방법 논문

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

DOI:

10.3791/56423

⸱

2018년 1월 2일

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

초록

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정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.

우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.

녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9의 수준에 변화와 관련 된 우리의 이전 연구 결과 바탕으로, 우리는 또한 변화에 차동 성적 부패에서 기여 여부 요청 무부하 fibroblasts 대 확산에 진 식입니다.

사본을 안정성을 모니터 하기 위해 우리는 성적 무부하 셀 대 확산에 게놈 넓은 감퇴의 속도 결정. 이를 위해, 우리는 새로운 전사의 억제제를 소개 하 고는 개별 성적표 사라진 시간이 지남에 속도 모니터링 하 여 무부하 fibroblasts 대 확산에 감소율 모니터링. 이 방법의 장점은, 단순히 새로운 사본 합성을 억제 함으로써 전체적인 유전자 발현을 모니터링 하는 방법에 비해 우리가 된다는 것에서 그들은 속도는 별도로이 성적에 대 한 부패 속도 확인할 수 복사할 수 있습니다.

새로운 전사를 억제 하 여 사본 감소율을 결정 ActD 치료 여러 이전의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. ActD 프로 염증 성 cytokines5치료에 기인 하는 사본 풍부에서에 RNA 안정성의 중요성을 해 부에 사용 되었습니다. 유사한 접근은 또한 그들은 차별화 된 근육 형10채택 차별화 된 C2C12 셀 대 확산 성적 부패 속도 차이 해 부하 사용 되었습니다. 또 다른 예로, 글로벌 mRNA 반감기 또한 만능에서 발견 된 하 고 차별화 된 마우스 배아 줄기 세포11. 이 예제에서 mRNA 감퇴 사본 풍부 규제에 대 한 및 다른 셀 상태를 셀의 변환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.

아래 설명 된 방법을 적용, 섬유 아 세포 확산 및 무부하 상태12에 비교할 때 약 500 유전자의 사본 감소율에 변화를 발견 우리. 특히, 우리는 예측에 관한 미르 29, downregulated 무부하 셀에는 대상 셀 전환 정지 때 안정화는 발견 했다. 여기 우리 확산 및 무부하 셀에 감소율을 결정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법론은 급속 하 게 부패 유전자에 대 한 정보는 때 두 비슷한 조건 하지만 뚜렷한 글로벌 mRNA 감퇴 속도 비교 유용 합니다. 그것은 또한 2 차원 3 차원 문화 대에서 성적 부패, 예를 들어, 셀 문화 조건의 효과 등 다른 질문을 해결 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 감소율 등 microarrays RNA 시퀀스 또는 실시간 정량 Pcr 방법 결정된 게놈 넓은 수 또는 북부 blotting 유전자, 유전자 또는 isoform에 의해 isoform 기준 감소율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 요금은 각 모니터링된 유전자의 반감기를 계산 하 고 부패 속도 두 가지 조건에 다른 유전자를 식별 하 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

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설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다.

1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비

참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포의 서로 다른 문화를 여러 번 반복 될 수 있다. 우리의 경험에서 한 10 cm (직경) 조직 문화 접시 (1 접시) 분석에 대 한 충분 한 RNA를 제공합니다. 필요한 경우 각 timepoint에 셀의 수를 늘리기 위해 각 샘플에 대 한 여러 조직 문화 요리를 풀링된 수 있습니다. 또한, 진정으로 독립적인 생물 복제로 다른 개인에서 격리 하는 섬유 아 세포와 같은 실험을 수행할 수 있습니다.

