여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

요약

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

초록

미생물학의 분야에 있는 연구는 다양 한 방법론의 구현에 의존합니다. 특히, 적절 한 방법의 개발은 실질적으로 독특한 질소와 탄소 소스를 포함 하는 화학적으로 정의 된 미디어에서 성장 하는 미생물의 물질 대사의 광범위 한 지식을 제공에 기여 한다. 반면, 여러 소스의 영양소, 자연 또는 산업 환경에 광범위 한 그들의 존재에도 불구 하 고 신진 대사를 통해 관리 거의 미개척 남아 있습니다. 이 상황은 조사 방해 적합 한 방법론의 부족 때문에 주로 이다.

우리는 양적 및 포괄적 대사 영양소는 다른 분자, 즉, 복잡 한 리소스의 혼합물으로 제공 하는 때 작동 하는 방법을 탐구 하는 실험적인 전략을 보고 합니다. 여기, 우리는 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할을 평가 하기 위한 응용 프로그램을 설명 합니다. 워크플로 안정 동위 원소 추적 실험 선택한 ¹³C-또는 ¹⁵N 표시 기판 사용 하는 동안 얻은 정보를 결합 합니다. 그것은 먼저 이루어져 있다 N 포함 된 분자;의 혼합물을 포함 하는 동일한 매체에 병렬 및 재현성 발효 그러나, 선택 된 질소 소스 때마다 표시 됩니다. 대상된 화합물의 라벨 패턴을 평가 하 고 소비 및 다른 대사 산물에 기판의 복구를 계량 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합을 구현 됩니다. 완전 한 데이터 집합의 통합된 분석 셀 내에서 사용 된 기판의 운명에 대 한 개요를 제공합니다. 이 방법은 발효의 온라인 모니터링을 위한 로봇 기반 시스템에 의해 샘플-촉진의 컬렉션에 대 한 정확한 프로토콜을 필요-그리고 수많은 시간이 걸리는 분석의 공적. 이러한 제약에도 불구 하 고 그것은 이해 하 고, 처음으로, 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할 허용. 우리는 다른 N 화합물 쪽으로 더 풍부한 소스에서 질소의 재분배를 해명 하 고 휘발성 분자와 proteinogenic 아미노산의 대사 기원 결정.

서론

미생물 물질 대사 작동 하는 방법 이해는 발효 프로세스를 개선 하 고 발효 화합물의 생산을 조절 하는 효율적인 전략의 디자인에 대 한 중요 한 문제 이다. 유전체학 및 기능 유전체학이 마지막이 십년에서 크게 지식의 많은 미생물 대사 네트워크의 토폴로지를 확장에 기여. 이 정보에 액세스할 세포질 기능¹의 포괄적인 개요를 목표로 하는 방식의 개발을 주도. 이러한 방법론은 자주 측정 매개 변수 모델 기반 해석에 의존합니다. 이 실험 데이터 포함, 한 손으로, 대사 산물 통풍 관 및 생산 속도 하 고, 다른 한편으로, 양적 세포내 얻은 정보를 동위 원소 추적 프로그램에서 실험. 이러한 데이터는 정의 된 대사 네트워크^2,,34다른 통로의 vivo에서 활동의 공제에 대 한 필수 정보를 제공합니다. 현재, 사용할 수 있는 분석 기법만 단일 요소 동위 원소를 사용 하 여 분자의 패턴을 라벨의 정확한 검색을 사용 가능 하 게 하 고 공동 두 동위 요소와 라벨 때. 또한, 대부분의 성장 조건에서 탄소 소스만 구성 되어 하나 또는 두 화합물의 있습니다. 따라서, 탄소 기판에서 ¹³C 동위 원소 예 광 탄에 따라 접근 넓게 그리고 성공적으로 적용 된 탄소 대사 네트워크 작업^{5,6,7의 완전 한 이해를 개발 하 ,8}.

대조적으로, 많은 자연 및 산업 환경에서 미생물 성장을 지 원하는 사용할 수 있는 질소 리소스는 다양 한 분자의 구성 자주 됩니다. 예를 들어 와인 또는 맥주 발효 하는 동안 질소 18 아미노산 및 가변 농도⁹암모늄의 혼합물으로 제공 됩니다. Anabolism 액세스할 수 있는 N 화합물의이 만드는이 복잡 한 미디어 조건 크게 다른 생리 적 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 후자 질소, 일반적으로 암모늄의 독특한 소스를 사용 하 여 달성 하는.

전반적으로, 질소 화합물 직접 단백질에 통합 되거나 catabolized 내 면. 효 모 Saccharomyces cerevisiae를 포함 하 여 많은 미생물 물질 대사 질소의 네트워크 구조는 매우 복잡 한 기판의 다양성에 따라. 개요로,이 시스템은 글루타민, 조미료, α ketoglutarate^10,11, transaminases와 deaminases의 interconversion를 catalyzes 질소 물질 대사의 중앙 코어의 조합을 기반으로 합니다. 이 네트워크를 통해 암모늄 또는 다른 아미노산에서 아민 그룹 수집 하 고 α-keto 산 발표 했다. 이 중간체는 또한 중앙 탄소 대사 (CCM)^12,13synthetized. 이 많은 수의 분기 반응 및 중간체, 외 인 질소 소스의 놓을 proteinogenic 아미노산의 anabolism에 관련 된 세포의 근육 요구 충족. 이러한 다른 상호 경로 통해 활동 대사 산물의 배설에도 발생합니다. 특히, α-keto 산 제품의 감각 프로필에 필수적인 참여자는 더 높은 알콜 및 그들의 아세테이트 에스테 르 유도체¹⁴, Ehrlich 통로 통해 리디렉션할 수 있습니다. 그 후, 질소 대사 작동 하는 방법 바이오 매스 생산 및 휘발성 분자를 (향기)의 형성에 중요 한 역할을 재생 합니다.

