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방법 논문

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

9.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56260

⸱

2017년 11월 8일

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

이 논문에서

요약

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

초록

배아와 유도 만능 줄기 세포는 자기 갱신 하 고 신체의 여러 세포 유형으로 차별화 수 있습니다. 만능 세포는 따라서 재생 의료에서 연구를 위한 탐 낼 고 현재 안과 질환, 당뇨병, 심장 질환 및 다른 질환에 대 한 임상 실험에서. 다양 한 응용 프로그램에 대 한 iPSC의 게놈을 조정 하기 위한 추가적인 기회를 제공 하는 편집 기술 CRISPR/Ca 시스템을 포함 하는 게놈의 최근 발전을 함께 하는 특수 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력 모델링, 유전자 치료, 몇 가지 이름을 차별화의 경로 바이어 싱 하는 질병을 포함 하 여. 사용 가능한 편집 기술, 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 CRISPR/Cas9 진 핵 게놈의 사이트 편집에 대 한 선택의 도구로 떠오르고 있다. CRISPRs, 저렴, 쉽게 액세스할 수 있으며 대상된 편집 공학에서 매우 효율적인. Cas9 nuclease 및 가이드 시퀀스 (20-메 르)는 3 뉴클레오티드 "NGG" protospacer-인접-모티브 (PAM) 보편적인 Cas9 바인딩 추적 RNA (함께 원하는 genomic 소재 시에 Cas9을 타겟팅에 대 한 인접 게놈 대상에 특정 시스템 요구 함께 라는 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA). 여기에 우리가 현재는 단계별 급지대 및 발자국 무료 iPSC의 효율적인 생성에 대 한 프로토콜 및 게놈 iPSC Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 단지를 사용 하 여 편집에 대 한 방법론을 설명. 프로토콜 편집 게놈 효과적 이며 Cas9 단백질 및 동시에 전달 하는 셀에 하나 이상의 대상에 대 한 사전 complexing sgRNAs에 의해 쉽게 다중화 될 수 있다. 마지막으로, 우리는 식별 및 원하는 수정 Ipsc의 특성화에 대 한 간단한 접근 방법을 설명합니다. 함께 찍은, 개요 전략 생성 및 iPSC 매니폴드 응용 프로그램의 편집을 능률적으로 예상 된다.

서론

요소를 프로그래밍의 overexpression에 의해 만능 상태로 인간 체세포의 재프로그래밍 질병 모델링, 재생 의료 및 약물 개발에 응용 프로그램과 함께 줄기 세포 연구를 혁명 있다. 여러 가지 비 바이러스 성 재활 방법을 프로그래밍 요소와 Ipsc, 생성의 배달을 위해 사용할 수 있지만 과정은 노동 집약 하 고 매우 효율적인1. 바이러스 성 방법 비록 효율적 바이러스 통합 및 tumorigenicity2,,34의 문제와 관련 된 있습니다. 이 원고에서 우리 제공 요소를 프로그래밍 하 고 그들의 유전자5에 어떤 바이러스 성 벡터 시퀀스의 통합 부족 발자국 무료 iPSC 라인 설정에 대 한 세포질 센다이 바이러스를 사용 하 여를 보고 합니다. 센다이 바이러스는 RNA 바이러스는 감염 후 세포 세포질 ~ 10 구절에서 희석 하 고 풍부 하 게, 신속 하 고 효율적인 프로그래밍6,7을 선도 재활 요소를 생성 합니다. 설립된 Ipsc 공급기 무료 중간 급지대 셀8로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 사용을 피하기 위해 쉽게 전환 수 다음.

프로그래밍, 센다이 바이러스 중재 한 개요 뿐만 아니라이 책에서 우리 또한 원하는 유전자 수정 연구에 대 한 무제한 인간 세포를 공급 하는 Ipsc 편집에 대 한 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 지금 노크 기능 및 녹아웃, 대규모 게놈 삭제, 유전자 검색, 유전자 공학에 대 한 심사는 풀링된 라이브러리를 포함 한 애플 리 케이 션의 광범위 한 사용 되는 Ipsc의 수정에 대 한 CRISPR/Cas9 기술 사용 수많은 모형 유기 체 및 유전자 치료9,,1011 이 기술은 포함 한다 연쇄 상 구 균 pyogenes의 단지의 형성-20-메 르 및 파생 Cas9 nuclease 가이드 RNAs 게놈 대상 시퀀스 3' 뉴클레오티드 protospacer 인접 한에 인접 한 자료 연결을 통해 대상 인식 하기 위해 모티브 (PAM) 시퀀스입니다. Cas9 nuclease 유도 이후에 주로 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 선도 삽입 또는 열려있는 독서 프레임에서 삭제 하 여 복구 하 고 그로 인하여 기능 팸 사이트에서 이중 좌초 휴식 ~ 3 뉴클레오티드 12유전자 녹아웃