  1. 대 본 부패 분석에 대 한 셀의 확산 및 무부하 문화를 설정 합니다. 확산 셀 분할 셀 마다 3 일 동안 접촉 저해 세포 접촉 저해 되 고 있다.
    1. 접촉 저해 셀에 대 한 매체를 7 일 동안 매 2 일 변경. 2 일 전에 접촉 저해 fibroblasts 컬렉션에 대 한 준비가 proliferating 셀을 분할 합니다. 셀 문화 체계의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 이 섹션의 나머지 단계는 설정 하 고 셀 분할에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.
  2. 13설립된 프로토콜 따르면 신생아 피부에서 기본 피부 섬유 아 세포를 격리 합니다. 균질 인구를 위해 통로 섬유 아 세포입니다.
    참고: 섬유 아 세포 냉동 및 해 동, 필요한 경우 될 수 있습니다.
  3. 해 동 또는 필요한 경우 섬유 아 세포, replate. 37 ° C, 5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 무 균 조건 하에서 10% 세럼과 DMEM에 섬유 아 세포 성장. 10 미만 구절에 대 한 성장 된 섬유 아 세포를 사용 합니다. 섬유 아 세포 이어야 한다 < 80% 합칠 확산 및 무부하 인구 수 있도록 셀 분할의 날에.
  4. 조직 배양 접시를 여러 접시, prewarm PBS, 트립 신, 및 보통 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 혈 청으로 분할.
  5. 발음 또는 피펫으로 replated 될 세포와 각 조직 배양 접시에서 매체를 제거를 사용 하 여.
  6. 각 접시 (10 mL 150 m m, 100 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 5 mL, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의) 12 잘 접시의 우물 1 mL에 피펫으로 따뜻한 PBS.
  7. Aspirate 또는 피펫으로 각 조직 배양 접시에서 PBS를 제거 하려면.
  8. 부드럽게 피펫으로 1 트립 신-EDTA 각 접시 (8 mL 150 mm 접시, 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의)에 x.
    참고: 확인 1 살 균 10 diluting 하 여 트립 신-EDTA x 트립 신-EDTA 무 균 PBS에 x. 마지막 1 x 솔루션 0.05 %trypsin 및 0.02 %EDTA 이어야 한다.
  9. 5 분에 대 한 셀과 트립 신을 품 어.
  10. 부드럽게 접시 꺼내 접시에서 셀을 누릅니다.
  11. 피펫으로 세포를 단일 세포 현 탁 액으로 resuspend.
  12. 10% 세럼 150 m m 플레이트, 100 mm 접시, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL에 대 한 솔루션의 3 mL에 대 한 솔루션의 (8 mL과 DMEM의 동일한 볼륨을 포함 하는 원뿔 튜브 셀 trypsin 솔루션에 전송 그리고 12의 우물 1 mL 잘 접시).
  13. 트립 신을 제거 하려면 1000 x g 에서 5 분간 4 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다.
  14. 매체와 카운트의 적절 한 볼륨에 셀 셀 농도 결정 하는 hemacytometer와 resuspend.
  15. 확산에 대 한 100 m m 조직 문화 접시 당 씨앗 5 x 105 세포와 접촉 저해 셀.
  16. 이 메서드를 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 샘플 분석 (그림 1)에 필요한 설정 합니다.

2. ActD 시간 코스

  1. ActD 1 mg/mL (ActD, 살 균 PBS의 사용 950 µ L 및 살 균 DMSO의 50 µ L의에 대 한 1 밀리 그램)의 재고 농도에서 resuspend.
    참고: ActD의 냉동된 재고 솔루션 안정 되어야 한 달-20 ° c.에 대 한 희석 솔루션은 무시 되 고 더 사용 하기 위해 저장 하지 해야 합니다.
  2. 모든 생물 복제 세포 배양 접시를 위한 prewarmed 매체의 적절 한 볼륨 ActD 추가 0, 120, 240, 그리고 480 분 timepoints (그림 2) 설정 했다. ActD 매체의 mL 당 15 µ g의 농도에 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 오래 된 매체 떨어져 발음 ActD 포함 된 매체에 있는 셀에 추가.
    1. 1 mg/mL 주식에 대 한 추가 15 µ L 150 µ L을 추가 하는 매체, 예를 들어, 100 mm 접시에 대 한 매체의 10 ml의 각 ml ActD ActD.
  3. 제로 timepoint 샘플을 수집, 부드럽게 ActD 매체를 피펫으로 발음 하는 셀에 PBS를 prewarmed. 피펫으로 100 m m, 6 잘 플레이트의 우물 2 mL 및 12 잘 접시의 우물 1 mL에 대 한 솔루션의 5 mL 150 mm 접시에 대 한 솔루션의 10 mL.
  4. 부드럽게 발음 또는 피펫으로 PBS에서.
    참고: RNA 격리를 포함 하는 모든 단계는 RNase 무료 물, RNase 무료 microcentrifuge 튜브, RNase 무료 펫과 수행 되어야 한다. 장갑 착용 하 고 RNA와 함께 작업 하는 경우에 자주 변경 해야 합니다.
  5. 조직 문화 접시에 직접 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 (1 mL/10-cm 플레이트 4 x 105 4 x 107 셀)을 추가 합니다.
    참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션은 세포를 lysing 서로 다른 RNA, DNA, 그리고 단백질을 분리 하는 동안 RNA 품질을 유지 하는 monophasic 솔루션.
    주의: 페 놀 및 guanidine isothiocyanate은 부식성. 적절 한 보호를 사용 합니다.
  6. 피펫으로 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션-셀 혼합 균질 혼합물을 만들기 위해 여러 번 왔다 갔다.
    참고: 또는 최대 1 년-20 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 lysate를 저장할 수 있습니다.
  7. 후 적절 한 양의 시간 단계 2.3-2.6에 설명 된 방법을 사용 하 여 각 시간 포인트를 수집 합니다.

