방법 논문

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

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⸱

DOI:

10.3791/56407

⸱

2017년 11월 16일

 , 
1Roche Pharma Research and Early Development (pRED), Neuroimmunology, Roche Innovation Center Basel

이 논문에서

요약

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

초록

혈액-뇌 장벽 (BBB) 순환과 두뇌 사이 분자의 수송을 조절 하는 동적 다세포 인터페이스입니다. BBB 걸쳐 Transcytosis 뇌 실질에 호르몬, 대사, 그리고 치료 항 체의 납품을 통제 한다. 여기, 선물이 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 시각화 subcellular 세포 BBB에서 내 피 세포 내에서 면역 형광 검사 무료-부동 섹션의 결합 하는 프로토콜. 이 데이터 집합을 결합 하 여 3D 이미지 분석 소프트웨어와 함께 반자동된 세분화 및 모 세관 볼륨의 정량화 표면 영역으로 개수와 BBB에서 세포내 세포의 강도 대 한 수 있습니다. 세포내 소포 및 그들의 정량화는 BBB에서 내 마우스 생 면역 글로불린 (IgG)의 검출 방법을 설명 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 다른 분자 비보의 BBB transcytosis를 제어 하는 메커니즘의 수사에 적용할 수 있습니다.

서론

혈액-뇌 장벽 (BBB) 연속 세포 장벽입니다 이다, pericytes, 신경 세포, 내 피 세포에 의해 형성 된 혈액 순환1에서 중앙 신경 조직 (CNS)를 분리 하는. BBB에 걸쳐 교통 규제 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할을 담당 하 고 뇌 내 피 세포 (BECs)의 특수 속성에 의해 중재. BECs transcytosis의 낮은 기초 율 사이 꽉 세포 접합의 존재의 혈액을 매개로 분자, 각각2paracellular 및 transcellular 전송을 제한 합니다. 최근, transcytosis 통로 BECs에 뇌3,4치료 큰 분자의 납품을 강화 밝혀 되었습니다 있다. 그러나, BBB에 걸쳐 transcytosis 메커니즘 아직 되지 않은 완전히 특징이5,6.

광범위 한 작업에서 체 외에서 세포 및 분자 메커니즘 BECs7,,89,10, 를 통해 세포내 전송 규제를 해독 완료 되었습니다 11, 하지만 이러한 시스템 복잡 한 건축과 혈관 단위 (NVU)의 생리학 정리 하지. 다른 한편으로, 학문 vivo에서12,13 BBB에서 전송 속도에 상세한 양적 정보를 제공 하지만 전송의 세포내 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 NVU의 세포와 세포내 구성 요소 조사 vivo에서 ex vivo 남아 있다 매우 도전적인14. 기술의 제한 된 수만 세포는 NVU의 subcellular 구조를 분석 하는 의무가 있습니다. 대부분의 연구는 전자 현미경 검사 법을 사용 하지만이 기술은 적절 한 조직 준비 및 샘플 처리에 필요한 복잡 한 프로토콜에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 뇌 샘플의 처리, 분석, 그리고는 NVU의 세포 내 subcellular 구획의 정량화를 촉진 것이 높은 해상도 confocal 현미경 기반 방법론 설립.

여기, 우리는 BBB와 세포 및 subcellular 수준의 NVU의 양적 이미징 수행을 마우스 뇌 부동성 섹션을 이용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 테스트 하 고 이미지와 3 차원에서 NVU 재구성에 항 체의 수를 확인. 또한,이 프로토콜 뇌 모세 혈관 내에서 세포의 최대 광학 회절 제한 된 해상도 이미지를 수 있습니다. 이미지 분석, 함께 neurodegeneration의 마우스 질병 모델에 예를 들어 다른 실험 조건 하에서 BBB에서 고분자의 세포내 수송을 조사 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에 대 한 윤리적인 승인을 연방 식품 안전 및 스위스의 수의 사무실에 의해 제공 되었다. 모든 동물 실험 엄격한 준수 평가 및 인증의 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC)에 대 한 협회의 규칙에 따라 뿐만 아니라 동물 보호 및 복지에 스위스 연방 조 례에서에서 실시 되었다.

