방법 논문

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

DOI:

10.3791/56423

⸱

2018년 1월 2일

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

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우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

초록

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정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.

서론

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성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.

우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.

녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9

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프로토콜

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설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다.

1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비

참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포의 서로 다른 문화를 여러 번 반복 될 수 있다. 우리의 경험에서 한 10 cm (직경) 조직 문화 접시 (1 접시) 분석에 대 한 충분 한 RNA를 제공합니다. 필요한 경우 각 timepoint에 셀의 수를 늘리기 위해 각 샘플에 대 한 여러 조직 문화 요리를 풀링된 수 있습니다. 또한, 진정으로 독립적인 생물 복제로 다른 개인에서 격리 하는 섬유 아 세포와 같은 실험을 수행할 수 있습니다.

  1. 대 본 부패 분석에 대 한 셀의 확산 및 무부하 문화를 설정 합니다. 확산 셀 분할 셀 마다 3 일 동안 접촉 저해 세포 접촉 저해 되 고 있다.
    1. 접촉 저해 셀에 대 한 매체를 7 일 동안 매 2 일 변경. 2 일 전에 접촉 ....

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결과

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우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 조건에서 크게 다른 슬로프를가지고 유전자를 확인 하 여 목록에 포함 되었다. 유전자를 확산 하 고 무부하 fibroblasts에 다른 감소율의 예는 그림 5에 나와 있습니다.

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토론

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정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 영향을 미칠 수 있습니다, 따라서, 한 정지 방법에 정보를 제공 하는 결과 및 추가 연구는 결정 하는 데 필요한 변경 내용을 정지 와 관련 된 se 당.

우리는 우리가 신생아 피부에서 고립 된 주 인간의 2 중 fibroblasts 사용. 우리는 10 번 미만 passaged 했다 섬유 아 세포와 함께 이러한 실험을 시작. 우리 때문에 나중에 통과 fibroblasts 삭제 그들은 senesce. 이 프로토콜은 확산 및 무부하 피.......

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공개 사항

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저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

감사의 글

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HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 & 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 & 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 & Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12,000 x g 및 4°에 도달할 수 있는 마이크로 원심분리기 튜브용 원심분리기; C
아가로스 겔
멸균 조직 배양 플레이트 및 원뿔형 튜브
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
소 태아 혈청VWR35-010-CV
조직 배양을 위한 멸균 혈청학 피펫, 피펫 및 피펫 팁
RNA 분리 및 분석을
시약 및 RNA 시료
RNaseZapInvitrogenAM9780
트립신-EDTA  솔루션: 10XMillipore Sigma9002-07-07
Sterile PBSLife Technologies14190-250
TrizolThermo Fisher Scientific15596018
Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mg은 전사를 억제합니다
Sterile DMSOFisher Scientific31-761-00MLactinomycin D
용 용매클로로포름Thermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc 제품
IsopropanolFisher ScientificBP2618500분자생물학 등급
에탄올Fisher ScientificBP28184분자생물학 등급
RNase-free 글리코겐(20 mg/ml 수용액)RNA 침전
을 위한 Thermo Fisher Scientific R0551 캐리어TURBO DNA-free 키트Thermo Fisher ScientificAM1907DNase로 DNA를 제거한 다음 후속 단계에서 DNA를 비활성화하고 2가 양이온을 제거합니다
. AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc 제품
RNA 젤용 로딩 염료Thermo Fisher ScientificR0641변성 전기영
Millenium RNA 마커Thermo Fisher ScientificAM7150RNA ladder
단색 RNA 스파이크인 키트애질런트 기술5188-5282Agient 마이크로어레이 분석을 위한 스파이크인 제어 예시
Tris baseFisher ScientificBP152-1분자 생물학 등급, TAE 완충액용
빙초산Fisher ScientificA38-500TAE 완충액
EDTAFisher용 ScientificBP120-500전기영동 등급, 겔용
Ethidium bromideMillipore SigmaE7637분자생물학용
외부 RNA 제어 컨소시엄 RNA 스파이크인 믹스Thermo Fisher Scientific4456740Spike-in control for RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48개 샘플, 12개 인덱스)IlluminaRS-122-2101RNA 염기서열분석
96웰 0.3ml PCR 플레이트Thermo Fisher ScientificAB-0600real-time qPCR용
Microseal B 접착 씰Bio-RadMSB1001real-time qPCR
Rnase/Dnase-free 시약 저장조VWR89094-662real-time qPCR
Rnase/Dnase-free 용 8개의 튜브 스트립 및 캡real-time qPCR
을 위한 Thermo Fisher Scientific AM12230SuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010for real-time qPCR
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880real-time qPCR
실행용 장비위한 개별 포장된 일회용 Rnase-free 피펫, 피펫 팁 및 튜브취급 시 착용할 수 있는 일회용 장갑 RNase 2.0 ml eppendorf tube 의 작업 표면 오염 제거용. 은 은 동 에도 적합합니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
  2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R.

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