인간의 췌 장 세포의 문화에 대 한 세부 정보를 포함 하는 우리의 향상 된 프로토콜, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 프로그래밍, 피더 무료 문화 이후 적응의 높은 효율을 달성 하기 위해 비활성화 mitotically에 그들의 프로그래밍 Matrigel, 설립된 Ipsc의 특성에 CRISPR 가이드 RNA 설계 및 준비, RNP 단지, 단일 셀 정렬 편집된 Ipsc의 클론 라인 생성 하, 쉽게 심사 및 편집, 식별 및 특성으로 Ipsc에 배달 단일 셀 복제합니다. 게놈 삭제 했다 Cas9 단백질 및 두 배 좌초 틈 (DSBs) 유도 하 두 CRISPR sgRNA RNP 복합물의 도입으로 효율적으로이 연구에서 생성 되 고 삭제는 개입의 세그먼트. 이 메서드는 열려있는 독서 프레임에서 삭제를 생성 하기 위한 두 명의 가이드를 사용 하 여에 대문자로 바꿉니다, 그리고 고효율의 낮은 수 선도 NHEJ의 클론 자동된 모 세관에 의해 그 특성화 될 필요가 그리고 클론의 쉬운 예비 심사 전기 이동 법 단위, 조각 분석기입니다. 이러한 효과적인 게놈 인간 줄기 세포 기반 질병 모델을 생성 하는 방법을 편집 곧 모든 줄기 세포 실험실에서 표준 및 일상적인 접근을 될 것입니다. 마지막으로, 정확한 게놈 편집 그것은 줄기 세포 질병 모델링 넘어가 수 만들고 잠재적으로 촉매 세포 기반 치료를 도울 수 있습니다.

