효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

요약

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

초록

배아와 유도 만능 줄기 세포는 자기 갱신 하 고 신체의 여러 세포 유형으로 차별화 수 있습니다. 만능 세포는 따라서 재생 의료에서 연구를 위한 탐 낼 고 현재 안과 질환, 당뇨병, 심장 질환 및 다른 질환에 대 한 임상 실험에서. 다양 한 응용 프로그램에 대 한 iPSC의 게놈을 조정 하기 위한 추가적인 기회를 제공 하는 편집 기술 CRISPR/Ca 시스템을 포함 하는 게놈의 최근 발전을 함께 하는 특수 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력 모델링, 유전자 치료, 몇 가지 이름을 차별화의 경로 바이어 싱 하는 질병을 포함 하 여. 사용 가능한 편집 기술, 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 CRISPR/Cas9 진 핵 게놈의 사이트 편집에 대 한 선택의 도구로 떠오르고 있다. CRISPRs, 저렴, 쉽게 액세스할 수 있으며 대상된 편집 공학에서 매우 효율적인. Cas9 nuclease 및 가이드 시퀀스 (20-메 르)는 3 뉴클레오티드 "NGG" protospacer-인접-모티브 (PAM) 보편적인 Cas9 바인딩 추적 RNA (함께 원하는 genomic 소재 시에 Cas9을 타겟팅에 대 한 인접 게놈 대상에 특정 시스템 요구 함께 라는 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA). 여기에 우리가 현재는 단계별 급지대 및 발자국 무료 iPSC의 효율적인 생성에 대 한 프로토콜 및 게놈 iPSC Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 단지를 사용 하 여 편집에 대 한 방법론을 설명. 프로토콜 편집 게놈 효과적 이며 Cas9 단백질 및 동시에 전달 하는 셀에 하나 이상의 대상에 대 한 사전 complexing sgRNAs에 의해 쉽게 다중화 될 수 있다. 마지막으로, 우리는 식별 및 원하는 수정 Ipsc의 특성화에 대 한 간단한 접근 방법을 설명합니다. 함께 찍은, 개요 전략 생성 및 iPSC 매니폴드 응용 프로그램의 편집을 능률적으로 예상 된다.

서론

요소를 프로그래밍의 overexpression에 의해 만능 상태로 인간 체세포의 재프로그래밍 질병 모델링, 재생 의료 및 약물 개발에 응용 프로그램과 함께 줄기 세포 연구를 혁명 있다. 여러 가지 비 바이러스 성 재활 방법을 프로그래밍 요소와 Ipsc, 생성의 배달을 위해 사용할 수 있지만 과정은 노동 집약 하 고 매우 효율적인¹. 바이러스 성 방법 비록 효율적 바이러스 통합 및 tumorigenicity^2,,34의 문제와 관련 된 있습니다. 이 원고에서 우리 제공 요소를 프로그래밍 하 고 그들의 유전자⁵에 어떤 바이러스 성 벡터 시퀀스의 통합 부족 발자국 무료 iPSC 라인 설정에 대 한 세포질 센다이 바이러스를 사용 하 여를 보고 합니다. 센다이 바이러스는 RNA 바이러스는 감염 후 세포 세포질 ~ 10 구절에서 희석 하 고 풍부 하 게, 신속 하 고 효율적인 프로그래밍^6,7을 선도 재활 요소를 생성 합니다. 설립된 Ipsc 공급기 무....

프로토콜

1. 프로그래밍 프로토콜

1. 기본 인간의 췌 장 세포에서 인간 iPSC의 세대
   1. 6-잘 1.5 mg/mL 차가운 콜라겐 접시 하 고 1 h. 위해 37 ° C에서 젤 코트
   2. 접시 인간의 기본 췌 장 세포는 콜라겐에 Prigrow III 매체 (~ 1-1.5 × 10 ⁵ 셀)에 코팅 6 잘 플레이트에 하루 약 2.5 × 10 ⁵ 셀 또는 적어도 60%를 달성 하기 위해-2 초기 통로의 날에 잘 당 confluency 변환 (0 일)입니다. 첫 번째 연구를 위해 0에 원하는 confluency 하나 잘 얻을 적어도 2-3 웰 스 접시. 셀 하나 이상 잘 컨트롤 사용.
   3. 변환 (0 일)의 날, 따뜻한 불리고 수를 각 잘 물 욕조에 Prigrow III 매체의 1 mL. 수확 10 %FBS 매체 1 mL의 트립 신/EDTA를 사용 하 여 5 분의 1 mL에 한 컨트롤에서 셀 또는 셀 셀 수 수행을 분리 하는. 10 %FBS 매체, 추가 DMEM, 10 %FBS, 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 Pyruvate와 1% 비 본질적인 아미노산.
   4. 수 셀 카운터를 사용 하 여 세포의 생존 능력을 확인 하 고 계산 셀 번호 및 바이러스 titer에 따라 목표....