1. 세대의 두뇌 Free-floating 섹션

  1. 최적의 샘플 품질을 보장 하기 위해, 2 %paraformaldehyde (PFA)의 신선한 솔루션에서에서 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)는 관류의 날.
    주의: PFA 적당히 피부 접촉 및 가능한 발암 물질에 의해 독성이 있다. 니트 릴 글러브를 사용 하 여 처리 PFA 화학 증기 두건에서 솔루션을 준비 하.
    1. 60 mL 동물 당 PFA 솔루션의 준비.
    2. 가져와 PFA 180-200 µ L의 PBS의 모든 100 ml 5 M 코 솔루션으로 pH를 증가 하 고 60까지 솔루션을가 열 하 여 솔루션에 ° c.
      참고: NaOH 사용 하지 않아야 고정 시 조직 보존에 부정적인 영향을 그것으로.
    3. 솔루션 식 실내 온도 내려와 pH 7.4 HCl. 여과기를 사용 하 여 아래로 필터 종이 사용 하 여 솔루션 (재료의 표 참조).
  2. 일부 수정 앞에서 설명한 15 transcardial 관류를 통해 전체 마우스 고정을 수행. 먼저, 맥 관 구조 사용 하 여 PBS의 20 mL에서에서 혈액을 플러시 후 2%의 40 mL와 함께 perfuse PFA.
  3. 앞에서 설명한 15 두개골에서 뇌 제거.
  4. 담가 갓 2 %PFA 끼얹는다 뇌에 2%의 20 mL PFA 후 고정을 위한 4 ° C에서 7 h.
    참고: PFA에 외피를 증가 권장 하지 않습니다 그것은 세포내 구조의 검색을 방지할 수 있습니다.
  5. 광범위 하 게 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 두뇌 세척.
  6. Agarose에서 머리를 고정 하는 소스. 난방을 위한 전자 레인지를 사용 하 여 PBS에
    1. 준비 3 %agarose 솔루션. 부드럽게 아래로 냉각 응고를 방지 하는 솔루션을 소용돌이.
    2. 플라스틱 용기에서 agarose 솔루션에 집중 하기 전에 뇌 주위 PBS의 과잉에서 건조. 공기 방울을 제거 하려면 agarose 안에 두뇌를 회전 합니다. 얼음에 그것을 냉각 하 여 응고 agarose 허용
    3. 신중 하 게 플라스틱 용기에서 agarose 블록을 제거 하 고 면도날을 사용 하 여 뇌 주위 큐브를 잘라. Vibratome 견본 홀더에 두뇌를 탑재 (재료의 표 참조) cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 단면으로 진행 하기 전에 응고 접착제에 대 한 충분 한 시간.
  7. PBS 가진 vibratome 버퍼 트레이 견본 홀더 뇌 가득 전송. vibratome를 사용 하 여 100 µ m 뇌 조각 (화살 또는 코로나) 섹션. 이전 PBS 가득 6 잘 플레이트에 뇌 섹션을 수집.
  8. 마무리 뇌 단면에 따라 신중 하 게 PBS를 제거 하 고 PBS/글리세롤의 1:1 솔루션으로 대체.
  9. 저장 섹션 PBS/글리세롤에-20 ° c.

2. 셀 또는 세포 기관이 면역 형광 염색 법에 의해 라벨

  1. 신중 하 게 전송 뇌 섹션 24-잘 접시의 우물에 이전 가득 잘 당 PBS의 500 µ L. 섹션 같은 우물에서 절차의 끝에 때까지 유지 됩니다.
  2. 부드러운 동요에서 5 분에 대 한 PBS의 500 µ L로 두 번 섹션 린스.
  3. PBS를 제거 하 고 동시 차단 및 뇌 조각의 permeabilization. PBS에서
    1. 준비 0.3% 차단과 permeabilization 솔루션 트리톤 X 및 10% 당나귀 세럼.
      참고: 당나귀 혈 청 사용 특정 이차 항 체의 호스트 종에 맞게 염소 혈 청으로 대체 될 수 있다.
    2. 부드러운 동요에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 및 permeabilization 솔루션의 250 µ L 섹션을 품 어.
  4. 솔루션을 제거 하 고 추가 5% 당나귀 혈 청 및 (예를 들어, 1:1, 000에 1: 100)는 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체를 포함 하는 PBS 솔루션. 부드러운 동요에서 4 ° C에서 밤새 품 어.
    참고: 성공적으로이 프로토콜 NVU의 다른 세포 유형을 분류 하는 항 체의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오. 1 차 항 체의 최적의 희석은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 다른 항 원의 동시 라벨에 대 한 동일한 솔루션에 있는 모든 기본 항 체 희석. 모든 1 차 항 체는 다른 종에서 발생 되어야 합니다. 항 체 침투를 개선 하기 위해, 샘플 수 있습니다 알을 품을 72 h에 대 한 4 ° c.
  5. 제거 항 체 솔루션 및 세척 섹션 실 온에서 부드러운 동요에서 PBS에 10 분 동안 3 번. PBS를 제거 하 고 250 µ L PBS 솔루션 포함 5% 당나귀 혈 청 및 적절 한 종의 붙일 이라는 2 차 항 체를 추가. 섹션 부드러운 동요에서 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
    1. 이 프로토콜을 사용 하는 2 차 항 체의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
  6. 실 온에서 부드러운 동요에서 PBS에 세 번 10 분 대 한 항 체 솔루션 및 세척 섹션 제거.
  7. PBS를 제거 하 고 4의 250 µ L를 추가 ', 1 µ g/mL의 최종 농도 가진 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션. 부드러운 동요에서 10 분 동안 실내 온도에 섹션을 품 어. PBS 가진 5 분 동안 3 번 DAPI 솔루션 및 세척 섹션 제거.
  8. 현미경 슬라이드 (예를 들어, 조직-본드 유리 슬라이드) 본딩에 뇌 섹션을 탑재 합니다. 조심 스럽게 초과 PBS 슬라이드에 섹션 주위 제거. 설치 매체의 한 방울을 추가 (재료의 표 참조) 신중 하 게 뇌 섹션의 상단에 커버 0.17 mm (제 1.5) 붕 규 산 유리 coverslip.
    1. 샘플 이미지 수집 수행까지 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장.

