다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

요약

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

초록

차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여 종양 DNA (ctDNA) 순환의 분석 임상 종양학의 개발을 위한 유용한 도구가 되고있다. 그러나,이 방법의 응용 프로그램 때문에 혈액에 있는 ctDNA의 양을 추적 분석에서 낮은 감도 도전 이다. 또한, 메서드는이 시퀀싱 및 이후 분석에서 거짓 긍정 및 부정적인 결과 생성할 수 있습니다. 타당성과 병원에서 ctDNA 검색의 신뢰성을 개선 하기 위해, 여기 선물이 시퀀싱, 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq) 드문 돌연변이 풍요롭게 하는 기술. ER-Seq 유망한 도구 매우 낮은 주파수 유전 변경 감지를 하 게 하 고 따라서 질병 heterogenicity 공부에 매우 도움이 될 것입니다 1 x 10⁷ 야생-타입 뉴클레오티드에서 단일 돌연변이 구분할 수 있습니다. 고유한 시퀀싱 어댑터의 결 찰, 덕이 메서드 동안 오류 양방향으로 (감각과 antisense)에 대 한 동일한 시간 수정에 ctDNA 분자의 효율적인 복구를 수 있습니다. 덮어 대상 영역의 측정을 풍요롭게 하는 우리의 다양 한 1021 kb 프로브 12 종양에서 종양 관련 드라이버 돌연변이의 95%. 비용 효율적이 고 보편적인 방법이 유전자 데이터의 유일 하 게 성공적인 축적 수 있습니다. 효율적으로 배경 오류 필터링, 후 응급실-seq 정확 하 게 희귀 변이 검색할 수 있습니다. 사례 연구를 사용 하 여, 상세한 프로토콜 프로브 디자인, 도서관 건설, 대상 DNA 캡처 방법론, 데이터 분석 워크플로 포함 하는 동안에 시연 선물이. 일반적으로이 메서드를 수행 하는 과정 1-2 일 소요 됩니다.

서론

차세대 시퀀싱 (NGS), 강력한 도구, 게놈의 신비를 조사 하는 유전 변경을 드러낼 수 있는 정보의 대량을 제공할 수 있습니다. 병원에서 NGS 분석의 응용 프로그램은 특히 맞춤된 의학에 대 한 더 일반적인 되고있다. 그러나 NGS의 가장 큰 한계 중 하나는, 높은 오류 비율입니다. 공부 상속 된 돌연변이 적합 하다, 비록 드문 돌연변이의 분석은 크게 제한^1,2, 특히 "" 액체 생 검에서 얻은 DNA를 분석.

종양을 순환 DNA (ctDNA) 종양 세포에서 헛간 혈액 세포 무료 DNA (cfDNA) 이다. 대부분의 경우, ctDNA의 수량에서는 매우 낮은 하 게 하는 그것의 탐지 및 분석 매우 도전입니다. 그러나, ctDNA는 많은 매력적인 기능: 그것의 고립은 최소한 침략 적, 종양 성장의 초기 단계에서 검출 될 수 있다, 치료 효율성을 반영 하는 ctDNA 수준 및 ctDNA 기본 및 전이성 병 변에서 발견 DNA 변이 포함 ^{3 , 4 , 5}. 따라서, NGS 기술과....

프로토콜

북경 대학 사람들의 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 종양 표본과 혈액 샘플을 가져온 ' s 병원. 서 면된 동의 그들의 샘플을 사용 하 여 환자 로부터 얻은 했다. 참가자는 다음 기준에 따라 상영 했다: 여성, 고급 비 작은 세포 폐암, EGFR p.L858R 돌연변이 질병 진행 EGFR의 두 세션을 다음 타겟으로 Erlotinib, 치료 이전 생어 시퀀싱, 표시 및 저항의 원인을 분석 하 여 새로운 대상 약물을 찾을 ctDNA에 적용 된 응급실-Seq.