반응, 효소, 및 질소 대사에 관여 하는 유전자는 문학에서 광대 하 게 기술 된다. 그러나, 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 배포의 문제는 아니라 아직 해결 되었습니다. 정보의이 부족을 설명 하는 두 가지 주요 이유가 있습니다. 첫째, 질소 대사 네트워크의 중요 한 복잡성의 관점에서 정량적 데이터의 큰 금액은 사용할 수 작업의 완전 한 이해에 필요한 지금까지. 두 번째, 많은 실험의 제약 조건 및 분석 방법의 한계 방지 이전 CCM 함수 설명에 사용 된 방법의 구현.

이러한 문제를 극복 하기 위해 우리는 일련의 동위 원소 추적 실험에서 데이터의 화해를 기반으로 하는 시스템 수준 접근 방법을 개발 하기로 결정 했다. 워크플로가 포함 되어 있습니다.
-다른 선택한 영양 소스 (기판) 때마다 표시 하는 동안 발효 된 동일한 환경 조건 하에서 실시.
-레이블된 기판 및 농도의 잔류 농도 및에서 파생 된 화합물의 동위 원소 농축 발효의 여러 단계에서 정확한 결정을 위한 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합 파생 된 바이오 매스를 포함 하 여 레이블이 지정 된 분자의 놓을.
-각 질량과 동위 균형의 계산 소비 레이블이 분자 및 유동 비율의 결정을 통해 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리에 대 한 글로벌 개요를 얻기 위해 데이터 집합의 추가 통합된 분석 .

이 방법론을 적용 하기 위해 주의 문화 사이의 긴장/미생물의 재현 동작에 지불 되어야 합니다. 또한, 다른 문화에서 샘플 같은 잘 정의 된 발효 진행 중 촬영 해야 합니다. 이 원고에 보고 하는 실험적인 작품에서 로봇 기반 시스템 이러한 제약 조건에 대 한 계정에 발효의 온라인 모니터링에 대 한 사용 됩니다.

또한, 연구의 과학적 문제를 해결 하기 위해 적절 한 레이블이 기판 (화합물, 자연, 그리고 라벨의 위치)의 집합을 선택 하는 것이 필수적입니다. 여기, ¹⁵N 표시 된 암모늄, 글루타민, 아르기닌 포도 주스에서 발견 세 가지 주요 질소 근원으로 선정 됐다. 이 proteinogenic 아미노산에 소비 화합물에서 질소 재배포의 패턴을 평가 허용. 우리는 또한 소비 아미노산 및 휘발성 분자의 생산에 그들의 공헌의 탄소 등뼈의 운명을 조사 목적. 충족 시키기 위해이 목표, 균일 하 게 ¹³C 라는 신, 이소류신, 트레오닌, valine 포함 되었다 연구에 Ehrlich 통로의 주요 중간체에서 파생 된 아미노산으로.

전반적으로, 우리 양적 효 모 또한으로 탄소 선구자의 초과 제거 하는 동안 발효를 통해 근육의 요구 사항을 충족 하는 외 인 질소 소스를 재배포 하 여 복잡 한 질소 리소스를 관리 하는 방법을 탐구 휘발성 분자입니다. 이 논문에 보고 된 실험 절차 다른 미생물에 의해 사용 된 다른 여러 영양소 소스 조사에 적용할 수 있습니다. 그것은 미생물의 대사 행동에 유전 배경이 나 환경 조건 영향의 분석에 대 한 적절 한 접근을 것 처럼 보인다.