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프로토콜

1. 프로그래밍 프로토콜

  1. 기본 인간의 췌 장 세포에서 인간 iPSC의 세대
    1. 6-잘 1.5 mg/mL 차가운 콜라겐 접시 하 고 1 h. 위해 37 ° C에서 젤 코트
    2. 접시 인간의 기본 췌 장 세포는 콜라겐에 Prigrow III 매체 (~ 1-1.5 × 10 5 셀)에 코팅 6 잘 플레이트에 하루 약 2.5 × 10 5 셀 또는 적어도 60%를 달성 하기 위해-2 초기 통로의 날에 잘 당 confluency 변환 (0 일)입니다. 첫 번째 연구를 위해 0에 원하는 confluency 하나 잘 얻을 적어도 2-3 웰 스 접시. 셀 하나 이상 잘 컨트롤 사용.
    3. 변환 (0 일)의 날, 따뜻한 불리고 수를 각 잘 물 욕조에 Prigrow III 매체의 1 mL. 수확 10 %FBS 매체 1 mL의 트립 신/EDTA를 사용 하 여 5 분의 1 mL에 한 컨트롤에서 셀 또는 셀 셀 수 수행을 분리 하는. 10 %FBS 매체, 추가 DMEM, 10 %FBS, 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 Pyruvate와 1% 비 본질적인 아미노산.
    4. 수 셀 카운터를 사용 하 여 세포의 생존 능력을 확인 하 고 계산 셀 번호 및 바이러스 titer에 따라 목표에 도달 하는 데 필요한 각 바이러스의 볼륨. KOS의 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 = 5, hc-Myc = 5, hKlf4 = 췌 장 세포에 대 한 3.
    5. 센다이의 해 동 한 세트 얼음-80 ° C 저장에서 튜브를 벡터와 신중 하 게 Prigrow III 매체의 1 mL를 각각 3 센다이 벡터 튜브의 계산 된 볼륨을 추가 37 미리 예 열 ° C. 피 펫 혼합 솔루션을 부드럽게. 6 잘 플레이트 한 잘 재설정된 세포 생성에 센다이 바이러스 성 벡터와 시험에 대 한 충분 하다.
    6. 셀에서 Prigrow III 중간 발음 하 고 천천히 셀을 포함 하는 우물을 재활 바이러스 혼합물을 추가 합니다. 5% CO 2의 습도 분위기 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어.
    7. 신중 하 게 세포에 바이러스 혼합물을 삭제 하 고 날, 변환 후 24 시간 신선한 Prigrow III 매체를 바꿉니다. 셀 d 5에 대 한 문화와 매체 대체 매일 변경.
    8. 5 일에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 10 cm 문화 요리 (1.3 x 10 6 셀/접시)에 MEFs을 준비. 하루 4까지 플라스 크 T175에서에서 MEFs를 성장 하 고 다음 날 5, 셀 13 또는 사용 상업 MEF 소스 뿌리기 전에 γ 방사선 소스에서 6000 래 드 셀 노출.
    9. 6 일에를 사용 하 여 세포 분리 솔루션의 1 mL 10 분 transduced 세포를 분리, Prigrow III 매체에서 MEF 요리에 그들의 모든 바위 억제제 (5 m m 재고, 최종 10 µ M) 접시 습도 atmosphe와 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어 다시 5% CO 2.
    10. 는 HESC 매체 다음날 Prigrow III 매체를 변경합니다. HESC 매체의 500 mL를 만들기 위한 추가 DMEM/F-12, 20% (v/v) 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 m m l-글루타민; 100 µ M 불필요 한 아미노산 그리고 100 µ M 2-mercaptoethanol. 지금 매일 부드럽게 매체 변경.
    11. 재설정된 셀을 나타내는 세포 덩어리 또는 식민지의 출현에 대 한 정기적으로 번호판을 관찰합니다. 변환 된 셀 조약돌 형태학 및 큰 핵 nucleoli 클론 집계를 형성합니다. 표시는 가능한 ' iPSC ' 식민지 성장을 위해 그들을 정기적으로 확인 하 고.
    12. 변환 후에 거의 4 주 식민지 따기 또는 전송에 대 한 준비가 단일 식민지의 전송에 대 한 이전과 1.3 x 10 6 셀/젤라틴 미리 코팅된 접시를 도금 하 여 24-잘 MEF 접시 준비.
    13. 분석 증명서에 희석 비율에 따라 aliquoting에 의해 (예를 들어, Matrigel) 준비 매트릭스 막
        . 4 6 잘 플레이트 (1 mL/음) 하 고 사용 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 실 온 (RT)에서 품 어 코트 DMEM/F-12의 25 mL에 한 약 수를 추가 합니다. 수동으로 그들을 발음 하는 hESC 매체의 500 µ L에서 MEF 접시에 전송 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 12-24 식민지를 선택 하십시오.
      1. 발음에 부드럽게 방해 또는 식민지를 분리 잘 미디어. 또한 매트릭스 코팅 막 24-잘 접시에 24-48 식민지를 선택 하십시오. 막 코팅 판에 대 한 24 시간에 대 한 mTeSR1 (10 µ M 바위 억제제 보충)를 사용 하 고 매일 변경. 식민지를 따기의 6-10 d, 내 클론 확장에 대 한 새로운 24-잘 / 12 잘 막 격판덮개 전송 준비가 되.
    14. 필요한 경우, MEFs 1mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분 동안에 식민지를 분리, 세척 두 번 hESC/mTeSR1와 막에 코팅 12 또는 24 잘 접시. 성장 단계의 1.1.12 매트릭스 막에 충분 한 강력한 식민지 경우 동결 iPSC 냉동 제조 업체에 따라 미디어를 사용 하 여 MEFs에 식민지 ' s 지침.
    15. 단계 1.1.12 20 분에 대 한 dispase의 500 µ L를 사용 하 여에서 막에 도금 강력한 식민지를 분리 하 고 접시 다시 매트릭스 막에 코팅 된 12-잘 접시. 수동으로 어떤 차별화 된 셀 이나 만능 클론 멤브레인에 대 한 풍부 하 게 오염 MEF 급지대 셀 다쳤어요.
    16. 는 멤브레인에 성장 하 여 6-8 d dispase 솔루션으로 앞으로 해리 하 여 플레이트를 코팅 하 고 6 또는 12 잘 플레이트 코팅 도금 신선한 막에서 작은 셀 집계 후 클론을 확장 합니다. 변경 mTeSR1 매체 매일입니다. 얼룩, pluripotency 마커 (OCT3/4 및 분석용 NANOG), FACS 만능 표면 마커 및 차별화 분석 실험의 immunostaining 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 재설정된 클론을 특징. 성장 하 고 CRISPR 다른 코팅 솔루션은 구체적으로 언급 하지 않는 한 위에서 설명 편집을 비롯 한 모든 분석에 대 한 막 코팅 판에 클론 문화.