3. 혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 이미징

  1. 레이저 스캔 적합 한 수행 이미지 수집 confocal 현미경 (재료의 표 참조) 레이저 라인 405, 488, 561와 633 nm의 여기에 대 한 빛의 스펙트럼의, 녹색, 오렌지, 파란색과 빨간색 영역에 fluorophores. 1.4의 조리개 수치와 이미지 수집, 사용 기름 목표 X 63.
  2. 인수에는 현미경을 제어 하는 소프트웨어의 메뉴 이미지 수집 매개 변수를 설정. 드롭 다운 메뉴에서 ‘ 이미지 크기 ’, 1024 x 1024 픽셀의 값을 선택 합니다. 수정 픽셀 크기의 값을 조정 하 여 200, 300 nm 사이의 값으로는 ‘ 줌 ’ 메뉴. ”
    참고: 세포내 구조 분석에 대 한 75 픽셀 크기를 줄일 수 nm. 이 이미지 크기 설정을 대폭 획득 시간을 증가 하 고 512 x 512 픽셀 작은 시야를 영상 획득 시간 감소를 줄일 수 있다.
  3. 에는 ' 수집 속도 ' 400 Hz의 값 즉, 400 초당 라인 선택 드롭-다운 메뉴. 에 ' 시스템 설정 & #39; 선택 메뉴는 ' 픽셀 깊이 ' 드롭 다운 메뉴, 그리고 12 비트에 값을 변경.
  4. 현미경 소프트웨어에서 내는 ' 인수 ' 탭, 순차적 프레임 인수에 대 한 옵션에 토글. 값을 수정 하 여 광학 섹션 두께 0.75와 각 채널에 대해 1 µ m 사이의 값으로 설정 된 ' 홀 ' 메뉴.
  5. 형광 여기 패널에서 최적의 샘플 예 488 nm 레이저 라인 녹색 발광 fluorophore fluorophores 흥분 하 필요한 레이저 활성화.
    참고: fluorophore 스펙트럼 뷰어 사용 하 여 (테이블의 자료 참조) 여기 적절 한 레이저를 선택 하.
  6. 510 및 550 nm 녹색 발광 fluorophore 대 사이의 예 각 채널에 측정 될 것 이다 파장 선택 슬라이더를 이동 하는 형광 검출에 대 한 패널에.
    참고: fluorophore 스펙트럼 뷰어 사용 하 여 (재료의 표 참조) 적절 한 검출 파장 선택.
  7. 는 굴절률 유리 coverslip와 목표에 맞게 두뇌 섹션 coverslip 위에 1.52의 굴절률을 가진 침수 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플 현미경에 놓고 현미경 쌍안경을 사용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 epifluorescent 램프를 켭니다.
  8. 현미경 스탠드에 버튼을 사용 하 여 변경 필터 휠을 DAPI 스테인드 핵을 시각화에 대 한 적절 한 필터를 선택 합니다. 조 악한 초점을 사용 하 여 초점으로 DAPI 스테인드 핵에서 신호 하기.
  9. 혈관 마커 (예: CollagenIV 또는 CD31)에서 신호를 시각화 하 고 개별 모 세관 세그먼트에 보기의 필드 센터 필터 변경 단추를 사용 하 여 현미경 스탠드에.
  10. 라이브 스캔 모드를 시작 하려면 버튼을 누릅니다. 스캔 하는 동안 이미지의 동적 범위를 극대화 하 고 픽셀 채도 피하기 위해 각 채널에 대 한 이득 및 레이저 강도 조정.
    참고: 레이블 포화 픽셀-채도 시각적으로 평가 하는 조회 테이블을 사용 합니다. 신호-채도 방지 하려면 높은 형광 신호를 것으로 예상 되는 샘플 설정을 조정.
  11. 설정 2 평균 라인에 대 한 값.
    참고: 높은 수집 속도 사용할 때 소음을 줄이기 위해이 값을 늘립니다.
  12. 구축 시작 하 고 모 세관의 전체 볼륨에 걸쳐 있는 광 z 스택 수행에 대 한 섹션을 종료. 0.45 μ m의 단계 크기를 사용 하 여.
    참고: 이미지 후속 정량화에 사용 될 경우 완전 한 데이터 집합에 대 한 동일한 수집 설정을 유지.
  13. 정량화에 대 한 통계적 비교에 대 한 적어도 3 개의 다른 마우스에서 섹션 당 10 ~ 20 z-스택 확보.
    참고: 샘플 표백 및 레이저 강도 변동에서 발생 하는 변화를 줄이기 위해 동일한 세션에서 전체 데이터 집합을 확보.

