요소: 자연 폴리머 글리콜 키토 산 합성 benzaldehyde 종료 폴리머 gelator DF 못, 두 생체 재료입니다. DF 말뚝의 합성 단계 수정 반응을 사용 하 여 제공 됩니다. 분자량 4000의 PEG 하이드로 겔 강성 뿐만 아니라 가용성, 수정 효율성의 문제에서이 프로토콜에 선정 되었다. 다른 기계적인 힘을 가진 hydrogels의 시리즈는 다른 고체 내용과 글리콜 키토 산 및 DF PEG 비율을 사용 하 여 준비 되었다. 균질 hydrogels 신속 하 게 형성 되었다 분에 실 온에서 겔 화 솔루션을 혼합 하 여 겔 화 속도 희석 솔루션에 의해 저하 될 수 있지만. 유동성 시험 다른 hydrogels의 기계적 강도 평가 하기 위해 고용 되었다. 저장 계수 (G') 그 hydrogels의 약 900에서 다 발견 된 Pa (소프트), 2100 Pa (중간) 4700 Pa (뻣 뻣 한) (표 1<...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 과학 재단의 중국 (21474057 및 21604076)에 의해 지원 되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
글리콜 키토산Wako 순수 화학 산업39280-86-990%의 탈아세틸화
4-카르복시벤즈알데히드상하이 알라딘  Bio-Chem Technology Co., LTD619-66-999%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide상하이 알라딘  Bio-Chem Technology Co., LTD538-75-099%
염화칼슘 무수상하이 알라딘  Bio-Chem Technology Co., LTD10043-52-496%
4-dimethylamiopryidine상하이 알라딘  Bio-Chem Technology Co., LTD1122-5899 %
폴리에틸렌 글리콜시노 팜 화학 시약5254-43-799 %
테트라 하이드로 푸란시노 팜 화학 시약109-99-999
% 톨루엔시노 팜 화학 시약108-88-399 %
에틸 에테르시노 팜 화학 시약60-29-799 %
아세트산Sino-pharm 화학 시약64-19-799%
무수 CaCl2Sino-pharm 화학 시약10043-52-499%
Fluorescein diacetateSigma596-09-899%
Propidium iodide Sigma25535-16-494%
RPMI-1640 배양 배지Gibco
태아 소 혈청Gibco
Trypsin-EDTAGibco0.25%
PBSSolarbio0.01 M
페니실린 스트렙토마이신 용액Hyclone10,000 U/mL
유변계TA 기기AR-G2
컨포칼 현미경Zeiss710-3channel
L929 셀ATCCNCTC 클론 929; L 셀, L929, 변형 L
증발기EYELAN-1100
48 게이지 바늘ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD48-게이지
현미경LeicaDM3000 B
현미경 소프트웨어Imaris
히트 건ConfuKF-5843 
페트리 접시NEST
의 파생물

References

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