높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq)와 결합 하 여 염색 하는 Transposase 액세스할 수 질에 대 한 분석 결과 액세스할 수 chromatin를 폭로 하는 게놈 넓은 방법입니다. 이 인간의 세포 (Th1/Th2)에 최적화 된 최종 계산 분석, 분자에서 단계별 ATAC seq 프로토콜입니다. 이 프로토콜 차세대 시퀀싱 방법 사전 경험 없이 연구자에 의해 채택 될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq) Transposase 액세스할 수 Chromatin에 대 한 분석 결과 chromatin의 오픈 (액세스) 지역의 식별에 사용 되는 방법 이다. 이 지역 규제 DNA 요소를 (예를 들면, 발기인, 증강, 로커 스 제어 영역, 절연체) 요인 바인딩하는 전사를 나타냅니다. 매핑 액세스할 수 chromatin 프리 게놈에서 잠복 활성 규제 요소에 대 한 강력한 접근 이다. 이 정보는 관련 된 녹음 방송 요인의 네트워크 및 유전자 식 프로그램을 제어 하는 chromatin 구조의 메커니즘을 발견에 대 한 편견된 접근 역할을 합니다. ATAC seq는 DNase 강력 하 고 중요 한 대안이 나 과민 증 분석 다음-세대 시퀀싱 (DNase-seq)와 포 름 알 데히드 기반 격리 chromatin의 게놈 넓은 분석에 대 한 규제 요소 (시 키-seq)의 결합 내게 필요한 옵션을 micrococcal nuclease 민감한 사이트 (MNase-seq) nucleosome 위치 결정의 연속. 선물이 상세한 ATAC seq 프로토콜 최적화 된 인간의 기본 면역 세포 즉, CD4 + 세포 (T 도우미 1 (Th1) 및 Th2 세포). 이 포괄적인 프로토콜 셀 수확 시작 chromatin tagmentation, 다음-세대 시퀀싱에 대 한 샘플 준비의 분자 절차에 설명 합니다 그리고 또한 포함 하는 방법 및 전산 분석 하는 데 사용에 대 한 고려 사항 결과 해석 합니다. 또한, 시간과 비용을 절약 하기 위해 우리는 시퀀싱 전에 ATAC seq 라이브러리를 평가 하기 위해 품질 관리 측정을 소개 했다. 중요 한 것은,이 프로토콜에 원리 다른 인간의 면역 및 비 면역 1 차 셀 및 셀 라인에 그것의 적응을 수 있습니다. 이러한 지침은 다음-세대 시퀀싱 방법 숙달 되지 않은 실험실을 위한 또한 유용할 것 이다.
서론
ATAC seq1,2 규제3 오픈 chromatin 지역과 nucleosome 포지셔닝의 식별을 가능 하 게 하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 위치, id, 및 녹음 방송 요인의 활동을 유추 적용 됩니다. Chromatin 구조 양적 변화를 측정 하기 위한 방법의 감도 chromatin 요인, RNA 중 합 효소 II1의 transcriptional 활동 뿐만 아니라 chromatin remodelers 및 한정자를 포함 하 여 활동의 연구 수 있습니다. 따라서 ATAC seq 모든 세포 유형의 관심에 transcriptional 규칙을 제어 하는 메커니즘을 해독에 대 한 강력 하 고 공평한 접근을 제공 합니다. 우리는 기본 인간의 Th1 및 Th2 세포 ATAC seq의 적응을 설명합니다.
ATAC seq에 활동적인 Tn5 transposase 어댑터 (즉, "tagmentation" 과정)1DNA의 태그와 차세대 시퀀싱 (NGS) 커플 DNA 파편에 대 한 어댑터 로드. PCR 증폭, 다음 ....
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프로토콜
모든 절차의 바 Ilan 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 및 프로토콜 실험 승인 위원회에서 제공 하는 지침을 따릅니다.
1. 정화의 순진한 사람의 CD4 + 세포 및 T 도우미 1 (Th1), Th2 세포 분극
참고: 우리가 냉동된 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)에서 시작 하는 절차를 설명 하는 여기. 첫 번째 단계는 CD4 + 세포 microbeads를 사용 하 여 격리 이루어져 있고 열 일반적으로 CD4 + 세포의 95% 보다 더 우리에 게. 그러나,이 단계는 각 실험실에서 기본 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다. T 세포 활성화와 양극 화에 대 한 프로토콜 Jenner 외에서 수정 된 (2009 년) 18. 절연의 CD4 + 세포 10 백만 PBMCs 제공에서 CD4 + 세포의 4-6 백만에 상승. 두 개의 플라스 크에 분할 Th1 아래 성장와 저조한 3-5 백만 Th1 및 Th2 세포 단지 1 주일 이내 조건 Th2 편광.