프로토콜

1. 발효 및 샘플링

1. 미디어와 fermenters의 준비
   참고: 모두는 발효 수행 됩니다 밖으로 동일한 긴장을 사용 하 여 병렬로 같은 화학적 합성 매체 (SM, 표 1에서 제공 하는 구성), 정의 질소 소스¹⁵암모늄과 아미노산의 혼합물을 포함. 반면 다른 레이블이 각 발효에 대 한 단일 질소 화합물 균일 하 게 레이블이 지정 된 ¹³C 또는 ¹⁵N 형태 (100%)에 독점적으로 제공 됩니다. 실험의 세트에 사용 되는 각 레이블이 질소 소스에 대 한 (여기: ¹⁵NH₄, U-¹⁵N4-Arg, U-¹⁵n 2-Gln, U-¹³C6-레이, U-¹³c 5-발, U-¹³c 6-일, U-¹³c 4 세), 두 fermenters는 준비 하 고 있다. 각 조건에 대 한 중복 발효 레이블이 없는 분자 (7 제어 발효)만 사용 하 여 수행 됩니다.
   1. 각 N-소스 공부, SM의 500 mL를 준비에 대 한 100%에 사용 되는 화합물을 제외 하 고 표 1에 나열 된 모든 질소 소스를 포함 하는 매체 형태 분류.
      참고: 레이블이 분자는 다음 단계에서 추가 됩니다.
   2. 저온 (10 분, 100 ° C) 1 L 플라스 크에 각 매체 포함 하는 자석 교 반 바. 표 1 에 보고 된 최종 농도 도달 레이블이 분자의 적절 한 금액을 무게와 매체에 그것을 분해.
   3. (셀 루 로스 아세테이트 멤브레인, 0.22 μ m) 일회용 진공 여과 시스템을 사용 하 여 매체를 소독. 살 균 측정 실린더를 사용 하 여 두 미리 소독된 fermenters (250 mL)와 산소의 항목을 방지 하기 위해 CO₂의 릴리스를 수 있도록 발효 잠금을 갖추고 있습니다 자석 교 반 막대를 포함 하는 사이 매체를 나눕니다.
   4. 1 박 (온도 28 ° C에서 설정)에 대 한 보육 공간에 배치 하 여 28 ° C에 발효 플라스 크를 열.
2. 접종 및 발효의 모니터링
   1. S. cerevisiae 변형 YPD 매체 12 h (150 rpm)을 떨고와 28 ° C에서의 10 mL를 포함 하는 살 균 튜브를 성장. 그런 다음 YPD의 1 mL를 피펫으로 preculture와 10 mL (15 mL 무 균 튜브)에 SM 매체의 전송. 떨고 (150 rpm)와 28 ° C에 12 h에 대 한 문화를 품 어.
   2. 층 류 흐름에서 preculture aliquot를 수집 하 고 100 µ m 조리개를 장착 하는 전자 입자 카운터를 사용 하 여 셀 인구를 계량 합니다. Preculture (g, 15 분, 4 ° C x 2000) centrifuge와 2.5 x 10⁸ 셀/mL의 최종 농도를 살 균 물의 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 일시 중단. 셀 서 스 펜 션의 1 mL와 함께 각 fermenter 접종
      참고: 발효 진행 상황을 모니터링 하는 데 사용 하는 로봇 시스템은 그림 1에 설명 되어 있습니다.
   3. 제대로 21 위치 교 반 접시에 배치 하 고 270 rpm에서 교 반 속도 설정 하는 지원 가이드에 있는 fermenters를 설치 하 여 발효 플랫폼을 준비 합니다. 각 발효의 온라인 모니터링을 시작 하려면 로봇 제어 응용 프로그램을 시작 다음 "시작 시험" 버튼을 클릭 하 고 발효 볼륨 (300 mL) 실행 될 것을 선택 합니다.
   4. 표시 된 인터페이스는 플랫폼에 숫자의 표시와 fermenters의 위치를 허용합니다. 이 발생 되도록 슬롯 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "활성화"이이 위치에 있는 fermenter의 모니터링을 활성화 하려면 선택 합니다.
   5. 영구적으로 무게 수집을 시작 하기 전에 시스템에서 실행 중인 계산 소프트웨어를 초기화 합니다. "Initialiser" 버튼 클릭 하 고 "확인"을 클릭 확인. 무게 인수를 시작 하는 로봇 제어 응용 프로그램의 "시작 버튼"을 클릭 합니다.
3. 샘플링 절차
   참고: 각 fermenter에 대 한 샘플 촬영 공동₂ 생산 (값 계산 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터에 온라인 표시)에 도달 하면 필요한 설정 포인트: 5, 10, 40, 그리고이 연구에서 90 g/L.
   1. 레이블이 지정 된 화합물과 문화에 대 한 절차를 샘플링.
      1. 두 6 mL 샘플 (g, 5 분, 4 ° C x 2000) 원심 저장 하 고 냉동된 supernatants-80 ° c.에 2 개의 aliquots에 저장 5 mL 증 류 물과 동위 원소 풍부의 측정-80 ° C에서 저장소 두 번 펠 릿을 세척.
   2. 레이블이 지정 된 화합물 없이 문화에 대 한 절차를 샘플링
      1. 수확 10 mL의 문화, 건조 중량 확인을 위해 사용 될 것입니다. 원심 분리 (2000 x g, 5 분, 4 ° C)에 의해 두 개의 10ml 샘플에서 세포를 작은. 증류수 10 mL로 두 번 펠 릿을 세척 하 고 단백질과 아미노산 콘텐츠 결정-80 ° C에서 저장.

2입니다. 소비 질소 근원의 정량화

1. 잔여 암모니아 농도의 효소 결정
   참고: supernatants에 암모니아 농도의 결정 상업 효소 기반 키트;를 사용 하 여 수행 됩니다. 모든 시 약은 제조 업체에 의해 제공 됩니다.
   1. 그래서 정확 하 게 무게 (NH₄)₂의 25 mg를 용 해 하 여 표준 암모니아 솔루션 (61.4 mg/L)를 준비 100 mL 부피 플라스 크에₄ .
   2. 제조업체의 지침을 수행 하기 위해 발효 전에 CO₂ 출시의 5 g/L에서 찍은 샘플의 1:2 희석을 수행 합니다. 1 M 코를 추가 하 여 약 8 샘플의 pH를 조정 합니다. 추가 볼륨의 고 희석 요인에 계정에 걸릴.
   3. 4 mL 분 광 광도 계 큐 벳에 믹스 100 µ L의 샘플 (필요한 경우 희석), 물 또는 표준 암모니아 솔루션 (0.75 m m ADP와 pH 7.8 버퍼에서 30 U/mL 조미료 효소)는 약 1의 2 개 mL과 500 µ L 시 2 (1.3 m m NADH)의 소 주. 실 온에서 15 분 동안 품 어와 340 NADH의 흡 광도 읽고 nm (A1).
   4. 약 3 (60 m m α-pH 8 버퍼에서 ketoglutarate)의 500 µ L를 추가 하 고, 실 온에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어 340 NADH의 흡 광도 읽고 nm (A2).
   5. 암모니아 농도 사용 하 여 계산.
      C_암모니아 (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_샘플-(0.839 x A1-A2)_증류수]
   6. 정확한 농도 표준 솔루션으로 가져온 확인 하십시오.
2. 잔여 아미노산 농도의 컬럼에 결정
   참고: supernatants에 아미노산 농도의 결정 허용 ninhydrin과 N 화합물의 게시물 열 derivatization와 이온-교환 크로마토그래피에 따라 산 성 아미노산 전용된 분석 시스템을 사용 하 여 달성 그들의 색도계 탐지입니다.
   1. 중성 및 산 성 아미노산의 상업 혼합물의 200 µ L, 기본적인 아미노산의 상업 혼합물의 200 µ L 및 2.5 m m 글루타민의 200 µ L 200 m m 리튬 구 연산 염 버퍼, pH 2.2의 400 µ L을 추가 하 여 참조 솔루션을 준비 합니다. 이 화학적으로 정의 된 참조 솔루션 샘플으로 처리 됩니다.
   2. 높은 분자 무게를 가진 분자를 제거 하는 샘플의 800 µ L를 2.5 m m norleucine (내부 표준)를 포함 하는 25% (w/v) sulfosalicylic 산 성 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. 1 h 4 ° C 원심 분리기 (g, 10 분, 4 ° C x 3000), 0.22 μ m 기 공 크기 니트로 막 (주사기 시스템)을 통해 필터에 대 한 품 어.
   3. 프로그래머 소프트웨어 클릭 액체 크로마토그래피를 시작 "실행" 버튼 (LC) 분석 양이온 교환 칼럼 (리튬 양식)을 갖춘 분석기와 함께 합니다. 온도 기울기 (표 2)와 함께에서 카운터 이온 농도에 pH 그라디언트 및 그라디언트를 만들려는 연속 리튬 버퍼가 아미노산 elute
   4. 570에서 spectrophotometric 검출기 ninhydrin derivatization 후 질소 화합물을 계량 nm (보라색 채색: 아미노산을 ninhydrin과 아민 그룹 사이 반응) 및 440 nm (황색 채색: ninhydrin 및 것의 그룹 사이 반응 프롤린)입니다.
   5. 제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 샘플에서 아미노산의 농도 계산 하는 내부 표준 참조 솔루션 및 norleucine를 사용 하는 단일-지점 내부 캘리브레이션을 수행 합니다.