  2. 인간의 특성 Ipsc
    1. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩
      참고: 상업 키트는 여기에 사용 됩니다. 자료 테이블을 참조 하십시오.
      1. 매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 상 상속 인간의 Ipsc 접시.
      2. 얼룩 프로토콜을 시작, 문화 매체를 발음 0.05 %1 x PBS의 1 mL로 세포 세척을 트윈 20 (PBST).
      3. 키트 셀에 수정 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 2 ~ 5 분 Aspirate 수정 솔루션에 대 한 RT에서 품 어 다음 PBST와 고정된 셀을 씻어. 건조 우물을 허용 하지 않습니다.
      4. 솔루션 A, B 및 C. 품은 어둠 속에서 (호 일 또는 어두운 컨테이너에 포장) 5 ~ 15 분에 대 한 실 온에서 전지를 혼합 하 여 잘 당 갓된 AP 기판 솔루션의 0.5 mL을 추가
        참고: 밀접 하 게 모니터 색상 변경 하 고 색상 일반적인 얼룩 피하기 위해 밝은 때 반응을 중지.
      5. AP 기판 솔루션 발음 및 1 x PBS의 2 mL로 두 번 우물을 세척 하 여 반응을 중지.
      6. 현미경 식민지를 관찰 하 고 4 배 또는 10 배 확대 어떤 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 카메라에서 이미지를 캡처.
    2. Immunostaining
      1. 매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 인간의 Ipsc 접시.
      2. PBS와 PBS에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 20 분에 대 한 수정에 짧게 한 번 셀 세척.
      3. 실시간에 PBS 가진 10 분 (3 x, 10 분)에 대 한 세 번 세척
      4. Saturate 일반적인 사이트 10% 일반 염소 또는 당나귀 혈 청 (NS, 동물 이차 항 체에 따라 발생에) PBS에서 실시간에서 40 분 세포내 epitopes만 포함 0.3 %PBS (TX/PBS) permeabilize 하에서 TX-100.
      5. 워시 실시간에 PBS 가진 3 x 5 분
      6. 5%의 신선한 솔루션에서 OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5와 SOX17 항 체 희석 PBS에서 NS 및 2 시간 또는 하룻밤 4 RT에서 품 어 ° c.
      7. 실시간에 PBS 가진 5 분 동안 배를 씻어
      8. 적절 한 보조 알 렉 사 Fluor 488 또는 5%에 568 항 체 희석 NS/PBS 및 실시간에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어
      9. 실시간에서 5 분 동안 배를 씻어
      10. 1 PBS에 DAPI 함께 품 어0 분 및 세척 2 x 사진을 찍어 실시간 사용 형광 현미경에서 5 분.
    3. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)
      1. 식민지까지 문화와 6 잘 플레이트에 플레이트 인간의 Ipsc 될 80% 합칠 (적어도 10 5 셀 /sample) 매일 mTeSR1 중간 변화.
      2. 실험 당일, 세포를 분리 하 고 프로토콜에 위에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액에 해리. 10 %FBS 매체와 세척.
      3. 0.5-1에서 resuspend 표면 표식에 대 한 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL
      4. 세포내 표식에 대 한 4%의 1 mL에 resuspend PFA/PBS 및 실 온에서 10 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 세척. 0.1%에서 resuspend TX/PBS와 얼음에 15 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 다시 세척. 0.5-1에서 resuspend 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL
      5. 10 %FBS 중간 포함의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 추가 50 µ L TRA-1-60, TRA-1-81 또는 SSEA-4 항 체의 양을 권장 하 고 30 분 1 헤 알을 품고합니다
      6. 10%로 두 번 씻어 FBS.
      7. Resuspend 10%의 100 µ L에서 FBS 매체 형광 이차 항 체를 포함 하 고 10 %FBS 적절 한 양의 10%에 resuspend로 두 번 30 분 세척에 대 한 품 어 FBS. 라이브 셀 propidium 요오드 화물 염료에 추가 하 여 죽은 세포에서 분화 될 수 있다 < 세포 apoptosis 과정 추정 1 µ g/mL.
    4. 트라이-혈통 차별화
      1. 10 6 Ipsc/10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체에 잘 x 1.5-2 2 6 잘 플레이트 씨앗.
      2. 성장 mTeSR1 중간 변화 매일 2-3 d 우물은 80-90%까지 confluent 세포 허용.
      3. Ectoderm 유도 신경 유도 매체 (님)는 제조업체에 따라 추가 ' 6 잘 플레이트의 2-3 스에서 s 지시.
      4. RPMI 인슐린 마이너스 2 %B27 보충 및 12 µ M를 포함 하는 매체 변경 접시 14의 2-3 스에서 mesoderm 유도 대 한 CHIR99021. 다음 24 h. 추가 5 µ M에 대 한 인슐린 마이너스 2 %B27 보충을 포함 하는 추가 유일한 RPMI RPMI 보통 2 %B27 IWP4 다음 24 h에 대 한 인슐린을 뺀 보충. 72 h 후 바꿉니다 미디어 2-3 디 cardiomyocytes 박동의 생성으로 이어지는 2 %B27 보충 포함 된 RPMI
      5. Endoderm 유도 MCDB 131 1.5 g/L 나트륨 중 탄산염, Glutamax, 포도 당 10 m m, 0.5 %BSA, 100 ng/mL GDF8, 및 24 h. CHIR99021 없이 동일한 매체에 문화에 대 한 CHIR99021의 5µM x 1와 보완에 6 잘 플레이트의 우물에서 매체 변경 2-3 d 15.
      6. 모든 3 개의 계보에 대 한 2 단계에서 immunostaining 프로토콜을 수행 하 고 관련 마커의 식 확인.