결과

이 책에서 우리 통합 또는 발자국 무료 센다이 바이러스 벡터를 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서 iPSC의 세대에 대 한 간단 하지만 효율적인 프로토콜을 따라 했습니다. 그림 1A 이 재활 프로토콜의 도식 적인 표현을 보여준다. Prigrow III 매체에 경작 하 고 센다이 바이러스 위에서 설명한 대로 불리고 인간의 췌 장 세포가 상업적으로, 구매 되었다. 췌 장 세포를 형성 하는 불리고 스핀 0, 당일 센다이 바이러스 변환 후 ~ 5 일에 대 한 모든 형태학 상 변화를 보여주지 않았다 하지만 다음 더 큰 핵과 nucleoli 반올림 될. 일부 초기 식민지 주 후 변환 후 보였다 하지만 그들은 했다 하지, 우리의 경험, 이러한 식민지 신속 하 게 분열 하 고는 일반적으로 '초기 부분적으로 재설정된 셀'을 강력한 식민지를 설정 하지 않습니다. 약 10-15 일 후 변환, 작은 밝은 식민지 관찰 했다 고 성장 (

토론

Ipsc 인간의 체세포의 재프로그래밍 기본적인 생물학 연구, 맞춤된 의학, 질병, 약물 개발 모델링과 재생 의학¹⁶의 분야에 큰 향상을 제공 하고있다. 호스트 게놈으로 통합의 위험 바이러스의 사용을 필요로 하는 인간의 iPSC 세대의 많은 현재 및 널리 사용 되는 방법 또는 episomal 벡터와 낮은 효율을 프로그래밍. 여기, 우리는 Ipsc 공급기 무료 센다이 바이러스, ' 무료 '와 효율적인 프로그래밍 리드와 인간의 췌 장 세포에서 생성 하는 효율적인 방법 제시. 결과 인간의 Ipsc는 무료로 바이러스 transgenes, pluripotency를 유지 하 고 알 수 없는 외 인 요인의 사용을 방지. 그래서 우리는 피더 세포에 기본 췌 장 세포를 재설정 다음 식민지 확장, 문화 및 특성에 대 한 막 급지대 무료 이동 Ipsc 공급기 무료 조건에서의 세대 낮은 재활 효율이 있다. 이러한 기술의 융합 신뢰할 수 있는 안정적이 고 보다 효율적인 iPSC 프로그래밍을 제공합니다.

