방법 논문

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

DOI:

10.3791/56358

⸱

2017년 12월 3일

 , 
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

이 논문에서

요약

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이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

초록

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GABAergic 대뇌 피 질의 수는 흥분 성의 피라미드 뉴런의 출력 조절 피라미드 뉴런 앙상블의 출력을 동기화에 중요 한 역할을 하는 셀의 이종 인구. 정신병 무질서, 정신 분열 증, 자폐증, 간 질 등의 다양 한에서 적자 interneuron 함수에 연루 되었습니다. 배아 줄기 세포 로부터 대뇌 피 질의 수의 뿐만 아니라 그들의 개발 및 기능 연구에 대 한 허용 하지만 대뇌 피 질의 interneuron 관련 장애의 병 인을 기본 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 수는 또한, 마이그레이션, 생존과 호스트 대뇌 피 질의 회로 후 이식, 그들 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 이상적인 후보자를 만들기에 통합 놀라운 능력을가지고. 여기, 우리 Nkx2.1 표현 interneuron 창시자와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장성, 높은 효율, 수정 embryoid 몸 단층 방법 제시. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손 수 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 통해 격리 되며 이후 다운스트림 응용 프로그램의 숫자에 사용. 우리는 또한 방법을 풍부 하 게 parvalbumin (태양광 발전) 또는 somatostatin (SST) interneuron 하위 그룹을 도움이 될 수 있습니다 운명 결정의 측면을 공부 하거나 사용 하기 위해 하위 그룹 농축 interneuron에서 도움이 될 것 이라고 하는 치료 응용 프로그램에 제공 이식입니다.

서론

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두 생쥐와 인간에 대략 절반 모든 대뇌 피 질의 억제 수 (CIns)의 발생 과도 subcortical 구조 중간 절 예 하 (MGE) 어디 라고 내 CIns 및 다른 신경 그리고 glial의 neuroepithelial 창시자 하위 그룹 표현 녹음 방송 요인 Nkx2.11,2. CIn 하위 그룹 또는 하위 형태학, neurochemical electrophysiological, 교차 및 연결 특성3,4로 정의 됩니다. MGE 파생 된 CIns로 그룹화 할 수 있습니다 대부분 비중첩 하위 PV 또는 SST, 특정 electrophysiological 및 연결 추세5와 어떤 관계가 식의 그들의 식에 따라. 부전 수, PV 비율에서 특히 그들의 여러 정신병 무질서 및 질병6,7에 연루 되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 줄기 세포 유래 mitotic 창시자 및 대뇌 피 질의 interneuron 생물학 연구 및 세포 기반 요법에 사용 하기....

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프로토콜

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참고:이 프로토콜에서 설명 하는 듀얼 기자 mESC 라인은 요청 (sande@mail.med.upenn.edu).

1. 미디어 준비

참고: 모든 미디어 세포 배양에 사용 하기 전에 37 ° C를 따뜻하게.

  1. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 미디어 (500 mL를 준비)
    1. Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 및 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터 449 ml 50 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.
  2. N2 미디어 (500 mL를 준비)
    1. 5 mL L-알라닌-L-글루타민 추가 (100 x) 및 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 489.5 ml DMEM: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12), 그리고 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터.
    2. 여....

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결과

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이 문서에 설명 된 프로토콜 우리의 게시 프로토콜15,,1617 의 수정된 된 버전 이며, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 선으로 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. DD0-5, 다시 도금 DD8에서 결합 XAV 939 Wnt 억제제를 추가 하 여 우리는 어떤 점에서 모든 DAPI + 핵 문화에서의 50% 이상을 또한 Nkx2.1 표현 (그림 1A, B) 강력한 Nkx2.1 유도 달성. MCherry 및 GFP 기자 Immunohistochemistry Nkx2.1-긍정적인 immunoreactivity (그림 1A)의 영역에서 .......