2. 게놈 인간의 편집 iPSC 사용 하 여 CRISPR Cas9

  1. 준비의 Cas9 단백질 및 sgRNA
    1. 메 마른 조건에서 microcentrifuge 튜브 Aliquot Cas9 단백질-80에서 튜브를 고정으로 aliquots를 저장 하 고 ° c.
    2. 는 유전자 당 RNAs MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/)에서 소프트웨어 또는 다른 CRISPR 가이드 디자인 webtool 기반 가이드를 대상으로 두 개의 디자인. 녹아웃을 생성 하는 유전자 (열려있는 독서 프레임 기준)의 첫 번째 또는 두 번째 엑손 대상. 두 그렇게 그들은 가깝게 잘라 가이드 선택 (30 ~ 100 bp 간격) 우리가 쉽게 뇌관을 심사의 동일한 세트를 사용 하 여 삭제를 시각화 수 있습니다. 더 높은 품질 평가 점수 및 오프 대상 사이트의 낮은 수를 기반으로 소프트웨어 출력에서 가이드를 선택 하십시오. 상영 프로그램 뇌관 폭발 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용 하 여 뇌관 디자인. 100 이상 이어야 한다 뇌관 심사는 Cas9에서 bp 사이트 잘라내어 PCR 제품 크기 PCR에 의해 쉽게 확대를 위한 400-700 bp 사이 여야 선호.
    3. 디자인 두 개의 상호 보완적인 sgRNA 올리고 사이트 양쪽 끝을 잘라 Bsa1로 DNAs (19-22 뉴클레오티드 길이에 따라 가이드 시퀀스). 올리고 DNAs 상업적으로 합성 및 이중 가닥 DNA를 단련 될 수 있습니다. 어 닐 링, 추가 1 µ L 각 100 µ M 가이드, 버퍼 (10 mM Tris, pH7.5 ~ 8.0, 50 m m NaCl, 1 mM EDTA) 어 닐 링의 25 µ L 및 물 23 µ L. Thermocycler 2 분 및 그 후에 점차적으로 25 ° C 이상 45 분을 냉각에 대 한 95 ° C에서 시작 하는 프로그램에서 품 어
    4. 클론 Bsa1 제한 효소로 결과 조각의 2 µ L는 T4 DNA 리가 제조자에 의하여를 사용 하 여 Cas9 바인딩 사이트와 사내 T7 발기인 pCR2.1 벡터의 1 µ L를 소화 ' s 프로토콜.
    5. 복제 된 DNA 파편을 연속 하 고 생체 외에서 T7 키트를 사용 하 여 단일 가이드 RNAs를 생성 하는 클론을 녹음 충실도 설정. 상업적인 키트 sgRNAs를 정화 하 고 RNase 무료 물에 elute. RNA 농도 확인 하십시오.
  2. Transfection hiPSCs의
    1. 셀 40-50% 합칠 때까지 위에서 설명한 대로 hiPSCs mTeSR1 매체에 문화.
    2. 2 시간 nucleofection, 전에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTeSR1 매체의 2 mL 매체 바꿉니다.
    3. 1 시간 후, 준비 대상 웰 스 nucleofected 셀 발음 막, 위, 12-잘 접시에서 준비 하 고 10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체의 prewarmed 1 mL을 바꿉니다. 부 화에 대 한 37 ° C에서 유지.
    4. 준비 nucleofection 마스터 믹스 (샘플에 따라 적절 하 게 스케일) P3 1 차 셀의 16.4 µ L 추가 하 여 각 샘플에 대 한 보충, 보충 1 nucleofector 키트, Cas9 단백질의 0.5 µ g의 3.6 µ L 및 각 sgRNA의 0.5 µ g 반응 양 당 22 µ L에서. pMAX GFP 벡터는 또한 제조자에 의하여 nucleofected ' 대략 iPSC transfection 효율 추정 하 셀에 s 권고.
    5. 씻어 각 iPSC 우물에서 바위 억제제를 포함 하는 매체를 발음 후 RT PBS의 2 mL와 잘. 다음 발음 PBS, 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어
    6. 는 MTeSR1 매체의 3 mL에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 위아래로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 플라스틱. 15 mL 원심 분리기를 전송 해리 셀 튜브 포함 5 mL mTeSR1 매체.
    7. 셀 셀 카운터 하 고 총 볼륨 0.5 x 10 6 셀/transfection에 필요한 계산. 원하는 양의 셀에 15 mL 원심 분리기 튜브, RT에 5 분 동안 200 x g에서 원심 하 고 상쾌한 발음.
