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방법 논문

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56273

⸱

2017년 10월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

초록

무릎 관절염 (KOA)에 대 한 인간 지방 유래 간 엽 줄기 세포 (haMSC) 치료의 임상 적용을 지원 하기 위해 셀 지의 효능과 동물 모델에서 haMSCs의 biodistribution을 검사 합니다. 우리는 질 성 형광 염료와 haMSCs의 세포 막에 레이블을 하는 방법을 설명 했다. 그 후, 수술로 유도 KOA와 쥐에 있는 레이블된 셀의 내부 관절 주사는 vivo에서 이미징 시스템에서 동적으로 모니터링 했다. 우리는 질 성 고용 carbocyanines 않았다 (DilC18 (5)), 조직 주변에서 자연 녹색 autofluorescence의 자극을 피하기 위해 빨간색 레이저를 활용 하는 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그. 또한, 레드 이동 방출 스펙트럼의 살아있는 동물에서 깊은 조직의 이미징 및 레이블 프로시저 발생 세포 독성 효과 또는 haMSCs 기능 손상을 허용 했다. 이 접근은 쥐 KOA 모델에서 haMSCs에 대 한 효율적인 추적 방법으로 보였다. 이 방법의 응용 프로그램 또한 최적의 관리 경로 및 전 임상 연구에서 다른 소스에서 MSCs의 복용량을 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다.

서론

무릎 관절염 (KOA) 관절 연골 손실 및 진보적인 염증, 되 고 있다는 세계1주위 노인에서 주요 만성 질환 인 퇴행 성 질환 이다. 그러나, 항 염증 제 약물, 물리 보충, 및 수술 절차를 사용 하 여 현재 치료만 증상 통증2에 대 한 임시 구호를 제공할 수 있습니다.

무릎 관절염, 연골 재생, immunomodulatory 속성3, 잠재적인 multipotent 그들의 차별화 때문에 유망한 재생 치료 되 고 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs) 4. 약리학 노선 vivo에서행동의 메커니즘을 조사와 비교 하면, 현재 유익에 대 한 근거 및 임상 응용 프로그램 이전 haMSC 치료의 타당성을 확립 하는 작은 KOA 동물 모델에서 라이브 haMSCs를 추적. 전 임상 시험에 대 한 중간 meniscectomy (MM) destabilizes 일관 재현성5상대적으로 가능한 모델을 제공 합니다 쥐, KOA를 유도 하 관절의 기계적 부하. KOA m M에 의해 유도 된의 발병은 전방 십자 인 대 transection 혼자 또는 결합 부분 중간 meniscectomy6보다 이전. 따라서, KOA의 병 적인 microenvironment로 주입 된 haMSCs 간의 장기 상호 작용 종종 m M7,8에 의해 유도 된 쥐에 평가 됩니다.

비록 haMSCs의 치료 효능에 광범위 하 게 보고, 관련 지식이 하고있다 내 관절 (IA) 주입을 통해 이식된 haMSCs의 비보에 지 속성 부족9,10입니다. 따라서, 다양 한 세포 표시 방법은 개발 되었다, immunohistology11, luciferase12, 녹색 형광 단백질13 transfection, 자기 공명 영상 (MRI)14에 대 한 라벨 산화 철을 포함 하 여 , 그리고 수많은 형광 셀 염료8,,1516. 노동 집약적인 조직학 분석 비교, vivo에서 비 침략 적 영상 실시간 유통 및 형광 신호10,17으로 표시 하는 셀의 역학을 감지 하는 광학 장치를 사용 합니다. 기능 라이브 셀 이미징에 대 한 cytocompatible 형광 라벨 줄기 세포 이식18후 세포 활동을 공개 하는 정교한 무료 방사성 추적 기술입니다. 또한, 다 색 형광 닥터지 염료 친수성 아미노산 반응성 염료 나 형광 단백질, 그들의 향상 된 세포 침투성 등 향상 된 형광 양자 수율19이점을 있습니다.

따라서, 여기에 포함 된 프로토콜 활용 빨간색 레이저 질 성 carbocyanines로 표시 하는 세포를 자극 했다 (DilC18(5)), 빨강 형광 Dil (dialkylcarbocyanines) 아날로그20입니다. 빨간색 이동 여기 및 방출 스펙트럼 autofluorescent 간섭 방지 않았다 하 고 깊은 조직 동물8시간의 긴 기간 동안 이미징 있습니다. 추적의이 방법은 세포 vivo에서 표시 한은 이해 하 고 현재 줄기 세포 재생 치료 개선에 필수적인 동물 모델에서 haMSCs 같은 이식된 줄기 세포 모니터링에 적합.