3. 페 놀 guanidine Isothiocyanate 솔루션 Lysate에서 총 RNA 격리

  1. RNA-단백질 복합물의 완전 한 해체를 위해 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
    참고: 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 프로토콜의 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행할 수 있습니다.
  2. 방법론 사용으로 검출 될 수 있는 제어 스파이크에 녹취 록을 소개 합니다.
알려진된 수량 및 농도에 각 샘플에 이러한 컨트롤을 소개 합니다.
참고: 외부 RNA 제어 컨소시엄 (ERCC) 스파이크 컨트롤 믹스14 특별히 설계 되었습니다 스파이크에서 컨트롤로 RNA-이 대 한 그것은 또한 북부 오 점 또는 실시간 정량에 대 한 사용할 수 있습니다. 스파이크에 컨트롤 microarray 기술을 위해 특별히 설계 된 제공 ( 테이블의 자료참조)도 있습니다.
  • Microcentrifuge 튜브 2.0 mL를 피펫으로에 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물을 전송. 사용 된 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션의 모든 1 mL에 대 한 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 0.2 mL 클로 프롬을 추가 (예를 들어, 1.5 mL 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 혼합물에 추가 하는 0.3 mL 클로 프롬).
  • 15 microcentrifuge 튜브를 적극적으로 흔들어 s 다음 3 분 동안 실 온에서 클로 프롬-페 놀-guanidine isothiocyanate 혼합물을 품 어 고.
  • 4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전
    참고: 초기 스핀 후 샘플 해야 별도 레이어로 3-상단 (그림 3)에 명확한 수성 층 그리고 바닥, 화이트/핑크 interphase, 중간에 빨간색 유기 층.
  • 수성 층 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브는 micropipette를 사용 하 여 전송.
    참고: 수이 과정 동안에 interphase를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 수 분수의 일부 떠날 괜찮습니다. 또한 interphase 레이어는 interphase 등의 일부를 포함 하도록 레이어 DNA와 RNA를 오염 시킬 것 보다는 수성 분수의 일부를 두고 하는 것이 낫다. 수성 층이 됩니다 약 절반 초기 볼륨, 그래서 약 0.9 mL의 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션/클로 프롬 혼합물은 1.8 mL.
  • Interphase 및 유기 분수를 삭제 합니다.
  • 수성 분수 2-프로 판 올의 동일한 볼륨을 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 수익률 10 미만6 셀 수집 때문에 낮을 것으로 예상 된다 하는 경우에 특히 샘플의 20 µ L 당 glycogen의 20 mg/mL 용액의 최대 1 µ L를 추가 합니다.
    참고:이 조밀 하 고, 단단한 펠 릿 스핀 단계 후 모니터링을 쉽게 발생 합니다.
  • 10 분 동안 실내 온도에 샘플을 품 어.
  • 4 ° c.에 20 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전 되도록,이 회전의 끝에, RNA는 튜브의 하단에 흰색 펠 릿을 형성 시 켰 던.
  • 피 펫, 제거와 상쾌한 화이트 RNA 펠 렛을 방해 하지 특별 한 주의가지고 삭제.
    참고: 초과 에탄올을 제거 하는 손잡고 개최 하는 느슨한 피펫으로 팁을 사용할 수 있습니다. RNA 펠 릿 방해 하지만 삭제 하지 탐정 스핀을 반복 하 고 다시는 상쾌한을 제거 수 있습니다. 이 전체 절차를 반복 조사를 요구할 것 이다으로 펠 릿을 삭제 하지 마십시오.
  • 75% 에탄올과 물의 25 %nuclease 무료 솔루션을 준비 합니다. 펠 릿을 세척 하 페 놀 guanidine isothiocyanate 솔루션 시 약의 1 mL 당 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다.
  • 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 회전
  • 제거한 후에 상쾌한의 대부분를 피펫으로 사용 하 여 여전히 복용 하지 않도록 주의 펠 렛을 방해 하는 동안 최대한 많은 에탄올을 제거.
    참고: RNA 펠 릿이이 단계에서 적은 소형 이며 이동 하는 경향이 있다. RNA를 손실 되지 않도록 하려면이 시점에서 펠 릿을 처리할 때 특별히 주의 해야 합니다.
  • 펠 렛의 모든 초과 에탄올을 실 온에서 2 분에 대 한 샘플 12000 x g 회전.
  • 사용 하는 펠 렛을 방해 하지를 돌보는 micropipette 튜브에서 모든 초과 에탄올을 제거 합니다.
  • RNA 펠 릿 어 5 분 동안 건조 하자.
  • RNA 펠 릿을 nuclease 무료 물 50 µ L을 추가 하 고 resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿.
  • 샘플 1 µ L 치료 DNase (2 단위 / µ L) DNA를 제거 하 고 다음 비활성화 DNase 및 양이온 ( 재료의 표참조)를.
  • -80 ° c.에 2.0 mL microcentrifuge 튜브에 RNA 샘플 저장