    8. X 10 6 세포 transfection 마스터 믹스 4 단계에서 준비의 22 µ L에서 0.5의 각 단위를 resuspend. 신속 하 게 nucleocuvette 스트립의 한의 중앙 챔버로 셀을 전송. 프로그램 CB150를 사용 하 여 nucleofector 장치 및 nucleofect 세포로 스트립을 놓습니다.
    9. Nucleofection, 후 신속 하 게 nucleofected 셀의 각 음에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTESR1 매체의 80 µ L을 추가. 부드럽게 위아래로 pipetting 혼합.
    10. 부드럽게 웰 스 판의 막 미리 코팅 12-잘 록 제 3 단계에서 준비 된 mTeSR1 매체를 포함 하는 스트립에서 셀 전송.
    11. 후 1 d 록 억제제 없이 신선한 mTeSR1 매체를 변경 합니다. 수확 nucleofection 단일 셀 정렬 후 2-3 d 세포.
  3. 타겟된 hiPSCs의 단일 셀 격리
    1. 정렬, 전에 1 일 시드 2 x 10 6 셀/젤라틴 코팅 접시 10 %FBS 매체에 의해 96 잘 MEF 접시를 준비. 클론의 약 70-80 %nucleofection 후 생존과 2-3 MEF 접시 각 편집 실험을 위해 준비 될 수 있다.
    2. 100 보충 hESC 매체 (앞에서 설명한) 매체 변경 다음 하룻밤 인큐베이션 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (억제제 단일 세포 생존 능력을 향상 시키기 위해 미디어에 추가), 그리고 접착 홍보 5 mg/mL fibronectin.
    3. MTeSR1 매체 1 보충을 mTeSR1에서 12-잘 접시에 hiPSCs에 매체를 대체할 단일 셀 정렬 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 x SMC4.
    4. 는 HiPSCs에서 매체를 발음 하 고 부드럽게 PBS로 세포를 씻어. 각 잘에서 세포 분리 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 PBS 발음 후 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 세포 현 탁 액을 각 영역 (unsupplemented) mTeSR1의 1 mL을 추가 하 고 pipetting 아래로 부드럽게 여러 번 여 생성.
    5. 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 실시간 Aspirate 상쾌한에 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 고 resuspend mTeSR1의 1 mL에 셀.
    6. 1 단계에서 준비 된 96 잘 접시의 한 셀에 개별 잘 살 균 조건 하에서 100 m m 노즐 셀 정렬을 사용 하 여 단일 셀에 셀 정렬.
    7. 정렬 후 4 일 1 보충 하는 hESC 매체와 문화 매체를 대체이 시점에서 식민지 형성 명백한; 해야 x SMC4.
    8. 정렬 후 8 일 hESC 매체와 2에 대 한 문화 매체를 대체 디
    9. 1 mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분에 대 한 식민지를 분리 하 고 록 억제제와 mTeSR1에서 24-잘 막 코팅 접시에 그들을 전송. 단일 셀 클론 성장 하 고 복제 또는 그들을 확장 후 그들의 게놈 DNA를 추출 하자. 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 대상 DNA PCR에 의해 증폭.
    10. 사용 조각 분석기 키트 젤/염료를 통해 그들을 실행 하 여 모든 클론의 PCR 증폭된 대상 게놈 지역의 초기 심사에 대 한 제조 업체에 따라 믹스 ' s 지시. 예제와 함께 실행 되는 적절 한 사다리 그것을 비교 하 여 소프트웨어 PROSize에서에서 결과 조각 크기를 예상 하고있다. 예상 순서 ' 편집 ' 복제 및 시퀀싱 데이터를 확인 하는 편집 또는 삭제 분석.
    11. Monoallelic 및 biallelic 클론 차별화에 대 한 증폭 PCR와 pJET1.2 벡터에 복제 편집된 시퀀스. 시퀀싱에 대 한 적어도 8-10 클론 보내고 하나 또는 둘 다 대립 유전자에서 편집 확인 순서를 확인 하십시오.
    12. 성공적으로 타겟된 iPSC 클론 유전형을 통해 확인 되었습니다, 일단 검사는 그들이 하지 pluripotency 손실 또는 염색체 이상이 과정을 통해 얻은 것인지.