3입니다. Proteinogenic 아미노산의 정량화

1. 드라이 셀 무게의 측정
   1. 미리 무게에 있는 알루미늄 컵 진공 장치를 사용 하 여 니트로 필터 (기 공 크기 0.45 μ m)를 통해 문화의 10 mL를 필터링 합니다. 증류수 50 mL 두 번 씻어.
   2. 알루미늄 컵에 필터를 배치 하 고 컵에 필터 reweighing 전에 48 h (때까지 무게에 더 변화는 관찰) 105 ° C에서 열 오븐에서 건조. 무게 차이 계산 합니다.
   3. 효 모 문화의 건전지 무게를 정확 하 게 결정을 최소한 3 독립적인 측정의 평균을 계산 합니다.
2. 세포의 단백질 함량의 정량화
   참고: 셀의 단백질 분수의 정량화는 적어도 섹션 1.3.2에에서 설명 된 대로 가져온 레이블이 셀 펠 릿을 사용 하 여 3 중에 수행 됩니다.
   1. 냉동된 알 약을 DMSO 솔루션 (50 %v / v)의 1 mL의 추가 의해 단백질을 추출 하 고 건조 열 오븐에서 1 h 105 ° C에서 품 어.
   2. 더 블루 복합물 (BCA 분석 결과)에 있는 bicinchoninic 산에 의해 시 켰 던 Cu⁺ 이온으로 Cu +⁺ 의 단백질에 의해 감소에 따라 생화학 색도계 분석 결과 사용 하 여 DMSO 추출에서 단백질 콘텐츠 계량.
3. 단백질에서 아미노산의 상대적인 기여의 결정
   참고: proteinogenic 아미노산의 프로 파일 레이블이 셀 펠 릿 (1.3.2)에서 3 중에서 적어도 결정 됩니다.
   1. Performic 산 (90% 포 름 산, 과산화 수소 10%)의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 하 여 추출 물 산화를 준비 합니다. 4 ° C에서 4 h incubate 고 33.6 mg 나트륨 황산 염의 반응을 중지 합니다.
      참고: 산화 단계는 시스테인과 메티오닌의 메티오닌 sulfone 및 cysteic 산, 더 이온-교환 크로마토그래피에 의해 양이 정해질 것 이다 변환 합니다. 그러나, 일부 아미노산 (티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 및 아르기닌)는 산화 처리 하는 동안 변성 됩니다. 따라서, 2 개의 hydrolysates (와 산화 없이) 준비 된다.
   2. 셀 펠 릿을 6N HCl의 800 µ L를 추가 또는 추출 물 산화 및 건 열 오븐에서 110 ° C에서 16 h에 대 한 밀폐 유리 튜브에 샘플을 품 어. 2.5 m m norleucine의 200 µ L을 추가 하 고 질소의 흐름과 함께 HCl을 제거. 씻고 (말린된 추출 물 resuspending 액체 질소 스트림 제거) 그리고 800 µ L의 에탄올과 증류수의 800 µ L로 두 번. 200 m m 리튬 아세테이트 버퍼, pH 2.2의 800 µ L에 차지 합니다.
      참고: 주의 가수분해에 대 한 보육 시간에 일부 아미노산은 산 성 조건 하에서 안정으로 지불 합니다. 이 아미노산은 전적으로 HCl 가수분해 중 변성으로 단백질에서 트립토판 분수 문학¹⁶에서 발견 하는 데이터에서 추정 된다.
   3. 단일-지점 내부 교정의 표준 준비. 200 m m 리튬 아세테이트 버퍼, pH 2.2, 625 µ M 메티오닌 sulfone, 625 µ M cysteic 산, 및 625 µ M norleucine 포함 된 840 µ L를 분해 된 아미노산의 상용 솔루션의 160 µ L를 추가 합니다.
   4. 섹션 2.2에에서 설명 된 컬럼에 메서드를 사용 하 여 단백질에서 아미노산의 상대적인 농도 결정 합니다.
4. 계산
   1. 단백질 추출 (mg/L에서 합계)에서 측정 했다 아미노산의 총계에 의해 각 아미노산 (mg/L)의 측정된 금액을 분할 하 여 단백질에서 각 아미노산의 무게 백분율을 계산 합니다.
   2. 문화 (mg/L), 즉, 생물 자원의 단백질 콘텐츠 및 문화 (mg/L)에서 각 proteinogenic 아미노산의 농도 평가 하기 위해 건조 중량 사이 제품에 있는 단백질의 농도 의해이 비율을 곱하면 됩니다.

4. Proteinogenic 아미노산의 동위 원소 농축의 측정

참고: proteinogenic 아미노산의 동위 원소 농축의 측정에 대 한 레이블이 셀 펠 릿 사용 합니다. 3 다른 에이전트 derivatization 단계 동위 원소 농축 아미노산의 계량에 사용 됩니다. 클러스터 이온의 농도 아미노산의 라벨 패턴 예측을 측정 됩니다. 대량 isotopomers의 풍부에 해당 하는 각 클러스터 이온에서 신호 (m₀ 없이 라벨, m_{+ 1} = = 1 개 아톰...) 아미노산 조각. DMADMF 수술 후 얻은 크로마의 예는 그림 2에 제공 됩니다.