    • 4입니다. 성적 풍부의 분석

    1. RNA를 계량 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여에 대 한 RNA를 확인 합니다.
      참고: 260에서 흡 광도의 비율 280 nm nm RNA에 대 한 약 2.0 이어야 한다.
    2. 1 %agarose 젤 또는 저하의 정도 시각화 하는 해당 기술 RNA를 분석 합니다.
      참고: 두 취소 18S를 대표 하는 밴드 그리고 28S rRNA 명확 하 게 보이는 (그림 4)를 해야 한다. 이러한 밴드 표시 되지 않는 경우 RNA 저하 될 수 있습니다. 문제 촬영 팁 RNA 저하에 대 한 토론에 제공 됩니다.
    3. 모니터 대 본 풍부한 RNA의 수집된 aliquots에 비해 아군에 내부 표준 microarrays15, RNA-Seq16,17, 실시간 정량 Pcr 사용 하 여 또는 북부 몰아내고18.
      1. 알려진 풍요의 제어 아군에 비해 각 시간 지점에서 각 사본에 대 한 풍부를 결정 합니다.
        참고: microarrays, 값 형광 강렬 될 것입니다. 북부 오 점, x 선 필름에 밴드를 측정할 수 있습니다. 실시간 정량 pcr, 2-σσCT 방법19알려진된 표준 비교해보면 사본 풍부를 확인할 수 있습니다. RNA-Seq에 대 한 정규화 된 값은 FPKM 또는 kilobase 백만 읽기 매핑된 당 exon의 당 조각으로 확인할 수 있습니다. Isoform 특정 감소율에 대 한 RNA-Seq 데이터 DEXSeq20같은 isoform 인식 방법론을 사용 하 여 분석 수 있습니다. Isoform 특정 감소율은 최고의 RNA이 결정 Microarray 데이터 결정 될 경우, 유전자에 의해 유전자 단위가 아닌 프로브, 프로브 기초 데이터를 분석 해야 합니다. 애 널 리스트는 감지기의 제한 된 수의 정보를 해석할 때 주의 해야 합니다. 예를 들어, 5 이하의 프로브 특정 isoform에 대해 유익 하지 않은 있을 수 있습니다. 이 경우에, 분석 결과 신뢰할 수 있는 이러한 프로브 동작 충분히 일관 되는지 확인 해야 합니다.
    4. C-Myc 및 자신감을 요금을 정확 하 게 감지 했다 그 성적 부패를 GAPDH 처럼 천천히 부패 유전자 처럼 급속 하 게 부패 유전자 분석에 수집 된 샘플에서 격리 된 RNA17 에 실시간 정량 Pcr을 수행 합니다.
      참고: 추가 확인에 대 한 isoform 특정 실시간 정량 프로브 개발 고21동안 특정 isoforms의 풍부를 모니터링 하는 데 사용.

    5입니다.감퇴 속도 상수 결정

    1. 각 timepoint에 대 한 로그-변환 (유전자 또는 isoform 특정) 각 사본에 대 한 풍부한 값입니다.
      참고: 로그 변환 값으로 변환 됩니다 지 수 감퇴 곡선 선형 감퇴 모델22로 들어갈 수 있는 라인.
    2. 각 대 본 (유전자 또는 isoform 특정) 선형 감퇴 모델에 대 한 식 프로 파일에 맞게. 이러한 모델에 대 한 공식은 f (t) = C-r * t. 이 방정식에 C는 녹취 록의 시작을 나타냅니다 상수, r의 감소, 속도 이며 t는 시간 실험의 처음부터. 이 방정식에서 r*ln(10)와 감퇴 속도 결정 (참조11참조).
      참고: maSigPro 소프트웨어 패키지는 회귀 기반 접근 시간 코스 데이터23에 중요 한 유전자 식 프로필 차이 탐지 하도록 설계 되었습니다. 샘플 코드 및 maSigPro에 대 한 결과에 사용할 수 있습니다: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
    3. 필터 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자를. 이 ANOVA F-검정을 수행할 수 있습니다.
      참고: F 검정은 유사로 정의 되는 F-통계, 기반 샘플 의미 샘플 내에서 변이 나눈 사이. 선형 스텝 업 Benjamini 및 Hochberg 거짓 발견 절차24를 적용 하 여 여러 비교에 대 한 p 값을 수정 합니다. Q 값 F-검정 0.05 보다 큰 로그 선형 감퇴 모델에 맞게 실패 하는 유전자는 컷오프로 사용할 수 있습니다.
    4. 여 지 없이 세포 주기 상태와 시간 사이 중요 한 상호 작용 기간 성적을 결정 하는 ANOVA F-검정을 수행 (틀린 발견 비율, 루즈벨트 < 0.05).