4. 이미지 처리와 3D 재건 Neurovascular 단위

  1. (선택 사항) 인수 z 스택의 축 해상도 증가, 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터 집합이 deconvolution 수행 (테이블 자료 참조 ).
    1. Deconvolution 소프트웨어에서 수행 하기 위해 설정을 변경 " 장 님 " deconvolution, (즉, 적응형 포인트 확산 함수를 사용 하 여).
    2. Deconvolution 소프트웨어 설정, 배경 제거;에 대 한 옵션에 토글이이 옵션은 이미지 스택에 작은 강도 값에 이미지의 모든 픽셀의 강도 값에서 뺍니다.
    3. Deconvolution 소프트웨어 설정에서 rescaling 강도 대 한 옵션을 전환 하 고 16 비트 깊이; 크기 조절이 옵션 것 원래 강도 값과 이미지의 동적 범위.
    4. 의 메뉴에 ' 굴절률 ', 1.52로 값을 설정. 에 ' 설정 파장 ' 메뉴를 선택 각 이미지 채널에 대 한 값을 방출. 예를 들어 녹색 발광 fluorophore에 대 한 선택.
  2. 시각화 및 3 차원 데이터 세트 (재료의 표 참조)의 분석에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터 집합을 엽니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 눌러는 " Surpass " 모 세관의 3D 볼륨 렌더링 하는 단추.
  3. 이미지 분석 소프트웨어에에서는 " 추가 새로운 표면 " 세그먼트에 모 세관 표면 버튼. 아래쪽 화살표를 사용 하 여 표면 생성 마법사의 단계에에서 사이 이동.
    4. 에는 ' 만들기 ' 탭 모 세관 표시, 예를 들면 CollagenIV와 함께 채널 소스 채널을 설정 하 고 0.5 µ m의 값을 노출 영역 세부 설정.
      참고: 후자의 옵션 이미지에 가우시안 필터를 적용 하 고 표면의 부드러움을 결정 합니다.
    1. 에는 ' 만들 ' 탭, 절대 강도 임계값 옵션에 토글.
      참고:이 옵션 이미지에서 선택 된 채널의 절대 강도에 따라 마스크를 생성 하 여 서피스를 생성 합니다.
    2. 표면 만들기 마법사에서 다음 단계에 렌더링 된 마스크 커버 이미지에서 전체 모 세관까지 강도 히스토그램에서 슬라이딩 윈도우를 이동 하 여 표면에 대 한 낮은 강도 임계값을 조정. 각 데이터 집합에 대 한 경험적으로이 매개 변수에 대 한 값 범위를 확인.
    3. 표면 작성 마법사의 마지막 단계에서 아래 드롭 다운 메뉴에서 클릭 합니다 " 필터 유형 " 옵션을 선택 하 고 ' 복 수 '. 2.0e5 1.0e5 사이의 값으로 복의 최소 수를 설정.
      참고:이 옵션 표면 복, 프레임의 가장자리에 모세의 예를 들어 작은 세그먼트의 작은 수를 제외 합니다.
    4. 표면 만들기 마법사를 완료 하 고 클릭 하 여 생성 매개 변수를 저장 " 매개 변수 기억 " 표면 메뉴의 다시 탭에서.
    5. 첫 번째 이미지에 사용 되는 매개 변수 집합을 로드 하 여 데이터 집합을 이미징 하는 전체에 대 한 절차를 반복 합니다. 각각, 임계값, 강도와 최소한의 배경 강도 및 모 세관 형태, 차이 대 한 계정에 각 이미지에 대 한 복에 대 한 매개 변수를 조정.
  5. 세포내 나노미터 구조 (예, 면역 글로불린 가득 endosomes) 세그먼트, 먼저만 모 세관 내에서 형광 신호를 포함 하는 새 채널을 만듭니다.
    참고:이 프로세스 단계 4.3
    1. 선택에서에서 만든 모 세관 표면을 사용 하 여 마스크를 생성 하 여 관심의 영역을 정의 것입니다는 ' 편집 ' 메뉴는 ' 모 세관 표면 ' 패널. ' 속성을 마스크 ', 클릭 " 마스크 모든 ". 로 세포내 소포 신호를 포함 하는 채널 선택은 ' 소스 채널 ' 옵션에 토글 " 마스크를 적용 하기 전에 채널을 복제 ".
    2. 에는 ' 마스크 설정 ' 열, 선택 " 지속적인 내부/외부 " 및 " 복을 외면 설정: " 0.00을 값을 설정 하 고.
      참고:이 프로세스 모 세관 마스크 외부 모든 복 0 강도 값을 할 것 이다 하는 이미지에는 추가 채널을 만들어집니다. 계량 (즉, 뇌 실질에) 모 세관 외부 이벤트를 선택 " 복 표면 내부 설정: " 0.00을 값을 설정 하 고.
      3. 나노미터 구조를 세그먼트, 시작 버튼을 누르면
    3. 는 " 새로운 관광 명소 추가 " 마법사. 아래쪽 화살표를 사용 하 여 표면 생성 마법사의 단계에에서 사이 이동.
    4. 만들기 탭에서 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 " 소스 채널 " 단계 4.4.4에서에서 만든 세포내 마스크 채널 선택.
    5. 만들기 탭에서 아래는 " 탐지 자리 " 섹션, 예상된 XY 직경 0.5와 소포에서 관찰의 평균 크기에 따라 1 µ m 사이의 값으로 설정 실험입니다. 이 옵션 세그먼트화 알고리즘에 의해 검출 될 것 이다 가장 작은 크기를 결정 합니다.
    6. 만들기 탭에서 아래는 " 탐지 자리 " 섹션에 대 한 옵션에 토글 " 배경 빼기 ".
      참고:이 옵션 (단계 4.4.7에서에서 선택한 값)에서 0.75 자리 반지름의 가우스 필터와 이미지를 부드럽게 것 이다 고 0.88 자리 반경으로 필터링 원본 이미지 가우스의 강도 뺀 다음.
    7. 에는 ' 만들 ' 탭, 아래에 있는 드롭다운 메뉴를 눌러 ' 필터 유형 ' 선택 " 품질 ". 참고가 관광 명소의 중심에 강도에 따라 임계값을 적용 하 여 이미지를 세그먼트 것입니다. 걸쳐 슬라이딩 윈도우를 이동 하 여 낮은 강도 임계값을 조정에 ' 품질 ' 식별 소포의 대부분 표시 될 때까지 막대 그래프.
      참고:이 매개 변수에 대 한 값의 범위는 각 데이터 집합에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가.
    8. 자리 만들기 마법사를 완료 하 고 버튼을 눌러 생성 매개 변수를 저장 " 매개 변수 기억 " 표면 메뉴의 다시 탭에서.
    9. 첫 번째 이미지에 사용 되는 매개 변수 집합을 로드 하 여 데이터 집합을 이미징 하는 전체에 대 한 절차를 반복 합니다. 조정에 대 한 매개 변수는 ' 품질 강도 임계값 ' 배경 강도 차이 대 한 계정에 각 이미지에 대 한.