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결과

이 책에서 우리 통합 또는 발자국 무료 센다이 바이러스 벡터를 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서 iPSC의 세대에 대 한 간단 하지만 효율적인 프로토콜을 따라 했습니다. 그림 1A 이 재활 프로토콜의 도식 적인 표현을 보여준다. Prigrow III 매체에 경작 하 고 센다이 바이러스 위에서 설명한 대로 불리고 인간의 췌 장 세포가 상업적으로, 구매 되었다. 췌 장 세포를 형성 하는 불리고 스핀 0, 당일 센다이 바이러스 변환 후 ~ 5 일에 대 한 모든 형태학 상 변화를 보여주지 않았다 하지만 다음 더 큰 핵과 nucleoli 반올림 될. 일부 초기 식민지 주 후 변환 후 보였다 하지만 그들은 했다 하지, 우리의 경험, 이러한 식민지 신속 하 게 분열 하 고는 일반적으로 '초기 부분적으로 재설정된 셀'을 강력한 식민지를 설정 하지 않습니다. 약 10-15 일 후 변환, 작은 밝은 식민지 관찰 했다 고 성장 (

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토론

Ipsc 인간의 체세포의 재프로그래밍 기본적인 생물학 연구, 맞춤된 의학, 질병, 약물 개발 모델링과 재생 의학16의 분야에 큰 향상을 제공 하고있다. 호스트 게놈으로 통합의 위험 바이러스의 사용을 필요로 하는 인간의 iPSC 세대의 많은 현재 및 널리 사용 되는 방법 또는 episomal 벡터와 낮은 효율을 프로그래밍. 여기, 우리는 Ipsc 공급기 무료 센다이 바이러스, ' 무료 '와 효율적인 프로그래밍 리드와 인간의 췌 장 세포에서 생성 하는 효율적인 방법 제시. 결과 인간의 Ipsc는 무료로 바이러스 transgenes, pluripotency를 유지 하 고 알 수 없는 외 인 요인의 사용을 방지. 그래서 우리는 피더 세포에 기본 췌 장 세포를 재설정 다음 식민지 확장, 문화 및 특성에 대 한 막 급지대 무료 이동 Ipsc 공급기 무료 조건에서의 세대 낮은 재활 효율이 있다. 이러한 기술의 융합 신뢰할 수 있는 안정적이 고 보다 효율적인 iPSC 프로그래밍을 제공합니다.