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프로토콜

동물 주제와 관련 된 절차 동물 고통 최소화 하는 노력으로 현지 기관 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 했다. 다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 상해 9 사람들에 의해 승인 되었다 ’ 병원 프로토콜 상하이 교통 대학의과 대학에 가입 하는 s 번호 [2017] 063.

1. Surgically-Induced 쥐 무릎 관절염 모델의 설립

  • 이 수술, 250, 300 g. 사이 몸 무게와 함께 사용 8-12 주 오래 된 남성 Sprague Dawley (SD) 쥐에 대 한
    1. 40 mg/kg tiletamine와 근육 주사를 통해 40 mg/kg zolazepam 동물 anesthetize.
    2. 열띤된 무대에서 왼쪽된 측면 위치에 동물을 배치합니다. 면도기와 함께 오른쪽 무릎 철저 하 게 면도. 외과 영역 10 %providone-요오드 솔루션 뒤에 70% 에탄올으로 소독, 두 번 더 반복 하 고 다음 10 %providone-요오드 솔루션 그리고 외과 패드 비 외과 영역을 커버.
    3. 는 jointcapsules를 노출 하는 슬 개 골 힘 줄을 따라 옆으로 2cm 절 개 하 게 수술 메스를 사용 하 여.
    4. 수술 메스를 사용 하 여 transect 중간 부수적인 인 대. 대 퇴 골 쪽으로 초승달 모양 반영.
    5. 연골 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 작업 중에 관절 연골의 표면 살 균 0.9% 염화 나트륨 솔루션을 똑.
    6. 중간 초승달 모양 집게로 잡아와 메스 ( 그림 1A)와 tibial 첨부 파일에서 그것의 가장 좁은 지점에는 초승달을 극복. 연골 부상 방지.
    7. 공동 캡슐 4-0 흡수 봉합을 닫습니다.
    8. 그들은 식이 되 찾을 때까지 외과 쥐 모니터링.
    9. 주사 감염 및 수술 후 통증을 완화 하는 근육 경로 통해 0.05 mg/kg buprenorphine를 방지 하기 위해 20 mg/kg gentamicin.
    10. 발병 KOA 3-8 주 동안 12 h 명암 주기 아래 온도 제어 동물 시설에 쥐를 유지합니다. 동물 계속 진통제, 통증 증상이 계속 되 면 Buprenorphine (0.05 mg/kg, 인스턴트 메신저) 및 Gentamicin (20 mg/kg, 인스턴트 메신저), 하 되이 국한 되지 않음 등 수신.

    2. 조직학 평가의 쥐 KOA 모델

    1. 희생 과도 한 CO 2 흡입 (추가 챔버에 기존 공기에 이산화탄소와 분당 챔버 볼륨의 약 30%의 채우기 비율이 동물 의식 있도록와 쥐 호흡 후 1 분의 2-3 분 최소 유지 CO2 흐름 내에서 정지 한다.) 에 나타난 시간 점 (대표 결과 KOA 유도 3에서 8 주까지 8 주에 표시 됩니다) 수술.
    2. 피부와 무릎 관절 주위 근육을 해 부하 고 메스와 무릎 관절을 잘라.
    3. 실 온에서 3 일 동안 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 무릎 관절을 수정합니다. 이후에, 4 ° C에서 약 4 주 동안 20 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)에서 샘플을 알려줍니다 하 고 EDTA 3 일 마다 변경.
      주의: Paraformaldehyde 독성, 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 장갑, 안경 등을 착용.
    4. 탈수 자동 조직 프로세서를 사용 하 여 샘플. 플러시 주기를 다음과 같이 시작 메뉴 설정: 1 h;에 대 한 70% 에탄올 다음 80% 에탄올과 1 시간에 대 한 95% 에탄올 각각; 뒤에 1 h;에 대 한 100% 에탄올의 2 주기 그 후, 크 실 렌 1 시간에 두 번 각 시간과 각 시간 1 h 58 ° C에서 3 번 파라핀.
      주의: 크 실 렌은 독성, 그래서 적절 한 보호구, 장갑, 안경 등을 착용.
      참고: 필요에 따라 사용 Coplin 항아리 자동 조직 프로세서로 동일한 설정 수동 탈수.
    5. 그대로 공동 얼굴의 중간 측면 내려 놓고 가운데에 포함 하는 조직 파라핀 블록에 포함.
      참고: 필요에 따라 사용 하 여 집게 파라핀 블록으로 샘플을 수동으로 포함.
    6. 로타리 톰 30 µ m 간격 2 직렬 섹션 5 µ m 화살 섹션 중간 마진에서 공동의 인하 시작.
    7. 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 하 고 크 실 렌에 슬라이드를 deparaffinize. 2 직렬 섹션 사이 얼룩 되며 한 슬라이드 & 오신 (H & E) 얼룩: 0.1% 되며 15 분, 1 %10 s 및 0.5% 아세트산 해결책 오신 10 분. 그리고 다른 슬라이드 Safranin O/빠른 그린 얼룩과 얼룩: 0.1% 되며 15 분, 0.02% 빠른 그린 3 분, 1% 초 산 솔루션을 10 s와 0.1% Safranin O 3 분
      주의: 크 실 렌은 독성, 장갑, 안경 등 적절 한 보호구를 착용.
    8. 쥐 6 관절염 연구 학회 인터내셔널 (OARSI) Histopathology 평가 시스템을 사용 하 여 스테인드 슬라이드 점수.