5. BBB에서 세포내 수송의 정량화

  1. 계량 (µ m 3)에서 볼륨 및 모 세관 세그먼트의 (µ m 2)에 지역. 분석 소프트웨어에서 단계 4.3에서에서 만든 혈관 표면의 통계 패널을 액세스. 선택은 ' 상세 ' 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 선택 하 고 탭, " 모든 값 " 볼륨 및 지역에 대 한 값을 찾을 수.
  2. 계량 모 세관 세그먼트 내의 소포 수 있습니다. 분석 소프트웨어에서 단계 4.4에서에서 만든 관광 명소의 통계 패널을 액세스. 선택은 ' 전체 ' 이미지에 관광 명소의 총 수의 값을 찾을 수 탭.
  3. 각 이미지에 대 한 모 세관 볼륨당 vesicles의 수를 계산 하려면 볼륨 단계 5.1에서에서 계산에 의해 관광 명소의 수를 정상화. 모 세관 볼륨의 1000 µ m 3 당 소포 수 1000이이 값을 곱합니다.
  4. 모 세관 내에서 총 강도 계량 하 전체 이미지 다음 4.3 다음 수정 단계에 설명 된 지침을 포함 하는 새 화면을 만듭니다. 소스 채널 관련 신호 (예를들면, mIgG)를 포함 하는 채널을 선택 하 고 5 µ m 영역 세부 수준 값 설정. 전체 이미지를 포함 하는 표면, 만들려고 낮은 강도 임계값의 값을 0 설정.
  5. 분석 소프트웨어에 액세스 통계 단계 5.4에서에서 만든 표면. 선택은 " 상세 " 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 선택 하 고 탭, " 모든 값 ". 에 대 한 값을 기록 ' 강도 합계 ' 관심;의 채널에 대 한 이 매개 변수는 모든 픽셀 개별 휘도 값의 합에 해당.
    참고: 세포내 신호에 대 한이 복 외면을 0.0으로 설정 된 중복된 채널에 해당 합니다. 이 복 0.0으로 설정 하는 표면 내부와 복제 된 채널에 해당 하는 뇌 실질에 신호에 대 한.
  6. 각 이미지에 대 한 모 세관 볼륨 당 형광 강도 계산 하는 단계 5.1에서에서 계산 볼륨에 의해 강도 정상화. 1000 모 세관 볼륨의 1000 µ m 3 당 형광 강도 값을이 값을 곱합니다.
    참고: 뇌 실질에 형광 신호에 대 한 모 세관 볼륨 마이너스 총 이미지 볼륨 값을 정상화 하 고 뇌 실질의 1000 µ m 3 당 총 강도를 1, 000을 곱합니다.
  7. 전체 데이터 집합에 대 한 절차를 반복 하 고 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터의 통계 분석을 수행.

결과

이미지의 대표적인 예는 여기에 설명 된 프로토콜에서 얻은, 마우스 뇌 섹션 지하실 막, 이다, pericytes, NVU의 다른 구성 요소를 인식 하는 항 체로 얼룩진 했다 그리고 내 피 세포 (참조 사용 하는 특정 항 체에 대 한 테이블의 자료 ) (그림 1A, D, 및 전자). 에이 해상도 개별 astrocytic 프로세스와 모세와 직접 접촉에 있습니다-발 끝을 구별 하는 것이 가능 하다.