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토론

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이 메서드는 J1 파생 된 mESCs (SCRC-1010) 패턴에 매우 효과적인, 우리 다른 mESC 라인과 클론 분리 변수 성공을 경험 했다. 예를 들어, Foxg1::venus mESCs (EB3 파생; Danjo 외. 이 프로토콜을 Foxg1 DD12에 의해 유도 제대로 13) 응답은 일반적으로 1-2%의 순서. 이유로 우리가 완전히 이해 하지 않는 또 다른 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 클론 (나 JQ59) (JQ27 불리)이이 프로토콜에서 설명 하는 라인으로 동시에 고립 되었던 생산 1% 미만 Nkx2.1 표현 세포 성장 하는 때 동일한 조건. 상위 라인 (J1; 그러나 ATCC SCRC-1010),,이 프로토콜에 잘 응답 하 고 그림 1B에서 표시 된 것과 유사한 DD12에 Nkx2.1 표현 세포의 백분율을 생성. 필요한 경우 XAV 939와 쉬/SAG의 농도 줄 단위로 분화 조건.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는이 프로토콜을 개발 하는 데 도움에 그들의 초기 작업에 대 한 Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP 듀얼 기자 mESC 라인으로 제니퍼 타이슨, Asif Maroof 및 팀 페트 로스를 개발 하기 위한 청나라 Xu에 감사. 우리는 또한 빨리 흐름 cytometry 핵심을 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 MH066912 (SA)와 F30 MH105045-02 (DT)에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
보틀탑 진공 필터 시스템CorningCLS430769
시험관, 스냅 캡ThermoFisherCorning 352235
마우스 배아 섬유아세포(CF-1, MEF, IRR, 7M),MTI-GlobalstemGSC-6101G7M MEF의 1개 바이알은 4개의 10cm TC 플레이트에 충분합니다. 참조: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2항균제라고도 합니다. 기본 매체로 여과하지 말고 여과 후 추가하십시오. 참조: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156기본 미디어로 필터링하지 않음 -- 추가 여과 후
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061L-알라닌-L-글루타민으로도 알려져 있습니다. 참조: 9,11,38,39
KnockOut 혈청 대체(KSR)ThermoFisher10828028무혈청 매체 보충제라고도 합니다. 참조: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018DMEM을 함유한 비글루타민이라고도 합니다. 참조: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578줄기세포 등급 FBS라고도 합니다. 참조: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107얼리지 말고 4'C에서 보관하십시오. 참조: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% 젤라틴 용액ATCCATCC PCS-999-027
라미닌시그마L2020
폴리-L-라이신시그마P6282
트립신-EDTA(0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501비트립신 함유 세포 해리 시약이라고도 합니다. 참조: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074DMSO에서 재현탁 및 일회용 부분 표본에서 -80'C에 보관
XAV939Stemgent04-0046DMSO에서 재현탁 및 일회용 부분 표본에서 -80'C에 보관
rhFGF-2R& 시리즈 D Systems233-FB0.1% BSA로 PBS에 재현탁하고 일회용 분취액
rhIGF-2R&에서 -80'C에 보관; D Systems291-G10.1% BSA로 PBS에 재현탁하고 일회용 분취액에서 -80'C에 보관
ROCK 억제제(Y-27632)Tocris1254DMSO에 재현탁하고 일회용 분취량에서 -80'C에 보관
활화 작용제(SAG)Millipore566660-1MGH20에 재현탁하고 일회용 분취액에서 -80'C에 보관
rm Sonic Hedgehog/SHHR& D Systems464-SH-0250.1% BSA로 PBS에 재현탁하고 일회용 분취액 PKC&zeta에서 -80'C에 보관
; 유사기질 억제제, MyristoylatedEMD Millipore539624H20에 재현탁하고 일회용 분취액에서 -80'C에 보관
: 세포 여과기가 있는 , , , , 평

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696....

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Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron DifferentiationNkx2 1 ProgenitorsFluorescence Activated Cell SortingEmbryoid Body Monolayer MethodParvalbumin Interneuron EnrichmentSomatostatin Interneuron SubgroupsDual Reporter mESC LineCell Transplantation ProtocolNeural Fate Determination

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