.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
센다이 바이러스 벡터 - CytoTune-iPS 2.0 Kit	Invitrogen	A16517	얼음 위에서 해동; S 번호 : 1
Trypsin EDTA	Gibco Life Tech	25300-054	0.05 %, 100 ml; S 아니오: 2
바위 억제물 (Y-27632)	Milipore	SCM075	사용 10 μ M; S 번호: 3
DMEM/F-12 매체	Invitrogen	11330-032	S 번호: 4
혈청 대체(KSR)	Gibco	10828028	S 번호: 5
DMEM	Invitrogen	11960069	1X; S No: 6
소 태아 혈청	Thermo Scientific	SH30071.03	부분 표본; S 아니오: 7
L-글루타민 (Glutamax, 100X), 액체	Thermo Scientific	35050061	1/100; S 아니오: 8
비필수 아미노산	Gibco	11140-050	1/100; S No: 9
2-메르캅토에탄올	Gibco	21985023	55 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54	S No: 11
0.1% 젤라틴 용액	STEMCELL Technologies	7903	37º에서 배양; C 1 시간; S 번호 : 12
SSEA-4 항체	Santacruz	sc-21704	1/100; S 번호: 13
TRA-1-81 항체	세포 신호	4745S	1/200; S No: 14
OCT4 항체	Santa Cruz	sc-5279	1/1,000; S 번호 : 15
콜라겐 I, 쥐 꼬리	생명 기술	A10483-01	차갑게 유지하십시오. S No: 16
Alexa Fluor 형광 488/568 (2차 항체)	Invitrogen	A21202/A10042	1/2,000; S 번호: 17
DPBS	하이클론	SH30028LS	1X; S No: 18
100-mm 조직 배양 접시	Falcon	353003	S No: 20
96-웰 조직 배양 플레이트	Falcon	353078	S No: 21
6-웰 조직 배양 플레이트	Falcon	353046	S No: 22
해부 범위	니콘	SMZ745	S No: 23
피킹 후드	NuAire	NU-301	S No: 24
15  ml 원심분리기 튜브	Greiner Bio-One	188271	S No: 25
50  ml 원심분리기 튜브	Greiner Bio-One	227261	S No: 26
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360	S No: 28
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	S No: 29
Prigrow III medium	ABM	TM003	S No: 31
Countess™ Cell Counter	Invitrogen	C10227	S No: 32
Faxitron X-ray system	Faxitron	CellRad	S No: 33
Accutase	Innovative cell Technologies	AT-104	S No: 34
Collagenase	Life Technologies	17104019	1mg/ml 재고; S No: 35
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	S No: 36
hESC 인증 matrigel	BD Biosciences	354277	희석하려면 차가운 DMEM/F-12를 사용하십시오. S 번호: 37
bFGF	R & D	233-FB	재고 10 ug/ml; S 번호 : 38
파라 포름 알데히드	EMS	15710	PBS의 4 % 주식; S 번호 : 39
TRA-1-60	산타 크루즈	사우스 캐롤라이나 - 21705	1/100; S 번호: 40
nanog	ReproCELL	RCAB0004P-F	1/100; S 번호: 41
트윈 20	시그마	P9416-100ML	S 번호: 42
알칼리 인산가수분해효소 키트	Stemgent	00-0055	S 번호: 43
Cas9 단백질	PNA Bio	CP01-50	해동 및 분취; S 번호: 44
염소 또는 당나귀 혈청	시그마	D9663/G9023	S 번호: 45
Triton X-100	Sigma	X100-100ML	S 번호: 46
DAPI	Thermo Scientific	D1306	S 번호: 47
Tris	Sigma	9285-100ML	S 번호: 48
NaCL	Sigma	S7653-250G	S 번호: 49
EDTA	Sigma	BP2482-500	S 번호: 50
T4 DNA 리가제	NEB	M0202T	S No: 51
Mega Shortscript T7 kit	Thermo Scientific	AM1354	S No: 52
Mega Clear kit	Thermo Scientific	AM1908	S No: 53
SMC4	BD Biosciences	354357	S No: 54
Fibronectin	STEMCELL Technologies	7159	S No: 55
CloneJET 클로닝 키트	Thermo Scientific	K1232	S No: 56
Fragment analyzerTM	Advanced Analytical		S No: 57
mTeSR1 medium kit	STEMCELL Technologies	5850	실온; S No: 58
동결 매체 mFreSR™	STEMCELL Technologies	5855	S No: 59
냉동 매체 CryoStor®	STEMCELL Technologies	7930	S No: 60
MEFs	Globalstem	GSC-6301G	S No: 61
L-glutamine	Invitrogen	25030081	S No: 62
인간 췌장 세포	ABM	T0159	S No: 63
STEMdiff™ 신경 유도 매체	줄기세포 기술	5835	S 번호: 64
RPMI	Thermofisher	11875-093	S 번호: 65
2% B27-인슐린	Thermofisher	A1895601	S 번호: 66
CHIR99021	Stemcell Technologies	72052	S 번호: 67
IWP4	Stemcell Technologies	72552	S 번호: 68
2% B27	Thermofisher	17504044	S 번호: 69
MCDB 131	Life Technologies	10372019	S 번호: 70
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S8761-100ML	S 번호: 71
포도	시그마-알드리치	G8270-100G	S 번호: 72
BSA	Proliant	68700	S 번호: 73
GDF8	Pepro-Tech	120-00	S 번호: 74
TUJ1 항체	EMD Milipore	AB9354	S No: 75
NKX2-5 항체	Santa Cruz	Sc-14033	S No: 76
SOX17 항체	R & D 시스템	AF1924	S No: 77
Propidium iodide	Thermo Scientific	P3566	S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™	Lonza	AAF-1002	S No: 79
FACSAria II(세포 분류기)	BD biosciences	SORP UV	S No: 80

개의 당