    3. 라벨의 인간 중간 엽 줄기 세포와 형광 염료 않았다

    1. 1 m m의 농도에서 100% 에탄올에 셀 라벨 솔루션 준비 했 어. 빛에서 셀 라벨링 솔루션을 보호 하 고 6 개월까지 실내 온도에 저장.
    2. 성장 Dulbecco에서 표준 세포 문화 절차와 haMSCs ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 1% 페니실린 및 스와 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 10 cm 배양 접시에서 보충.
    3. 1 mM EDTA 합류 이전에 약 80%와 haMSCs 2 mL 0.25 %trypsin 분리.
    4. 4 mL 문화 매체와 트립 신을 중화 하 고 실내 온도에 3 분 동안 800 x g에서 셀 회전.
    5. 1 x 10 6 셀/mL 5 mL 혈 청 무료 문화 매체에서의 조밀도에 셀 중단.
    6. 50를 추가 하 여 셀 라벨 µ L 일 분 동안 37 ° C에 5 mL 혈 청 무료 문화 매체에서 셀 라벨링 솔루션
    7. 3 분에 대 한 800 x g에서 레이블이 지정 된 셀을 회전
    8. 5 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 3 분 동안 800 x g 2 셀 번 더 세척.
    9. 이라는 haMSCs Cy5 필터 세트 형광 현미경을 사용 하 여 확인 하십시오.
    10. Trypan 푸른 얼룩과 셀 고 주사에 대 한 100 µ L PBS에 10 6 가능한 셀 x 2.5.

    4. Vivo에서 형광 트랙 haMSCs 이미징

    1. (1 단계), 수술 후 8 주 25 mg/kg tiletamine 및 25 mg/kg zolazepam의 근육 주사 하 여 KOA 쥐 anesthetize.
    2. 공동 영역을 노출 하는 면도기와 함께 오른쪽 무릎을 철저 하 게 면도. 70% 에탄올과 공동 지역 소독.
    3. 2.5 x 10을 주사 26 G 주사기 바늘을 사용 하 여 슬 개 골 인 대, 내측 대 퇴 관절 돌기, 그리고 중간 tibial 관절 돌기 (의 중간 측에 의해 형성 된 6 삼각형 지역의 센터에서 100 µ L PBS에 셀 표시 그림 1B).
    4. 이미징 소프트웨어를 열고 초기화는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템.
    5. 뒤로 눕은 위치 쥐 이미징 시스템의 중앙 무대에 놓고 챔버의 문을 닫습니다.
    6. 체크는 " 형광 " 확인란의 선택 형광 필터 세트 여기, 및 680 nm 방출 ( 그림 2A)에 대 한.
    7. 선택 필드 볼 디 설정 픽셀 binning 매체 (8), F를 / 2, 노출 중지는 자동 시간. 최적의 유지 전체 연구 ( 그림 2A)에서 유사한 결과 얻기 위해 일관 된 노출 시간.
    8. 무대 고 마 취에서 회복에 대 한 모니터에서 동물 제거.
      참고: 장소 동물 난방 패드에 덮여 toweling의 2-3 층.
    9. 형광 ( 그림 2B)의 측정에 대 한 복사 효율의 단위를 선택합니다. (ROI) 분석에 대 한 관심의 영역을 선택 하 고 각 이미지 ( 그림 2C) 형광 신호를 계량.
    10. Vivo에서 화상 진 찰 haMSCs 관절에 종 보존 연구를 순차적으로 각 쥐의 절차를 반복.
      참고: 우리는 동물을 이미징 제안 ' 주입 후 첫 주에 대 한 일에 한 번 그리고 한 번 매주 마다 신호를 감지할 수 없을 때까지 vivo에서 이미징 시스템에 의해 형광 신호.

