주의 골 기능 재생성 된 대 퇴 골으로 이어지는 쥐 모델에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜

요약

이 연구는 재현 하 고 상세한 프로토콜 사용 하 여 새로 개발된 된 외부 fixator 산만 골에 대 한 (할) 대 퇴 쥐에 모델 외부 fixator의 제거 후에 동물에 의해 체중 베어링 생리는 허가 설명 합니다.

초록

이 프로토콜에서는 산만 골 쥐 대 퇴 모델에 대 한 새로 개발된 된 외부 fixator 사용 하 여를 설명합니다. 주의 골 (마)은 뼈는 뼈 후 재생 수술 기법을 선도. Osteotomized 사지 이동 서로 떨어져 점진적 산만 하 여 원하는 신장에 도달 합니다. 이 절차는 하위 및 상위 사지 길게 하 고는, 치료 후에 없앤, 뼈 또는 뼈 종양 절단에 대 한 뿐만 아니라 악 안 면 재건 수술은 뼈의 재생에 대 한 인간에서 널리 이용 된다. 몇 가지 연구는 명확 하 게는 기능 재생성 된 뼈, 즉, 뼈 외부 fixator의 제거 후 골절 없이 생리 적 체중 부하를 지 원하는 것을 얻기에 그들의 프로토콜의 효율성을 보여줍니다. 또한, 프로토콜에 대 한 변화 그리고 재현성 연구 어려운 사이 비교를 만드는 정보의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 연구의 목적은 쥐 다리 길이, 외부의 제거 후에 동물에 의해 생리 적 체중 부하를 허용 상세한 외과 기술에 대 한 적절 한 외부 fixator 디자인 구성 재현 가능한 프로토콜을 개발 했다 fixator입니다.

서론

주의 골 (마)는 수술 기법 널리 사용 임상^1,2,,34 인 간에 있는 낮은^1,2 , 상단³ 다리 길이, 없앤, 뼈 또는 악 안 면 재건⁴에서 뿐만 아니라 뼈 종양 절단에 대 한 수술은 뼈의 재생 후 치료. 뼈와 뼈에서 외부 fixator의 배치 후 재생을 뼈를 리드 할. Osteotomized 사지 이동 서로 떨어져 점진적 산만² 원하는 신장에 도달 합니다. 통합 기간 동안 더 더 신장은 다음과 같습니다.

할 절차는 3 가지 단계로 나누어져: 대기 시간, 주의 및 통합. 일반적으로, 7 일 대기 시간 뼈⁴직후 시작합니다. 뼈 치유 과정⁴의 초기 단계를 시작 하려면 수리를 수 있습니다. 대기 시간 뒤 끄는 기간 견인 힘 재생성 된 굳은 살 및 주변 부드러운 조직^1,,24에 적용 됩니다. 원하는 신장에 도달 하면 산만 중지 되 고 통합 기간 시작 됩니다. 이 기간 동안 외부 fixator 재생성 된 뼈의 제거를 지원 하기 위해 충분히 기능적 될 때까지 유지 됩니다.

다양 한 매개 변수 길이 및 속도 외부 fixator의 길이, 종류, 주의 산만의 주파수, 통합 기간, 또는 산만된 굳은 살에 적용 되는 기계적 스트레스의 종류의 길이 같은 뼈 복구에 영향을 미칠지 않습니다. 예를 들어, 속도 주파수의 길이 될 수 있습니다 조 통합⁵ 또는 프로세스의 중단 괴 사 성 조직이 나 굳은 살^6,7안에 cysts 같은 복구할 수 없는 피해를 만들어.

많은 할 프로토콜 적용된 다른 동물 모델^8,,910 뼈 복구 프로세스를 공부 하 고 뼈 통합을 최대화 하기 위해 되었습니다. 쥐, 대부분 연구^{11,12,13,,1415} 굳은 살 통합을 가속화 하 여 할 프로토콜을 단축 하는 방법에 집중 했다. 이러한 실험적인 연구 중 일부는 인간의 임상 응용 프로그램^5,13,,1516외부 클램프 이미 상업적으로 사용할 수를 사용. 그러나, 이러한 유형의 외부 fixator 쥐 대 퇴 골, 인간의 대 퇴 골에서 다른 해부학 적 특성을 전시에 대 한 적합 하지 않습니다. 또한, 몇 가지 연구는 명확 하 게 기능 재생성된 뼈^7,16취득에 그들의 프로토콜의 효율성을 보여 줍니다. 따라서 그들의 서로 다른 프로토콜 외부 fixator^12,13,,1417에 대 한 정보의 부족으로 다양 한 할 연구에서 결과 비교 하기가 어렵습니다.