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    결과

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    우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접촉 저해 조건에서 크게 다른 슬로프를가지고 유전자를 확인 하 여 목록에 포함 되었다. 유전자를 확산 하 고 무부하 fibroblasts에 다른 감소율의 예는 그림 5에 나와 있습니다.

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    토론

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    정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 영향을 미칠 수 있습니다, 따라서, 한 정지 방법에 정보를 제공 하는 결과 및 추가 연구는 결정 하는 데 필요한 변경 내용을 정지 와 관련 된 se 당.

    우리는 우리가 신생아 피부에서 고립 된 주 인간의 2 중 fibroblasts 사용. 우리는 10 번 미만 passaged 했다 섬유 아 세포와 함께 이러한 실험을 시작. 우리 때문에 나중에 통과 fibroblasts 삭제 그들은 senesce. 이 프로토콜은 확산 및 무부하 피...

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    공개 사항

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

    감사의 글

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 & 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 & 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 & Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    12,000 x g 및 4°에 도달할 수 있는 마이크로 원심분리기 튜브용 원심분리기; C
    아가로스 겔
    멸균 조직 배양 플레이트 및 원뿔형 튜브
    Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
    소 태아 혈청VWR35-010-CV
    조직 배양을 위한 멸균 혈청학 피펫, 피펫 및 피펫 팁
    RNA 분리 및 분석을
    시약 및 RNA 시료
    RNaseZapInvitrogenAM9780
    트립신-EDTA  솔루션: 10XMillipore Sigma9002-07-07
    Sterile PBSLife Technologies14190-250
    TrizolThermo Fisher Scientific15596018
    Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mg은 전사를 억제합니다
    Sterile DMSOFisher Scientific31-761-00MLactinomycin D
    용 용매클로로포름Thermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc 제품
    IsopropanolFisher ScientificBP2618500분자생물학 등급
    에탄올Fisher ScientificBP28184분자생물학 등급
    RNase-free 글리코겐(20 mg/ml 수용액)RNA 침전
    을 위한 Thermo Fisher Scientific R0551 캐리어TURBO DNA-free 키트Thermo Fisher ScientificAM1907DNase로 DNA를 제거한 다음 후속 단계에서 DNA를 비활성화하고 2가 양이온을 제거합니다
    . AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc 제품
    RNA 젤용 로딩 염료Thermo Fisher ScientificR0641변성 전기영
    Millenium RNA 마커Thermo Fisher ScientificAM7150RNA ladder
    단색 RNA 스파이크인 키트애질런트 기술5188-5282Agient 마이크로어레이 분석을 위한 스파이크인 제어 예시
    Tris baseFisher ScientificBP152-1분자 생물학 등급, TAE 완충액용
    빙초산Fisher ScientificA38-500TAE 완충액
    EDTAFisher용 ScientificBP120-500전기영동 등급, 겔용
    Ethidium bromideMillipore SigmaE7637분자생물학용
    외부 RNA 제어 컨소시엄 RNA 스파이크인 믹스Thermo Fisher Scientific4456740Spike-in control for RNA Seq
    TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48개 샘플, 12개 인덱스)IlluminaRS-122-2101RNA 염기서열분석
    96웰 0.3ml PCR 플레이트Thermo Fisher ScientificAB-0600real-time qPCR용
    Microseal B 접착 씰Bio-RadMSB1001real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free 시약 저장조VWR89094-662real-time qPCR
    Rnase/Dnase-free 용 8개의 튜브 스트립 및 캡real-time qPCR
    을 위한 Thermo Fisher Scientific AM12230SuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010for real-time qPCR
    AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880real-time qPCR
    실행용 장비위한 개별 포장된 일회용 Rnase-free 피펫, 피펫 팁 및 튜브취급 시 착용할 수 있는 일회용 장갑 RNase 2.0 ml eppendorf tube 의 작업 표면 오염 제거용. 은 은 동 에도 적합합니다.

    참고문헌

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