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공개 사항

BT는 쳐도 생물 과학 주식 회사의 창립 멤버

감사의 글

실험실에서 박사 Anjali Nandal에 박사 후 펠로 십 그랜트와 탐험 그랜트에 의해 지원 되었다 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 BT (TEDCO)에서.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
센다이 바이러스 벡터 - CytoTune-iPS 2.0 KitInvitrogenA16517얼음 위에서 해동; S 번호 : 1
Trypsin EDTAGibco Life Tech25300-0540.05 %, 100 ml; S 아니오: 2
바위 억제물 (Y-27632)MiliporeSCM075사용 10 μ M; S 번호: 3
DMEM/F-12 매체Invitrogen11330-032S 번호: 4
혈청 대체(KSR)Gibco10828028S 번호: 5
DMEMInvitrogen119600691X; S No: 6
소 태아 혈청Thermo ScientificSH30071.03부분 표본; S 아니오: 7
L-글루타민 (Glutamax, 100X), 액체Thermo Scientific350500611/100; S 아니오: 8
비필수 아미노산Gibco11140-0501/100; S No: 9
2-메르캅토에탄올Gibco2198502355 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser HemacytometersHausser Scientific02-671-54S No: 11
0.1% 젤라틴 용액STEMCELL Technologies790337º에서 배양; C 1 시간; S 번호 : 12
SSEA-4 항체Santacruzsc-217041/100; S 번호: 13
TRA-1-81 항체세포 신호4745S1/200; S No: 14
OCT4 항체Santa Cruzsc-52791/1,000; S 번호 : 15
콜라겐 I, 쥐 꼬리생명 기술A10483-01차갑게 유지하십시오. S No: 16
Alexa Fluor 형광 488/568 (2차 항체)InvitrogenA21202/A100421/2,000; S 번호: 17
DPBS하이클론SH30028LS1X; S No: 18
100-mm 조직 배양 접시Falcon353003S No: 20
96-웰 조직 배양 플레이트Falcon353078S No: 21
6-웰 조직 배양 플레이트Falcon353046S No: 22
해부 범위 니콘SMZ745S No: 23
피킹 후드NuAireNU-301S No: 24
15  ml 원심분리기 튜브Greiner Bio-One188271S No: 25
50  ml 원심분리기 튜브Greiner Bio-One227261S No: 26
Sodium pyruvateInvitrogen11360S No: 28
β-mercaptoethanolSigmaM7522S No: 29
Prigrow III mediumABMTM003S No: 31
Countess™ Cell CounterInvitrogenC10227S No: 32
Faxitron X-ray systemFaxitronCellRadS No: 33
AccutaseInnovative cell TechnologiesAT-104S No: 34
CollagenaseLife Technologies171040191mg/ml 재고; S No: 35
DispaseSTEMCELL Technologies7923S No: 36
hESC 인증 matrigelBD Biosciences354277희석하려면 차가운 DMEM/F-12를 사용하십시오. S 번호: 37
bFGFR & D233-FB재고 10 ug/ml; S 번호 : 38
파라 포름 알데히드EMS15710PBS의 4 % 주식; S 번호 : 39
TRA-1-60산타 크루즈사우스 캐롤라이나 - 217051/100; S 번호: 40
nanogReproCELLRCAB0004P-F1/100; S 번호: 41
트윈 20시그마P9416-100MLS 번호: 42
알칼리 인산가수분해효소 키트Stemgent00-0055S 번호: 43
Cas9 단백질PNA BioCP01-50해동 및 분취; S 번호: 44
염소 또는 당나귀 혈청시그마D9663/G9023S 번호: 45
Triton X-100SigmaX100-100MLS 번호: 46
DAPIThermo ScientificD1306S 번호: 47
TrisSigma9285-100MLS 번호: 48
NaCLSigmaS7653-250GS 번호: 49
EDTASigmaBP2482-500S 번호: 50
T4 DNA 리가제NEBM0202TS No: 51
Mega Shortscript T7 kitThermo ScientificAM1354S No: 52
Mega Clear kitThermo ScientificAM1908S No: 53
SMC4BD Biosciences354357S No: 54
FibronectinSTEMCELL Technologies7159S No: 55
CloneJET 클로닝 키트Thermo ScientificK1232S No: 56
Fragment analyzerTMAdvanced AnalyticalS No: 57
mTeSR1 medium kitSTEMCELL Technologies5850실온; S No: 58
동결 매체 mFreSR™STEMCELL Technologies5855S No: 59
냉동 매체 CryoStor®STEMCELL Technologies7930S No: 60
MEFsGlobalstemGSC-6301GS No: 61
L-glutamineInvitrogen25030081S No: 62
인간 췌장 세포ABMT0159S No: 63
STEMdiff™ 신경 유도 매체줄기세포 기술5835S 번호: 64
RPMIThermofisher11875-093S 번호: 65
2% B27-인슐린ThermofisherA1895601S 번호: 66
CHIR99021Stemcell Technologies72052S 번호: 67
IWP4Stemcell Technologies72552S 번호: 68
2% B27Thermofisher17504044S 번호: 69
MCDB 131Life Technologies10372019S 번호: 70
중탄산나트륨시그마-알드리치S8761-100MLS 번호: 71
포도시그마-알드리치G8270-100GS 번호: 72
BSAProliant68700S 번호: 73
GDF8Pepro-Tech120-00S 번호: 74
TUJ1 항체EMD MiliporeAB9354S No: 75
NKX2-5 항체Santa CruzSc-14033S No: 76
SOX17 항체R & D 시스템AF1924S No: 77
Propidium iodideThermo ScientificP3566S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™LonzaAAF-1002S No: 79
FACSAria II(세포 분류기)BD biosciencesSORP UVS No: 80
개의 당

참고문헌

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