1. 바이오 매스의 가수분해
   1. 6 M HCl의 1.2 mL을 추가 하 고 건조 열 오븐에 단단히 닫힌된 유리관에 105 ° C에서 16 h에 대 한 샘플을 배양 하 여 셀 펠 릿 (말린된 바이오 매스의 1-2 밀리 그램에 해당)은.
   2. 세포질 파편을 제거 하 5 분 동안 3000 x g 에 증류수와 원심 분리기의 1.2 mL를 추가 합니다. 오픈 유리 튜브에 6 400 µ L 분수에는 상쾌한을 배포 합니다. 105 ° C에서 열 오븐에서 분수를 건조 시럽 (4-5 h)의 일관성에 도달할 때까지.
2. Ethylchloroformate (ECF) derivatization
   1. 20 m HCl; M의 200 µ L에 말린된의 해산 그런 다음 피리 딘: 에탄올 (1:4)의 133 µ L를 추가 합니다. 아미노산을 derivatize 하 고 모든 CO₂ 가 릴리스 되었습니다 때까지 기다려야 하는 ECF의 50 µ L를 추가 합니다. 원심 관의 derivatized 화합물을 추출 하는 dichloromethane 500 µ L을 포함 하는 혼합물을 전송 합니다.
   2. 와 동 10 s 및 원심 분리기 튜브 10000 x g;에서 4 분에 대 한 그들 샘플 GC/MS에 직접 주입 될 수 있습니다 있도록 원뿔 유리 삽입을 포함 하는 GC 튜브에 파스퇴르 피펫으로와 전송 낮은 유기 단계를 수집 합니다.
3. (N, N)-Dimethylformamide 디 메 틸 아 세 탈 (DMFDMA) derivatization.
   1. 메탄올의 50 µ L에 이기의 200 µ L 말린된의 분해. DMFDMA의 300 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 및 전송 샘플 GC autosampler 원뿔 유리 삽입을 포함 하는 리 바이 알.
4. N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
   1. 이기의 200 µ L에는 일시 중단 합니다. BSTFA의 200 µ L을 추가, 밀폐 유리 튜브를 닫고 추출 GC 튜브를 직접 전송 하기 전에 135 ° C에서 4 h에 대 한 품 어.
5. GC-MS 분석
   1. Autosampler 인젝터를 장착 하는 질량 분 서 계에 결합 하는 가스 크로마 토 그래프와 함께 샘플을 분석 합니다.
      1. 악기 전용 소프트웨어를 사용 하 여 장비를 제어 하는 chromatograms를 분석. "시퀀스" 메뉴에서 샘플 목록을 만들려면 "예제 로그 테이블" 고 주사를 시작 하려면 "실행" 버튼을 클릭 합니다.
         참고: 0.15 μ m 필름 두께 30 m x 0.25 m m apolar 실리 카 모 세관 칼럼 가스 크로마 토 그래프 장착 되어 있습니다. 150 ° C에서 질량 분 서 계 4 중 극 온도 설정 누르고 전송 선 모든 분석에 대 한 250 ° C에서 있습니다. 3 분석 프로그램, 각 derivatization 에이전트에 각 하나의 특정 사용 됩니다.
      2. ECF 파생 상품: 1.2 mL/분의 유량으로 모바일 위상으로 사용 헬륨 230 ° C, 250 ° c.에 소스의 입구의 온도 설정 3: 1의 분할 비율 샘플 1 µ L 주입 autosampler 프로그램. 점차적으로 오븐 온도 다음과 같이 증가 분석 실행: 3 분;에 대 한 130 ° C 260 ° C;에 15 ° C/min의 그라데이션 20 분 동안 260 ° C에 온도 유지 합니다.
      3. DMFDMA 파생 상품: 1.2 mL/분의 지속적인 흐름으로 모바일 위상으로 사용 헬륨 230 ° C, 250 ° c.에 소스의 입구의 온도 설정 3: 1의 분할 비율 샘플 1 µ L 주입 autosampler 프로그램. 점차적으로 오븐 온도 다음과 같이 증가 분석 실행: 1 분;에 대 한 60 ° C 130 ° C에 20 ° C/min의 그라데이션 260 ° C에 4 ° C/min의 두 번째 그라데이션 10 분 동안 260 ° C에 온도 유지 합니다.
      4. BSTFA 파생 상품: 1.2 mL/분의 지속적인 흐름으로 모바일 위상으로 사용 헬륨 275 ° C에서 300 ° c.에 소스의 입구의 온도 설정 분석 실행 (사출: 1 µ L), 점차적으로 오븐 온도 다음과 같이 증가: 1 분; 110 ° C 첫 번째 그라데이션 154 ° C에 2 ° C/min의 300 ° C에 5 ° C/min의 두 번째 그라데이션 10 분 동안 300 ° C에 온도 유지 합니다.
      5. 검색 절차: Derivatization의 각 모드에 대 한 긍정적인 전자 충격 이온화 70 eV에서 스캔 모드에서 샘플 (1 µ L) 주입 하 고 각 아미노산의 보존 기간을 숙지 합니다.
      6. 이 값을 사용 하 여 시간 윈도우는 크로마 전체와 각 아미노산의 특성 및 표 3;에 나열 된 다른 선택 된 이온에 대 한 정의 이 값은 각 아미노산에 대 한 포함 되어야 합니다. SIM 탐지 프로그램에이 정보를 포함 하 고 70 eV에서 긍정적인 전자 충격 이온화와 시뮬레이션 모드에서 분석을 실행 합니다.
   2. 수집; 분석 결과 즉, 각 아미노산에 대 한 해당 하는 농도의 클러스터는 다른 대량 isotopomers에 기록 합니다. 자연 라벨에 대 한 수정 및 proteinogenic 아미노산 (단백질에 그것의 총 금액에 관하여는 아미노산의 레이블이 지정 된 비율로 정의의 동위 원소 농축 계산 dedicatedsoftware¹⁷ 를 사용 하 여 데이터 처리 샘플)입니다.
      참고: 분자의 동위 원소 농축 (즉), 백분율로 표시, 라벨로 대량 isotopomers의 수정 된 농도의 합계를 나누어 계산 됩니다 (m₁, m₂,...m_n)는 수정 된의 합으로 모든 대량 isotopomers의 농도 (m₀, m₁, m₂, m_n):
      I. E. = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁+ m₂ +... + m_n)