따라서,이 연구의 목표는 쥐 모델에서 기능 재생성된 뼈에 이르게 하는 대 퇴 골에 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜에 대 한 설명 했다. 이 위해, 우리는 특히 쥐 대 퇴 골, 우리는이 프로토콜에 자세히 설명 되어 있는 대 한 수 제 하 고 사용 하기 쉬운 외부 fixator 설계 되었습니다. 이 장치에 대 한 기술 사양의 초안에 우리 계정에 기계적인 긴장 및 잔류 응력의 생산을 피하는 좋은 분포에 대 한 모든 근본적인 제약 했다. 기술 사양 포함 뼈와 주변 조직에 순수한 견인 힘을 허용 하는 장치에 대 한 적절 한 형상, 동물, 뼈 신장의 길이 그리고 뼈 세그먼트의 좋은 정렬의 제어의 걸음 걸이 대 한 적절 한 체중 없이 핀과 뼈의 교차로에서 전단 응력의 생산. 또한,이 장치는 산만, 생체, 그리고 손상 없이 sterilizable 동안 동물의 진정 작용 하지 않고 사용할 수 했다. 통합의 7 주 후 쥐의 대 퇴 골에 대 한이 프로토콜 외부 fixator의 제거 후 재생성 된 굳은 살의 골절 없이 동물의 생리 적 체중-베어링에 의해 증명 기능 재생성 된 뼈, 이끌어 냈다. 동물의 생리 적인 걸음 걸이 재생성 된 굳은 살의 마이크로-CT 분석 및 x 선 분석에서 얻은 건축 매개 변수 일치 했다.

프로토콜

설명 하는 모든 절차는 대학의 엑스-마르세유 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프랑스 연구 사역에 의해 승인 되었고 마르세유 의료 학부 (기존의 동물 하우스에서 수행 프랑스).

1.는 외부 Fixator 지침에 따라 다음의 기능 사양 정의

1. 최적화 뼈 앵커리지.
   1. 절반 스레드 (스레드 섹션)의 직경 1 m m의 핀을 이식.
2. 동물에 대 한 불편을 줄이기 위해 디자인 선택.
   1. 7,723 mm ³ (19 m m x 12.7 m m x 32)의 볼륨에 맞는 작은 크기의 외부 fixator를 선택 하십시오.
   2. 선택 된 외부 fixator 낮은 무게, 동물을 방해 하지 않으려면 핀 없이 미만 13 g ' 걸음 걸이. 그것의 저밀도 때문에 두 개의 블록에 대 한 소재로 알루미늄을 선택.
      참고: 블록의 모따기 상당히 두 부품의 무게 감소.
3. 장력의 방향으로 뼈의 방향에 평행 하 게 유지 되도록는 fixator의 움직임을 제어 하 고 순수 인장 힘 보장.
   1. 사용 두 블록은 그 바 슬라이딩. 그루브 하 고 각각 2 개의 핀을 견딜 수 있도록 블록을 엽니다.
   2. 블록에 자유롭게 그 부드러운 한쪽으로는 신장 나사를 사용 하 고 수 수 의해 사로 잡혔다 손가락으로 하 고 두 번째 블록을 전치 하는 스레드 측면으로 회전. 뼈 골절, 장력의 방향으로 뼈의 방향에 평행 하 게 유지의 각 측에 2 개의 핀을 앵커. 핀에 긴장의 좋은 배포를 허용 하도록 경도 축에 인장 세력을 유지 합니다. 잠금 스크류가 있는 4 핀을 확보.
4. 알루미늄, 티타늄, 그리고 살 균 온도 견딜 수 있는 강철 같은 재료 선택.
5. 외부 fixator 형상에 해당 하는 핀 배치 확인 ( 그림 1 -B).
   1. 시추 위치를 유지 하기 위해 뼈에 강화 클램프 포함 된 드릴링 가이드를 사용 하 여.
   2. 낮은 클램핑 힘에 대 한 클램프의 레버 팔 단축. 측면을 지우려면 미래의 골절 위에 장치 가운데 클램프 위치.
6. 확인 설명서를 쉽게 주의 강화 하 고 모바일 블록 해제 널드 나사를 추가 하 여 조정.
   1. 충분히 혼자 손가락으로 조작 하는 넓은 나사를 사용 하 여.
   2. 신장 나사 쉽게 산만 수 있도록 두 개의 블록 사이의 중간 드릴된 사각 너트 추가.
   3. 얇은 핀을 가진 수동 사용을 허용 하도록 두 개의 블록 또는 개체의 모든 종류 보다 더 큰이 사각형 너트 (각 측에 8 m m)를 확인 합니다. 회전 스크류 ¼ 0.125 m m 길이 허용 하도록 설정.