세포내 구조를 탐지 하기 위한이 프로토콜의 적합성을 강조 하기 위해 주변16 인간의 안티 타우 mAb86 항 체 주사는 동물에서 뇌 섹션 붙일 이라는 반대로 인간 항 체 ( 물 했다 그림 1B). mAb86는 특히 대상 뉴런 타우16의 병 적인 형태를 표현으로 알려져 있다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, mAb86 신경 (그림 1B-C) 내에서 개별 나노미터 구조 내에서 회절 제한 된 해상도 감지 되었습니다. 또한, 내 피 세포에서 세포내 구조 pericytes (D-E 그림 1및 그림 2)에 생 마우스 IgG 검색 되었습니다.

뇌 맥 관 구조의 고해상도 confocal z 스택의 인수 모세 혈관과 세포내 소포 BBB에서의 3 차원 세그먼트화 할 수 있습니다. 렌더링 및 모 세관 CollagenIV와 마우스 igg가 양성 이라는 분단의 과정의 예를 그림 2 에 세포내 소포. 예 모 세관 볼륨 당 소포 수를 측정 하 여 분할 된 이미지의 전체 데이터 집합을 측정, 여 다른 조건 하에서 세포내 전송 프로세스에 변화를 공부 하는 가능 하다. 그림 3 B C mIgG 소포 번호와 형광 강도 해당 하는 뇌 실질에 mIgG 각각, 이전에 보고 된 로 pdgf bret/ret 마우스 모델에서 pericyte 고갈 시 차이점을 보여 줍니다. 17. 동일한 접근 했다 또한 최근 서로 다른 뇌 영역18사이 BBB에서 세포내 수송에 대 한 변경 내용을 분석 하는 데 사용 됩니다.

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그림 1: 여러 종류의 subcellular 구조는 혈관의 Labelling 장치 혈관 단위 (A 와 D)와 세포내 소포 신경 (B)에 포함 된 또는이 프로토콜으로 얻은 내 피 세포 (E)의 대표 이미지. A (위)에 최대 강도 프로젝션 이미지 (녹색) CollagenIV에 의해 표시 하는 모세 혈관을 둘러싼 GFAP 양성 이다 (빨간색)의 분포를 보여줍니다. 화살표는 개별 astrocytic 프로세스를 가리킵니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 에이 해상도 개별 사이토 프로세스 및 끝 발 명확 하 게 볼 수 있습니다, 박스형된 지역 (아래)의 확대 된 이미지와 같이. 화살촉 끝 발 astrocytic을 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. B에서 이미지는 주변 주입 항 체, hippocampal 신경 내의 (녹색), mAb86의 축적을 보여줍니다. 화살촉 개별 mAb86 양성 소포를 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. C 에서 그래프는 단일 기의 선 프로필 강도를 보여줍니다. 소포 크기 절반 최대 강도 곡선 (녹색 선 및 원)의 가우스 적합 (검은 실선)의 전체 폭에서 추정 되었다. 기저 lamina (CollagenIV, 회색) 내 D 에 이미지 표시 (녹색) 내 피 세포는 pericyte 둘러싸여의 3 차원 재구성 (빨간색) 합니다. 낮은 패널 개별 형광 채널을 표시합니다. 눈금 막대 = 10 µ m. E 에서 이미지 안에 pericytes (오른쪽 패널, 녹색에서 CD13) 하지만 내 피 세포 (왼쪽 패널, 녹색에서 CD31) 내에서 세포내 소포에서 (빨간) mIgG의 지역화를 표시 합니다. 모든 이미지, 핵 스테인드 DAPI 파란색으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 5 µ m. 패널 D 그리고 E 참조17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2 : 모세 혈관과 혈액-뇌 장벽에 세포내 소포의 3 차원 렌더링. 설명 하는 프로토콜, CollagenIV 양성 모 세관 (녹색) 및 마우스 IgG 세포내 소포 (레드) 했다의 고해상도 confocal 이미지 (A) 인수. 왼쪽된 패널 횡단면 단일 광학 섹션을 보여 줍니다. 화살표는 뇌 내 피 세포 내에서 개별 mIgG 양성 소포를 가리킵니다. 전체 z-스택 사용 하 여 오른쪽 쇼 3D 개조에 패널 이미지 처리 소프트웨어 ( 재료의 표참조). 모 세관 볼륨 (B) 및 개별 소포 (C) 3 차원에서 렌더링 된 및 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조). 모든 이미지, 핵 스테인드 DAPI 파란색으로 표시 됩니다. 스케일 바 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3 : BBB에서 mIgG 세포내 지역화의 정량화. 대표 이미지를 보여주는 모 세관 (collagenIV, 녹색으로 표시)의 (A) 3 차원 개조와 mIgG의 분포 (적색) C57BL/6 마우스와 pdgf bret/ret pericyte 고갈 마우스 이전19에서 설명합니다. 스케일 바 = 10 µ m. B에서 이미지 CollagenIV 마스크 내에서 세포내 소포의 세그먼트를 표시합니다. ThB 에서 e 그래프 정량화 및 모 세관의 볼륨 당 mIgG 기 수의 비교를 보여줍니다. 각 점 개별 모 세관 세그먼트에서 측정을 나타냅니다. 오차 막대는 데이터의 표준 편차를 나타내는 및 실선 보여준다는 뜻. C 표시에서 이미지는 CollagenIV 마스크 외부 mIgG 형광 신호. 마찬가지로, C 에서 그래프 표시 정량화 및 mIgG 형광 강도의 비교 C57BL/6 마우스와 pdgf bret/ret 사이의 뇌 실질에서 pericyte 고갈 쥐. 형광 강도 단위 모든 C57BL/6 마우스에서 측정 하는 평균 mIgG 실질 강도 의해 정상화 되었다. 이 그림은 참조17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