5. 정량화 및 휘발성 화합물의 동위 원소 농축

1. 레이블이 지정 된 휘발성 화합물의 추출
   1. 10 µ L deuterated 내부 표준의 상쾌한의 5 mL을 추가 (deuterated 화합물의 최종 농도: 100 µ g/L) 15 mL 유리 튜브에. Dichloromethane의 1 mL을 추가, 단단히 튜브와 20 분 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 대 한 락 플랫폼에서 그들을 흔들어 닫고 15 mL 유리 튜브에 유기 낮은 단계를 수집 합니다. 반복 dichloromethane 추출 합니다.
   2. 건조 한 유기 추출 물 500mg 이상 무수 황산 나트륨 및 수집으로 파스퇴르 피펫으로 액체 단계. 질소 유량에서 4의 요인에 의해 추출 집중 하 고 GC autosampler 유리병에 그것을 전송.
2. 휘발성 화합물의 GC-MS 정량화
   1. 0.25 μ m 두께 30 m x 0.25 m m 용융 실리 카 모 세관 칼럼 가스 크로마 토 그래프 장비와 인젝터와 250 ° c.에 전송 선 1.0 mL/분 대기의 흐름을 일정 헬륨을 적용
   2. 분할의 비율은 10: 1와 2 µ L의 샘플을 주사 하 고 다음 오븐 온도 프로 파일을 사용 하 여 추출 된 휘발성 분자를 분리: 온도 40 ° C에서 3 분을 잡고, 4 ° C/min으로 증가 최대 220 ° C와 20 분 대 한 오븐 220 ° C에 대기.
   3. 230 ° C와 사중 극 자 질량 분 서 계 온도 150 ° c.에 설정에서 설정 하는 소스 온도와 질량 분석기를 사용 하 여 화합물을 감지 선택 이온 감시 (SIM) 모드로 70 eV 및 표 4에 보고 되는 휘발성 화합물을 특정 이온 클러스터를 사용 하 여 긍정적인 전자 충격 이온화 질량 스펙트럼을 기록 합니다.
   4. 외부 7-포인트 보정을 사용 하 여 해당 이온 클러스터의 농도의 합계에서 휘발성 분자의 농도 정량. 100% 에탄올에 각 화합물 (10 g/L)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 그런 다음, 재고 솔루션을 혼합 하 여 휘발성 분자 (에틸 에스테 르, 아세테이트, 알콜, 및 산)의 각 클래스에 대 한 표준 솔루션을 준비 합니다. 마지막으로, 교정 솔루션을 준비 하는 3.3 조정 ph 5 g/L tartaric 산을 포함 하는 12 %hydroalcoholic 솔루션에서 표준 솔루션의 다른 양의 희석.
   5. 동시에, 각 이온 클러스터의 농도의 자연 라벨에 대 한 수정 하 고 휘발성 화합물의 분자의 레이블이 지정 된 비율로 정의 되 고 전용된 소프트웨어를 사용 하 여 백분율로 표현 된다 동위 원소 농축 계산 ¹⁷.