2. 수술

참고: 조 수는 모든 수술 과정에 대 한 필요. 4 12 주 된 남성 Sprague Dawley 쥐 표준 실험실 다이어트 광고 libitum 지 루 했다.

1. 수술 도구 준비.
   1. 다음 모든 수술 기구를 소독: 1 rugine, 2 Senn ' s 견인 기, 1 마이크로 올 슨 Hegar 바늘 홀더, 1 마요네즈 Hegar 바늘 홀더, 1 마요네즈 시저, 그리고 1 메스.
   2. 외부 fixator 드릴링 가이드, 4 절반 스레드 핀, 4 나사, 끝, 훈련, 및 팁 및는 piezotome의 문자열 소독. 18 분 135 ° C에서 압력가 마로 소독 하 여이 계측기를 소독
   3. 수술 테이블에 메 마른 분야 아래 난방 패드를 설치합니다. 모든 도구 또는 도구 다른 살 균 분야에 배치.
2. Anesthetize 동물 준비.
3. 마 취 및 진통 혼합물 준비 하 쥐 무게
1. 확인 계산 Bupremorphine 및 Carprofen 임기 진통 혼합물을 준비 하 고. 0.05 mg/kg와 5mg/kg. Buprenorphine (0.03 mg/mL)와 Carprofen (5 mg/mL)를 각각 사용
2. 쥐 억제 피하 주사 진통 혼합물. 잠깐 몇 초, 그리고 주사 마 취 혼합물 intraperitoneally.
3. 전기 면도기와 오른쪽 뒷 다리를 면도 하 고 소독 povidone-요오드 솔루션 사지.
4. 동물을 옆으로 누워 (오른쪽 위로) 입장 축 외부 fixator의 정확한 위치 수 있도록 메 마른 분야에.
5. 수술 하는 동안 그것의 눈을 보호 하기 위해 그것의 머리에 무 균 압축 넣어.
4. 퇴에 외부 fixator 이식.
5. 랜드마크 피부 절 개
   입니다. 표시와 함께 화살 비행기에서 중간 라인을 따라 인접 부분 (엉덩이)의 원심 부분 (무릎)에서 포인트와 2 포인트를 그립니다. 다음이 2 점 사이 선을 그립니다.
   1. 메스를 사용 하 여 드로잉 라인을 따라 뻗어 피부 incise.
   2. 잘라 팔 뚝 femoris와 vastus lateralis 대 퇴 골은 완전히 노출, 메스의 도움으로 때까지. 사용 2 Senn ' s 견인 기 (보조 필요할 수 있음)을 촉진 근육 절 개.
   3. 는 고는 rugine의 도움으로 뼈에서 부드러운 조직 분리.
   4. 노출된 대 퇴 골은 충분히 확인 하십시오.
      1. 외부 fixator의 가장 인접 하 고 원심 구멍에 핀을 삽입.
      2. 외부 fixator를 놓고 두 핀 대 퇴 골에 고정 될 수 있다 확인 하십시오.
   5. 이식 4 병렬 1mm 절반 스레드 핀 대 퇴 골.
      1. 드릴링 가이드를가지고 고 2 Senn와 근육 떨어져 이동 ' s 견인 기. 대 퇴 골의 중간 드릴링 가이드의 클램프를 조여.
      2. 드릴 4 중 대 퇴 골에 구멍. 0.6 m m 직경의 금속 드릴 비트 4 가이드 구멍을 통해 전달 하 여 2000 rpm의 속도로 구멍을 드릴 전기 드릴을 사용 하 여.
         1. 가장 인접 하 고 원심 시작 구멍 및 두 끝 중간 가이드의 것 들. 하지만 두 외피가 통과 하지 바로 대 퇴 골 아래 부드러운 조직 손상 조심.
      3. 드릴링 가이드 벗고.
      4. 절반 스레드 핀 0.8 m m 4 전 구멍을 확대.
         1. 일 앞뒤로 통해 0.6 m m 핀 구멍. 대 퇴 골 두 외피가 통해 싱크를 수직 유지 조심.
      5. 절반 스레드 핀 1 m m 임 플 란 트.
         1. 바늘 홀더를 가진 1 절반 스레드 핀의 머리 그립.
         2. 사전 구멍을 확대 하려면 핀 싱크. 핀 두 외피가 침투는 Senn로, 1mm 이상의 내 다 하지 않습니다 확인 ' s 견인.
      6. 외부 fixator 4 절반 스레드 핀에 연결. 있는지 확인 오프셋 (는 fixator 사이의 거리 ' s 두 블록 및 뼈 표면)는 쉽게 바늘 및 시스템 ¹⁸의 좋은 강성 수 있도록 약 6 m m.
      7. 외부 fixator 핀에 잠겨 있도록 4 잠금 나사를 확보.
6. 퇴 osteotomize.
   1. 수행 하는 piezotome와 2 중앙 핀 사이 뼈.
   2. 닫습니다 wound resorbable 봉합 스레드 (5.0)와 마요네즈 Hegar 바늘 홀더 연속 스티치를 사용 하 여. 피부만 물 렸 다는 것을 확인 하지 근육.
7. 수술 모니터 동물을 확인 합니다.
8. 수행 동안 동물 여전히 마 취, 수술 후 엑스레이
   . 모든 핀의 깊이 확인 하 고 osteotomized 사지 긴 축을 따라 정렬 됩니다.
   1. 확인 진통 및 Buprenorphine (0.03 mg/mL)와 각각 0.05 mg/kg에 10 mg/kg. Enrofloxacine (50 mg/mL)의 피하 주입에 의해 antibioprophylaxy
   2. 결정 하 고 마 취를 antipamezole의 양을 계산. 1 mg/kg에서 antipamezole를 사용 하 고 제품 관리를 피하 주사를 할. 식을 회복 하 고 그것의 감 금에 반환을 동물 허용.
   3. 피하는 수술 후 6 시간 주입 0.05 mg/kg와 5mg/kg에서 각각 진통 혼합물 (Buprenorphine 및 Carprofen)의 두 번째 복용량.
      다음 3 일 이상, 줄이 주사 진통 혼합물에 대 한 하루에 두 번 하 고는 antibioprophylaxy에 대 한 하루에 한 번. 정기적인 임상 시험 진통의 효과 평가 하기 위해 수행 해야 하 고 각 동물의 행동 징후에 따라 수정 해야 합니다.
   4. 동물 수술 다음 날에 일반적으로 그들의 운영된 뒷 다리를 사용 하 여 걸을 수 있는 확인.

