이 연구에서 우리는 신경 퇴행 성 조건 하에서 혈액-뇌 장벽 장애를 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시. 우리의 목표를 달성 하기 위해 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC) 주입-마우스 경으로 알 부 민 정 맥 및 형광 현미경 검사 법에 의해 뇌 실질에 그것의 누설을 평가.
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방법 논문
FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
혈액-뇌 장벽 (BBB) 무결성의 중단은 다른 신경 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 일반적인 기능입니다. 교란된 BBB 항상성 및 뇌 질환의 병 인 사이 상호 작용 추가 조사 필요, 비록 개발 및 BBB 변경 정확 하 게 감지 하는 신뢰할 수 있는 프로시저의 유효성 검사 중요 한 그리고 유용한 도구를 대표 잠재적으로 질병을 예측에 대 한 진행 및 개발 대상 치료 전략.
여기, 우리는 그런 결함 BBB의 침투성에는 천재에 명확 하 게 감지할 수 있는 헌팅턴 질병의 전 임상 마우스 모델에서 발생 하는 신경 상태에서 BBB 누설을 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시 질병입니다. 특히,는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC)-알 부 민, 장애인은 경우에 BBB를 교차 수 있는 마우스 경 정 맥 혈관 이나 parenchymal 지구에 그것의 배급에 심하게 융합은 다음 형광 현미경 검사 법에 의해 결정 됩니다.
뇌 실질에 녹색 형광 민의 축적 탈 BBB 침투성의 색인 기능 그리고 때 quantitated J 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 그린 형광 강도로 보고 됩니다.
서론
중앙 신경 조직 (CNS) 내의 항상성 적절 한 커뮤니케이션 및 신경 세포의 기능에 대 한 전제 조건입니다. CNS 실질은 단단히 봉쇄 주변에서는 내 피 혈액-뇌 장벽 (BBB), 주변 혈 류와 뇌 간의 인터페이스와이 두 지구1 사이 잡담에 중추적인 역할을 하 여 ,2. Bbb 등급은 복잡 하 고 동적 3 차원 구조는 주로 전문 마이크로-혈관 내 피 세포 (ECs) 세포 접합 단지-단단한 접속점 (TJs)-를 통해 서로 연결 하 고 pericytes에 의해 포위의 구성 신경 엔딩과 사이토 발 프로세스1,2.
생리 적인 조건 하에서 그대로 BBB의 매우 낮은 침투성 그리고 두뇌, 영양소와 다른 분자의 수송의 엄격한 규제를 보장 하 고 CNS에서 발생 하는 변화에서 독특한 보호를 제공 한다는 구성 및 가능성 주변에 대 한 신경 활동에 영향을 줄 수 있는 혈액의 모욕1,2,3
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프로토콜
IRCCS Neuromed 동물 관리 검토 위원회에 의해 그리고 동물에 대 한 모든 절차 승인 " Istituto 레 디 Sanità " (허가 번호: 1163/2015-홍보) EU 지시문 2010의 지침에 따라 했다 / 63/EU 동물 실험에 대 한.
1. 경 정 맥에 주입 FITC 민 솔루션의 준비
참고: 모든 실험 했다 매니페스트 (11 주 된) HD R6/2 마우스에 고 나이에 날 라와 일치 하는 성별 야생-타입 (WT) 제어 littermates.
- 디졸브 FITC-알 부 민 분말 (재료의 표 참조) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 10 mg/ml에서.
참고: 최적의 결과 얻으려면이 준비 되어야 한다 신선한 각 라벨 반응.
2. 수술에 동안 사용 장비의 준비
- 이전 압력가 수술 도구 (재료의 표 참조) 때 려 눕.
- 알코올 (70% 에탄올 솔루션) 수술 벤치 청소. 외과 살 균 일회용 수건 드 레이프와 외과 영역 (45 x 45cm)를 준비 하 고 운영 stereomicroscop....