6. 데이터 집합의 통합된 분석에 대 한 계산

1. 원시 데이터의 수집
   1. 표 5, 6, 7, 및 8 에 표시 된 스프레드시트를 사용 하 여 입력 extracellular 아미노산, 셀 건조 중량, 셀, 휘발성 분자와 동위 원소 농도의 단백질 함량의 농도에 해당 하는 원시 데이터 값 proteinogenic 아미노산 및 휘발성 분자 농축
      참고: 테이블에 표시 된 데이터는 m m에서 표현 됩니다. 모든 결과 질소의 원자 질량 proteinogenic 아미노산의 millimolar 농도 곱하여 mg N/L 또는 각 분자의 분자량에 의해 m m에서 값을 곱하여 mg/L에도 표현 됩니다 (14 u)와 질소 ato의 수 이 분자의 놓을에서 제공 되는 ms입니다.
   2. 아미노산 (mg/L에서 그들의 합계)의 총 금액 하 여 mg/L는의 있는 그것의 총계를 분할 하 여 단백질에서 각 아미노산의 대량 비율을 계산 합니다.
   3. 수단, 표준 편차, 및 독립적인 실험에서 가져온 데이터에서 의미의 표준 오류를 계산 합니다.
   4. 바이오 매스 (g 단백질/g DW)에 단백질 분수와 건조 중량 콘텐츠 (바이오 매스 생산)에서 각 아미노산의 proteinogenic 농도 (mg/L) (mg aa/g 단백질) 단백질에서이 아미노산의 비율을 곱하여 계산 합니다 중간 (DW/L g)입니다.
2. ¹⁵ N 동위 원소 추적 실험
   1. 그들의 총 농도 (mg N/L로 표시)에서 proteinogenic 아미노산 (mg N/L로 표시)에 존재 하는 질소의 레이블 및 레이블 없는 분수 계산 하는 표 9에 표시 된 스프레드시트를 사용 하 여 그들의 동위 원소 풍부입니다. 각 아미노산에 대 한 레이블이 분수의 총 농도와 그것의 동위 원소 농축 제품에 해당 하 고 레이블 없는 부분은 전체와 레이블이 지정 된 금액의 차이.
   2. 그런 다음, Ala, Gly, 발, Asp, 페, 레이, Ile, Thr, Ser, 프로, 리스의 총 금액 그, Glu, Arg (mg N/L)에 요약 하 고 전체를 분할 하 여이 연구에서 계량 proteinogenic 아미노산에 포함 된 단백질의 총 질소의 일부분을 결정 한 이 합계에 의해 단백질에 포함 된 질소의 마운트.
   3. 아르기닌, 글루타민 또는 proteinogenic 산 (Ala, Gly, 발, Asp, 연구에서 계량 된 proteinogenic 아미노산의 (mg N/L)에 레이블이 분수를 요약 하 여이 연구에서 계량에 복구 된 염화 질소를 계산 페, 레이, Ile, Thr, Ser, 프로, 리스, 그의 Glu, 및 Arg) ¹⁵N 표시 된 아르기닌, 글루타민, 또는 암모늄 및 아미노산 정량된 proteinogenic에서 질소의 총 금액으로이 표시 된 질소 분수를 나누는 존재 실험 중 산입니다.
   4. 3 가장 풍부한 아미노산 생 합성 드 노 보 ¹³C와 ¹⁵N 동위 원소 추적 실험 ( 표 7에 스프레드시트)에서 데이터를 결합 하 여 사용 하는 질소의 세포내 풀에의 기여를 평가.
   5. Proteinogenic 발, 레이, 일, 또는 Thr의 총 금액 (mM로 표시)에서 소비 된 화합물 (¹³C 실험)의 직접 설립와 드 노 보 synthetized는 3에서 질소를 사용 하는 부분에서 파생 된 일부 공제 주요 소스는 드 노 보 synthetized 다른 아미노산에서 질소를 사용 하 여 분수를 평가.
   6. 그런 다음, 아미노산 드 노 보 synthetized proteinogenic 아미노산 (mM)의 총 금액을 Gln, Arg, 및 NH₄⁺ (합계 mM로 표시)에서 제공 하는 질소를 사용 하 여 금액의 비율을 계산의 기여를 계량 하기 아르기닌, 글루타민, 그리고 세포내 질소 풀 암모늄.
3. ¹³ C 동위 원소 추적 실험
   1. 농도 실험 ¹³C 라는 레이 발, 존재 하는 동안 가져온 proteinogenic 아미노산의 동위 원소 풍부에 표현에서 proteinogenic 아미노산의 분류, 레이블이 없는 분수를 계산 일 또는 Thr. (6.2.1, 표 10참조).
   2. 농도 실험 ¹³C 라는 레이 발, 일, 또는 Thr ( 존재 하는 동안 가져온 휘발성 화합물의 동위 원소 풍부에 표현에서 휘발성 화합물의 분류, 레이블이 없는 분수를 계산 표 10).

결과

그림 3 워크플로 여러 질소 소스 와인 발효 하는 동안 발견 되는 효 모에 의해 관리를 조사 하기 위해 구현 된의 회로도를 선물 한다.
샘플링, 생물 학적 매개 변수-성장 특성, 질소 소비 패턴 및 proteinogenic 아미노산-쇼 발효 (그림 4) 중 높은 재현성의 프로필의 다른 지점에 대 한 이 일관성 세트 14 독립 발효 중 생성 된 데이터의 조합에 따라 접근의 관련성을 확인 합니다.

그림 5 는 모든 proteinogenic 아미노산을 포도 주스에서 사용할 수 있는 소스에서 질소의 재배포에 대 한 포괄적인 개요를 보여 줍니다. 이 분석은 주로 ¹⁵N 표시 된 화합물의 실...