위에서 설명한 프로토콜 BBB의 고해상도 현미경 뇌 부동성 섹션, immunofluorescent 얼룩, 이미지 수집 및 분석 매개 변수의 준비를 설명 합니다. 이 방법은 최근 항 체 전달 플랫폼3, BBB17에서 내 생 적인 IgG의 교통과 pericyte 손실18시 BBB의 이종의 지역화를 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 프로토콜의 다른 단계는 실험의 특정 목표에 맞게 수정할 수 있습니다. 첫째, 두께 (100 µ m) 단면도 사용 하 여 immunostaining 및 설치 절차 동안 그들의 처리를 촉진 한다. 그것은 또한 모 세관 네트워크 neurovascular 단위의 3 차원 재구성 및 모 세관 및 NVU 횡단면의 세대에 대 한 수 있습니다. 그러나, 조직 섹션 내에서 항 체의 다를 수 있습니다 그리고 일부 항 체 얼룩이 지는 coverslip 주변 조직의 표면 층을 제한할 수 있습니다. 프로토콜은 permeabilization 단계 동안 세제의 농도 또는 permeabilization 단계 조직으로 항 체 침투 개선의 길이 증가 하 여 수정할 수 있습니다. 둘째, 이미지 품질 이미지 산란으로 굴절율 불일치에서 광학 착오 인 조직 (표면 아래 일반적으로 20 ~ 30 μ m) 내의 깊은 시도할 때 손상 될 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 삭제 하는 조직과 활성 항 체 침투20 에 대 한 새로운 방법이이 프로토콜 조직의 이미지 더 큰 볼륨을 함께 결합할 수 있습니다. 셋째, deconvolution 축 해상도의 이미지를 개선 하기 위해 이미지 수집 후 수행 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 장 님 deconvolution 알고리즘의 선택은 (i) 그것의 사용의 용이성, 포인트 확산 함수의 아무 사전 계산은이 기반 필요, 이미지 품질21, 그리고 (iii) mIgG에의 부족을 개선 하기 위한 (ii) 그것의 견고성 구현 후 세포내 구조입니다. 세포내 구조 샘플에 시각에 따라 다른 deconvolution 알고리즘 높은 이미지 품질에서 발생할 수 있습니다. 다음 참조21,22 장점과 이미지 deconvolution 추가 알고리즘의 한계에 대 한 광범위 한 토론을 제공 합니다. 마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 3 개 차원에서 모세 혈관과 세포내 구조의 세분화를 허용. 명확 하 게 이미지 분석 프로토콜 및 대체 패키지 참조23에서 설명 하는 예 하에 설명 하는 소프트웨어를 제한 하지 않습니다, 그리고 세그먼트 이미지를 사용할 수 있습니다. 이미지 세분화의 정확도 평가 하 여 BBB 통해 세포내 구조 분석에 대 한 다른 소프트웨어 프로그램의 적합성을 실험적으로 확인 되어야 한다.

이 메서드는 고정 된 샘플에 기반을, 그것은 BBB에 걸쳐 transcytosis의 역학에 대 한 직접적인 정보를 제공 하지 않습니다. 그러나, 그것은 결합 될 수 있다 시간 과정 실험24, 예를 들어 정 맥 주입의 분자 재구성의 활동을 주입 후 다른 시간 지점에서 BECs 내의 그것의 축적을 측정 하 여 세포내 수송입니다. 이 방법의 장점은18, 현재 intravital 라이브 이미징 접근에 액세스할 수 있는 같이 깊은 두뇌 지구의 분석에 대 한 허용 한다. 프로토콜 중 중요 한 단계는 조직 고정의 주의 깊은 모니터링. 고정 4 %PFA 극적으로 세포내 세포와 생 또는 주변 관리 면역 글로불린17 (그림 1B)의 immunogenicity 감소 시킨다. 이 프로토콜의 한계의 요구-고품질 항 체의 (즉, 낮은 일반적인 얼룩, 낮은 분) 면역 형광 검사에 적합 이다. 같은 시 약을 사용할 수를 제공 관심사의 어떤 단백질의 세포내 지역화 조사 메서드를 적용할 수 있습니다. 예를 들어 프로토콜 뇌 내 피 세포17리소좀을 식별 하기 위해 사용 되었다. 이 프로토콜은 confocal 현미경 검사 법에 기반을, 측면 해상도 회절에 의해 제한 됩니다을 약 175 ~ 250 보다 작은 구조를 확인할 수 없는도 주목 한다 nm (그림 2).