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    결과

    KOA 모델을 유도 하기 위하여 m M SD 쥐 (그림 3)의 오른쪽 무릎 관절에 수행 되었다. 수술 후 8 주 쥐 희생 했다 고 무릎 관절의 직렬 섹션 두 H로 평가 했다 &와 Safranin O/빠른 그린 얼룩 (그림 4). H에 대 한 & 전자 얼룩, 관절 연골의 표면 전시 보다 수술을 하지 않고 정상적인 관절 수술 무릎에 거칠어 테두리. Safranin O/빠른 그린 얼룩, 우리는 감소 proteoglycan (붉은 얼룩)를 관찰 하 고 fibrillated 콜라겐 (녹색 얼룩) 수술 관절에 퇴행 성 KOA 고기의 진행 표시 정상적인 것에 비해 증가 수술에 의해 유도. 닮은 인간의 KOA의 진행, 쥐 3 주, 6 주, 8 주 m M 병 인을 평가 하 고 치료 개입의 시간 확인 후에 희생 되었다.

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    토론

    우리는 머리 맡에 벤치에서 코 아에 대 한 재생 줄기 세포 치료를 가져올 수 있는 전에 안전 표준 및 줄기 세포 치료의 biodistribution 연구 절실히 필요는 합니다. 그러나, 질병의 병 적인 환경 지 속성에 biodistribution 이식된 haMSCs10의 중요 한 역할을 재생합니다. 최근, 우리의 그룹 보다 정상적인 조건을8에서 주사 병 적인 KOA 환경 haMSCs의 내부 관절 주사 이상 유지는 설명 했다. 그것은 염증 및 퇴행 성 microenvironment 수리에 대 한 중간 엽 줄기 세포를 모집 하 고 이후 삽입 된 haMSCs1,21의 보존을 부탁 수 있습니다. 또한, haMSCs의 안전과 효능 프로필 최적화 실험실 동물에 KOA의 진행의 임상 시험을 지원 하기 위한 중요 한 데이터를 제공할 것입니다 그렇게 KOA...

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    공개 사항

    멩 리 밍 커, 원 왕은 현재 직원 및 셀룰러 의학 그룹의 스톡 옵션 보유자 (나스닥: CBMG). 다른 저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

    감사의 글

    현재 연구는 상하이 혁신 자금 (1402 H 294300) 과학 및 기술 위원회의 상하이 시 (CN) 박사 원 왕 후원에 의해 지원 되었다. 우리는 그의 기술 지원 및이 원고에 대 한 과학적 조언에 대 한 광 저 우 박사 (조직 공학 센터의 중국 국가)를 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 싶습니다 씨 Huitang 쌰 (상해 9 사람들의 병원) 감사 하 고 동물 복지에 그의 도움에 대 한.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    Matrx VMR 동물 마취 시스템MidmarkVIP3000
    4-0 봉합사Shanghai JinhuanKC439
    Razor PritechLD-9987
    GentamicinZhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.없음
    0.9% 염화나트륨 용액Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
    H43020455 PenicillinShanghai Kangfu 화학 제약 Co., Ltd.없음
    부프레노르핀톈진 제약 연구소 제약 Co., Ltd.없음
    파라포름알데히드Sigma-Aldrich16005에서 최종 농도 10%로 희석
    에서 최종 농도 20%로 희석
    Mayer' sSigma-AldrichMHS16
    0.5% Eosin Y 용액, 알코올Sigma-AldrichHT110116
    Safranin OSigma-AldrichS8884
    Fast GreenSigma-AldrichF7258
    Shandon Excelsior ESTM 조직 처리기Thermo FisherA78400006
    Shandon Histocentre™ 3 조직 임베딩 CenterThermo FisherB64100010
    완전 자동 로터리 마이크로톰LeicaRM2255
    DiD분자 프로브, Life
    Technologies    		V-22887
    D-MEM 고혈당시그마-알드리치D5648
    PBSGIBCO, Life Technologies14190-144
    0.25% 트립신-EDTAInvitrogen25200-114
    10cm 페트리 접시코닝V118877
    원심분리기BeckmanOptima MAX-TL
    형광 현미경OlympusBX53
    0.4% Trypan Blue 용액Sigma-Aldrich93595
    TitetammeVirbac (Zoletil 50)1000000188
    ZolazepamVirbac (Zoletil 50)1000000188
    일회용 멸균 hyposermic 주사기 26GShanghai Misawa Medical IndustryNone
    IVIS Spectrum In Vivo 이미징 시스템PerkinElmer124262
    Living Imaging 4.0 소프트웨어PerkinElmer없음
    PBS EDTA Sigma-Aldrich E9884 PBS 0.1% Hematoxylin Solution,

    참고문헌

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