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결과
적절 한 주입 FITC 민의 BBB는 두뇌 parenchymawhen으로 혈 류에서 녹색 형광 추적 프로그램의 넘쳐 흐름에 경 정 맥 결과6손상. 생리 적인 조건 하에서 생긴된 형광 민의 뇌 혈관의 내부에 제한 된 이며 주변 혈관 주위 지역 및/또는 뇌 실질에 신호 감지 (그림 1A, 현미경에는 탑)입니다. 반대로, BBB 신경 병 적인 상황에서 손상 될 때 FITC 민 보여줍니다 확산 형광 패턴 혈관 주위 공간에 따라 뇌 실질 (그림 1A, 하단에 현미경)에. 공동 관 표시와 함께 얼룩, laminin, FITC 민 축적 (그림 1A) 사이트를 명확 하 게 지역화 하는 데 사용 됩니다. FITC-민 손상 된 BBB에 의해 방출 증가 녹색 형광 강도 이미지 프로세싱 소프.......
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토론
우리는 여기에 설명 하는 기술 두뇌 질병 조건 하에서 BBB 누설을 탐지 하는 데 주로 유용 합니다. BBB 역 기능은 다양 한 신경학 적 장애4의 일반적인 기능으로 관심을 얻고 있다. 우리는 이전 HD6같은 희귀 신경 질환의 마우스 모델에서 BBB 무결성의 초기 혼란을 설명 하기 위해이 방법을 사용.
이 방법은 정확 하 고 신뢰할 수 있는 결과 제공 하는 절차의 효율성과 상대적 단순 활용 걸립니다. 그것은 매우 중요 한 전 임상 연구 도구를 나타냅니다 하 고 속도 직접 sectioned 뇌 조직 내에서 녹색 형광의 간단한 시각화 하 여 BBB 붕괴를 질적 평가에서 제공 하는 데 유용. 그러나, 분석 생화학 및 분자와 결합 하면, 기술은 성공적 혈관 내 피 TJs의 구조적 및 기능적 무결성에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하 이며 BBB의 상관 관계의 분석을 허용 와 뇌 항상성 교란 한다입니다........
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공개 사항
저자는 공개 충돌의 관심을가지고
감사의 글
이 작품 "피코 Neuromed"에 의해 지원 되었고 건강 V.M. 게 "검색 전류"의 이탈리아 정부에 의해 자금
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알부민-플루오레신 이소티오시아네이트 콘지우게이트 | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb 안티 라미닌 | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 안티 토끼 | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| 커버 슬립 24 x 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik 최적 절단 온도(OCT) 화합물 | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD 마운팅 미디어 | VECTOR | H-1500 | |
| iNSu/Light 인슐린 일회용 주사기 | RAYS 건강 및 안전 | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2 " | BD Microlance | 304000 | 인슐린 일회용 주사기 |
| 메스 핸들 | |||
| # 22 일회용 메스 블레이드 | FST | 10022-00 | |
| 파인 아이리스 가위 10.5cm | FST | 14094-11 | |
| Dumont 펜치 #5745 45°C; 0.10 x 0.06mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| 그레이프 겸자 10cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont 집게 # 5 0.1 X 0.06 mm | FS | 11251-20 | |
| 의료 패치 | Medicalis | 34788 | |
| 멸균 일회용 수건 드레이프 | Dispotech | TVO50VE | |
| 입체 현미경 | NIKON | SMZ 745 T | |
| 광학 조명기 LED 조명(C-FLED2) | NIKON | 1003167 | 광학 조명기 입체 마이크 |
| 스코프 이클립스 Ni-U 현미경 | Nikon | 932162 | Epifluorescence 현미경 |
| 현미경 디지털 카메라 | Nikon | DS-Ri2 | 현미경 카메라 |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | 현미경 램프 |
| NIS - 요소 64 비트 | Nikon | AR 4.40.00 | 분석 소프트웨어 |
| 전기 면도기 | Gemei | GM-3007 |
참고문헌
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