토론

동위 원소 추적 실험을 사용 하 여 신진 대사 네트워크를 통해 화합물의 분할을 측정 하는 것은 미생물 물질 대사의 동작을 이해 하기 위한 유망한 접근 이다. 이 방법론, 하나 또는 두 개의 레이블된 기판, 성공적으로 적용 하는 동안 수 없습니다 현재 구현 여러 레이블이 원소 동위 원소 (즉, 두 개 이상의 기판)를 사용 하 여 다양 한 소스의 대사를 공부. 실제로, 사용할 수 있는 분석 기법 공동 두 요소와 라벨 때 단일 요소 및 동위 원소를 사용 하는 경우에 독점적으로 proteinogenic 아미노산의 분자 라벨 패턴의 정확한 결정을 사용 합니다. 따라서, 이러한 한계를 해결 하 고 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리를 평가, 우리 ¹³C 또는 ^{15 선택한 기판 라벨 동안 동일한 환경 조건 하에서 문화의 세트를 반복 하기로} N 동위 원소. 다음, 추가 각 ¹³C 또는 ¹⁵N 추적 실험에서 제공 하는 특정 정보의 조합을 여러 소스의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트	시그마 알드리치	230391
칼슘 클로라이드 디하이드레이트	시그마 알드리치	C7902
염화나트륨	시그마 알드리치	S9625
염화암모늄	시그마 알드리치	A4514
수산화나트륨	시그마 알드리치	71690
황산망간 일수화물	시그마 알드리치	M7634
황산아연 헵타하이드레이트	시그마 알드리치	Z4750
구리(II) 황산염 5수화물	시그마 알드리치	C7631
요오드화 칼	시그마 알드리치	P4286
코발트(II) 염화물 육수화물	시그마 알드리치	C3169
붕산	시그마 알드리치	B7660
암모늄 헵타몰리브덴산	시그마 알드리치	A7302
미오 이노시톨	시그마 알드리치	I5125
D-판토텐산 헤미칼슘염	시그마 알드리치	21210
티아민, 염산염	시그마 알드리치	T4625
니코틴산	시그마 알드리치	N4126
피리독신	시그마 Aldrich	P5669
비오틴	시그마 Aldrich	B4501
Ergosté rol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
에탄올 절대	VWR 화학 물질	101074F
염화철(III) 육수화물	Sigma Aldrich	236489
L-아스파르트산	Sigma Aldrich	A9256
L-글루탐산	Sigma Aldrich	G1251
L-알라닌	시그마 알드리치	A7627
L-아르기닌	알드리	A5006
L-시스테인	시그마 알드리치	C7352
L-글루타민	시그마 알드리치	G3126
글리신	시그마 알드리치	G7126
L-히스티딘	시그마 알드리치	H8000
L-이소류신	시그마 알드리치	I2752
L-류신	시그마 알드리치	L8000
L-라이신	시그마 알드리치	L5501
L-메티오닌	시그마 알드리치	M9625
L-페닐알라닌	시그마 알드리치	P2126
L-프롤린	시그마 알드리치	P0380
L-세린	시그마 알드리치	S4500
L-트레오닌	시그마, 알드리치	T8625
L-트립토판	, 시그마 알드리치	T0254
L-티로신	시그마, 알드리치	T3754
L-발린	, 시그마, 알드리치	V0500
13C5-L-발린	, 유리소탑,	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-류신	유리소톱	CLM-2262-H-0.25
15N-암모늄 클로라이드	유리소톱	NLM-467-1
알파-15N-L-글루타민	유리소톱	NLM-1016-1
U-15N4-L-아르기닌	유리소탑	NLM-396-PK
에틸 아세테이트	시그마 알드리치
에틸 프로파노에이	시그마 알드리치	112305
에틸 2-메틸프로파노에이	시그마 알드리치	246085
에틸 부타노에이	트 시그마 알드리치	E15701
에틸 2-메틸부타노에이	트 시그마 알드리치	306886
에틸 3-메틸부타노에이	트 시그마 알드리치 8.08541.0250
에틸 헥사 노 에이	시그마 알드리치	148962
에틸 옥타 노 에이	트 시그마 알드리치	W244910
에틸 데카 노 에이	트 시그마 알드리치	W243205
에틸 도데 카노 에이	트 시그마 알드리치	W244112
에틸 락 테이	시그마 알드리치	W244015
디에틸 숙시 네이	시그마 알드리치
2-메틸프로필 아세테이	시그마 알드리	W217514
2-메틸부틸 아세테이	시그마 알드리치	W364401
3-메틸 부틸 아세테이	트 시그마 알드리치	287725
2-페닐에틸 아세테이	트 시그마 알드리치	290580
2-메틸프로판올	시그마 알드리치	294829
2- 메틸부탄올	시그마 알드리치	133051
3-메틸부탄올	시그마 알드리치	309435
헥산올	시그마 알드리치	128570
2-페닐에탄올	시그마 알드리치	77861
프로판산	시그마 알드리치	94425
부탄산	시그마 알드리치	19215
2-메틸프로판산	: 시그마 알드리치	58360
2-메틸부탄산	: 시그마 알드리치	193070
3-메틸부탄산	: 시그마 알드리치	,
	시그마 알드리치	, 153745
옥탄산	, 시그마 알드리치	W279900
디카노산	, 시그마 알드리치	W236403
도데칸산	Sigma Aldrich	L556
발효기 1L	Legallais	AT1357	발효기 발효용 수제 일회용
진공 여과 시스템	Dominique Deutscher	029311
발효기(250ml)	Legallais	AT1352	발효기 발효용 수제
멸균 튜브	Sarstedt	62.554.502
발효 잠금 장치	Legallais	AT1356	발효 잠금 장치 발효 용 수제
BactoYeast 추출물	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
인큐베이터 쉐이커	Infors HT
입자 계수기	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
플레이트 버틀러 로봇 시스템	랩 서비스 BV	PF0X-MA	자동 기기
플레이트 버틀러 소프트웨어	랩 서비스 BV		로봇 모니터 소프트웨어
RobView			자체 개발 계산 소프트웨어
My SQL			국제 소스 데이터베이스
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	세코맘
아미노산 표준 생리학 - 산성 및 중성	시그마 알드리치	A6407
아미노산 표준 생리학 - 기초	시그마 알드리치	A6282
구연산염 리튬 완충액 - 울트라 닌히드린 시약	Biochrom	BC80-6000-06
설포살리실산	시그마 알드리치	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		기기 제어 및 데이터 분석 소프트웨어
Ultropac 8 수지 리튬	Biochrom	BC80-6002-47	리튬 고해상도 생리 컬럼
필터 Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (기공 크기 0.22 &마이크로; m)
멤브레인 필터 PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µ m
진공 펌프 Millivac Mini	Millipore	XF5423050
알루미늄 부드러운 계량 접시 70mm	VWR	611-1380
정밀 저울	Mettler		사양 AE163
디메틸 설폭시드 건조	Merck	1029310161	(최대 0.025% H2O) SeccoSolv
연소 오븐	Legallais
피어스 BCA 단백질 분석 키트	Interchim	UP40840A
포름산	Fluka	94318
과산화수소	시그마 Aldrich	H1009
염산 발연 37% Emsure	Merck	1003171000	등급 ACS, ISO, Reag. Ph Eur
리튬 아세테이트 버퍼	Biochrom	80-2038-10
가수 분해 아미노산의 상용 솔루션	Sigma Aldrich	AAS18
L- 메티오닌 설폰	시그마 Aldrich	M0876
L- 시스테 산 일 수화물	Sigma Aldrich	30170
Pyrex 유리 배양 튜브	Sigma Aldrich	Z653586
피리딘	아크로스 유기물	131780500	99% Extrapure
에틸 클로로포름산염	시그마 알드리치	23131
디클로로메탄	시그마 알드리치	32222
바이알	시그마 알드리치	854165
1.5ml 바이알용 마이크로인서트	시그마 알드리치	SU860066
GC/MS	애질런트 테크놀로지스	5890 GC / 5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		기기 제어 및 데이터 분석 소프트웨어
메탄올	시그마 Aldrich	34860	Chromasolv, HPLC
아세토 니트릴	시그마 Aldrich	34998	ChromasolvPlus, HPLC
N, N- 디메틸 포름 아미드 디메틸 아세탈	시그마 Aldrich	394963
BSTFA	시그마 Aldrich	33024
DB-17MS 컬럼	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µ m
황산나트륨, 무수	시그마 알드리치	238597
기술 질소	공기 제품	14629
Zebron ZB-WAX 컬럼	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µ m
헬륨 BIP	에어 제품	26699
유리 파스퇴르 피펫	VWR	612-1702