이전 연구는 confocal 현미경 검사 법25,26를 사용 하 여 혈관 단위의 세포 구성의 상세한 분석을 수행 했습니다. 그러나, 전송 전자 현미경 검사 법19,,2728의 사용에 주로 의존 BBB에서 세포내 수송을 조사 합니다. 이 메서드는 세포내 구조의 높은 측면 해상도 제공 합니다, 전자 현미경 낮은 처리량을 가진 도전적인 기술 남아 있다. 또한, EM에 의해 구상 될 수 있는 다른 분자 대상의 수는 매우 제한 됩니다. 이 프로토콜 BBB에서 세포내 수송을 조사 하는 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 5 ~ 6 일에 이미지 분석, 뇌 컬렉션에서 완전 한 절차를 수행할 수 있습니다. 적합 한 항 체를 사용할 수 있는 경우 면역 형광 같은 샘플 내의 여러 세포 유형/분자의 동시 탐지를 허용 한다. 또한이 프로토콜 공간 해상도29에 한계를 극복 하기 위해 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술로 결합 될 수 있었다. 전반적으로, 위에서 설명한 프로토콜 변화 neurovascular 단위 내의 관심사의 단백질의 세포내 지역화에 정량화를 수 있습니다. 다른 유전자 또는 약리학 물결에 대 한 응용 프로그램 비보에BBB의 세포내 구조 및 전송 기능을 조사 하는 수 있게 됩니다.

공개 사항

저자는 로슈에 의해 유료 취업을 받고 있다.

감사의 글

캠핑카 작업 로슈 박사 친목 (2014-2017)에 의해 지원 되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CD31/PECAMNovus BiologicalsMCA2388Labels Brain Endothelial Cells
Use at dilution 1:100
Use with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) with a dialkal IgG (H+L) with dilution 1:400
R& PodocalyxinR& D SystemsMAB1556Labels 모세혈관 루멘
희석시 사용 1:100
당나귀 다클론 항쥐 IgG(H+L)와 적절한 AlexaFluor 염료로 검출, 희석시 사용
BiotrendBT21-5014-70 라벨 CollagenIV Biotrend BT21-5014-70에 대한 토끼 다클론 항체모세혈관의 기저막
희석 1:100
에서 사용 적절한 AlexaFluor 염료와 결합된 당나귀 다클론 항토끼 IgG(H+L)로 검출,
CD13 R&에 대한 염소 다클론 항체; D SystemsAF2335Labels pericytes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) combined with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
마우스 단클론 항체 클론 G-A-5 GFAP에 대한 Cy3Abcamab49874Labels Astrocytes
Use at dilution 1:100
Rabbit polyclonal anti-goat IgG (H+L) Iba-1에 대한 토끼 다클론 항체Wako019-19741라벨 : Microglia
희석시 사용 1 : 100
당나귀 다클론 항 쥐 IgG (H + L)와 적절한 AlexaFluor 염료와 함께 검출, 희석시 사용 1:400
Rat 단클론 항체 ABL93 gainst LAMP2Fitzgerald10R-CD107BBMSP라벨 Lysosomes
희석시 사용 1 : 100
적절한 AlexaFluor 염료와 결합 된 당나귀 폴리 클론 항 쥐 IgG (H + L)로 감지, 희석시 사용 1:400
마우스 IgG(H+L)에 대한 당나귀 다클론 항체 AlexaFluor594LifeTechnologiesA21203희석시 사용 1:400
마우스 IgG(H+L)에 대한 당나귀 다클론 항체 AlexaFluor488LifeTechnologiesA21202희석시 사용 1:400
마우스 IgG(H+L)에 대한 염소 다클론 항체 AlexaFluor555LifeTechnologiesA21422희석 시 사용 1:400
여과지Sigma-AldrichWHA10334347Whatman prepleated qualitative filter paper
Grade 0858 1/2, grained
Cyanoacrylate glueRoth Carl258.1Roti Coll 1
형광 장착 매체DakoS3023Dako 형광 장착 매체
성인 마우스The Jackson Laboratory000664C57BL/6J 생후 9개월에서 19개월 사이의 수컷 또는 암컷 마우스
VibratomeLeica Biosystems14047235612Leica VT100S 진동 블레이드 마이크로톰
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경Leica MicrosystemsNALeica TCS SP8 X with HyD detectors
and White light laser
이미지 처리 소프트웨어Leica MicrosystemsNALeica Application Suite AF 버전 3.1.0 빌드 8587
이미지 분석 소프트웨어Bitplane 과학 소프트웨어NAImaris 버전 7.6.5 x64 형광 SpectraViewer 용 빌드 31770
ThermoFisher ScientificNAhttps://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science
/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
CollagenIV Labels 1:400 희석에 사용

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