참고: 시작 하기 전에 4 ° c 원심 분리기 진정.
- (10 7 세....
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결과
이 프로토콜의 최종 결과 일반적으로 3 ~ 20 ng / µ L의 ATAC seq 라이브러리입니다. DNA 무결성 분석 시스템에서 실행할 때 (참조 테이블의 재료/장비), 그들은 쇼 사다리 같은 모습2 (그림 3A). DNA 파편의 평균 크기는 일반적으로 ~ 450 530 혈압.
차세대 시퀀싱을 수행 하기 전에 ATAC seq 라이브러리의 적절 한 품질 관리는 시간과 돈을 절약 해야 합니다. 우리 때는 라이브러리 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 적합 한 긍정적인 컨트롤의 농축은 이상 25-그리고 75 배 (뇌관을 위한 쌍 3, 4, 각각) 부정적인 컨트롤 (그림 3B)을 기준으로 하 .......
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토론
여기에 설명 된 ATAC seq 프로토콜은 성공적으로 고용 되었다 액세스할 수 chromatin의 분석에 대 한 1 차 셀에서 (인간의 Th1, Th2 세포와 B 세포) 교양된 셀 라인 (MCF10A 인간의 유방암 세포와 U261 세포종 세포) 뿐만 아니라. 다른 세포 유형 ATAC seq 적용 일부 프로토콜 최적화, 특히 세포 단계에서에서 필요할 수 있습니다. 비 이온 세제의 농도가 너무 높은 경우에, 높은 비율의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 수 있습니다. 이 핵 수확량을 감소 하지 않고 세포의 용 해 버퍼에 세제 농도 감소 하 여 줄일 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 세포의 용 해 버퍼 세제의 0.05%를 가장 만족 스러운 결과 주었다. 또한, 고정된 각으로 터 펠 릿에 미토 콘 드리 아 감소 500 G 힘을 감소 허용 대신 스윙 양동이에 핵 회전. 연구원은 또한 세제, 예를 들어 digitonin17의 다른 종류를 테스트할 수 있습니다. 그러나, 최적화 된 세포의 용 해 조건,.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 이스라엘 과학 재단 (그랜트 748/14) 지원, 마리 퀴리 통합 부여 (CIG)-FP7 명 20013 CIG 618763와 난 코어 프로그램의 계획 및 예산 위원회와 이스라엘 과학 재단 부여 번호 41/11.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 50 mL 튜브 | Lumitron | LUM-CFT011500-P | 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | 는 다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다. |
| 25 mL 혈청학 피펫 | Corning Costar | 4489 | 다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다. |
| 조직 배양 플라스크 | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | 다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC) | ATCC | PCS&수줍음; 800&샤이; 011 | 다른 공급업체에서 가져올 수 있습니다. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | 다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다. |
| L-글루타민 용액 (200 mM) | 생물 산업 | 03-020-1B | 다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다. |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 생물학 산업 | 03-031-1B | 다른 공급업체에서 가져올 수 있습니다. |
| 소 태아 혈청 (FBS), 열 비활성화, 유럽 등급 | 생물 산업 | 04-127-1 | 다른 공급 업체에서 제공 할 수 있습니다. |
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| MACS MS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
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| 재조합 인간 IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| 재조합 인간 IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| 재조합 인간 IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF 정제 된 안티 휴먼 IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, 분석 등급 | Carlo Erba | 479687 | 다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다. |
| 염화마그네슘, 헥사하이드레이트, 분자생물학 등급 | Calbiochem | 442611 | 다른 공급업체에서 제공할 수 있습니다. |
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| 고감도 D1000 시약 | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation 시스템 | Agilent Technologies | G2991AA | 테이프 기반 플랫폼 전기영동 |
| 고감도 DNA 키트 | Agilent Technologies | 5067-4626 | 시약용 고감도 TapeStation 분석 |
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참고문헌
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.
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