1. cfDNA 및 genomic DNA (gDNA) 주변 혈액에서 DNA 추출

1. 주변 혈액 컬렉션 튜브에서의 10 mL를 수집, 반전 부드럽게 위아래로 6-8 번을 혼합. 셀 전단 하지 마십시오. 혈액 샘플 컬렉션 튜브 6-37 ° C에서 최대 72 시간까지 저장할 수 있습니다.
2. 1600 ()에서 10 분 동안 실내 온도에 컬렉션 튜브 원심 g. x
3. 컬렉션 튜브에서 원심 분리기 튜브 일회용 피펫으로 펠 릿 레이어 (백혈구)를 방해 하지 않고 사용 하 여 적절 하 게 표시 4 청소 2 mL 상쾌한 (플라즈마)를 전송.
4. Transfer1 mL 2 mL를 깨끗 한 일회용 피펫으로 적절 하 게 사용 하....

결과

ER-Seq에 사용 되는 풍부한 대상 지역 표 1에 나와 있습니다 1021 kb 프로브는 커버 12 일반적인 종양의 유전자 돌연변이의 95% 이상. 이러한 프로브의 광범위 암 환자의 대다수에 적용이 프로세스를 만든다. 또한, 우리의 독특한 시퀀싱 어댑터 및 기준선 데이터베이스 검사 가능 하 게 그것은 드문 돌연변이 정확 하 게 감지 하.

GDNA 및 주변 혈액에서 추출한 cfDNA의 다른 속성으로 인해 다른 악기 및 표 2에 표시 된 품질 컨트롤에 의해 결정 되는 데이터 품질의 범위가 있다. 성공적으로 추출 된 cfDNA ~ 170 bioanalyzer QC에 의해 분석으로 혈압과 그림 1

토론

그러나 순환 종양 DNA (ctDNA)의 존재는 ctDNA 분석의 응용 프로그램은 여전히 하지 일상적인 임상 연습에 30 여 년 전, 발견 되었다. CtDNA 검출 및 분석을 위한 기술 개발의 ctDNA 방법의 실용적인 응용 프로그램에 대 한 관심 증가 했다. 미세한 잔여 질병, 치료, 그리고 종양 진화와 intratumoral이^{13의 배경 아래 종양 분자 프로 파일에 대 한 응답의 평가 대 한 최소한-침략 적 접근을 제공 종양 모니터링 ctDNA 14}. 향상 된 감도와 특이성 분석의 모든 이러한 응용 프로그램^15,16을 촉진할 것 이다.

이 원고에 응급실-Seq, ctDNA 검출의 감도 향상을 목적으로 유망한 방법 예를 들어 NSCLC 케이스를 사용 하 여 시행 했습니.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
QIAamp 순환 핵산 키트,	Qiagen	55114	cfDNA를 위한 말초 혈액에서 DNA 추출
QIAamp DNA 혈액 미니 키트,	Qiagen	51105	gDNA를 위한 말초 혈액에서 DNA 추출
, Quant-iT dsDNA HS 분석 키트	, Invitrogen	Q32854	측정 cfDNA 농도
Quant-iT dsDNA BR 분석 키트	, Invitrogen	Q32853	측정 라이브러리 농도
Agilent DNA 1000 시약	Agilent	5067-1504	cfDNA 및 라이브러리 단편 측정
Illumina 용 NEBNext UltraII DNA 라이브러리 준비 키트	NEB	E7645L	라이브러리 준비
Agencourt SPRIselect 시약	Beckman	B23317	DNA 단편 스크리닝 및 정제
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	해산
xGen 잠금 프로브	IDT	— &엠대시;	xGen 맞춤형 프로브
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	표적 DNA 캡처
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	표적 DNA 캡처
xGen Lockdown 시약	IDT	1072281	표적 DNA 캡처
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	캡처 후 PCR 농축 라이브러리
KAPA 라이브러리 정량화 키트	KAPA	KK4602	라이브러리 농도 측정
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)	illumina	FC-404-2002	Sequence
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	gDNA 농도 측정
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantify
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubation
16-tube DynaMagTM-2 Magnet	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simpllyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina

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