3. 산만

1 주에 대 한

1. 중립에 두고 외부 fixator 고정. 이 단계의 끝에서 다리를 x 선. 뼈 세그먼트의 맞춤 핀의 위치를 확인 하십시오.
2. 수동으로 차례 사각형 너트 1/2 회전 (0.25 mm) 시계 방향으로 모든 12 h 주의 수행. 12% 운영된 뼈 세그먼트의 초기 길이 기준으로 길이 5mm 뼈 길이에 지도 해야 하는 10 일 동안 즐겁게.
   1. 가이 단계 동안 동물을 anesthetize 하지 않습니다. 절반 방법을 통해 고 핀 뼈 세그먼트의 맞춤의 위치 확인이 기간의 끝에 다리를 x 선.
3. 47 일 동안 외부 fixator를 유지. 산만된 갭 석 회화의 진행 상태를 확인 하려면 매주 사지 x 선. 하루 64에 외부 fixator를 제거 하 고 2 일 (하루 66) 자유롭게 동물 산책 하자. 총 통합 기간 지속 7 주.
4. 흡입된 sevoflurane의 과다와 함께 통합의 7 주 후 모든 쥐를 안락사.
5. 주변 조직 없이 산만 하 고 contralateral 화관 resect.
   1. 만들 흉터에 피부 절 개를 메스의 도움으로 화살 비행기 다음 중간 줄에 위치 해 있습니다. 무릎의 앞에 엉덩이의 위에서 절을 실행.
   2. 퇴 완전히 노출 될 때까지 팔 뚝 femoris와 vastus lateralis 메스로 잘라. 최대한, 뼈에 부착 된 근육을 분리 하십시오.
   3. 무릎의 모든 인 대를 절단 하 고 조음 철거.
   4. 엉덩이의 공동 캡슐을 잘라.
   5. 절반 스레드 핀을 제거 하지 않고 철저 하 게 뼈를 청소. 메스와 모든 부드러운 조직을 제거.
6. Contralateral 대 퇴 골에 대 한 3.5.5 3.5.1에서 단계를 반복.
7. 엑스레이 산만 하 고 contralateral 화관. 4 반 스레드 핀을 제거 하 고 마이크로-ct 분석 (10 µ m 해상도)-20 ° C에서 모든 화관 저장.

결과

통합의 끝에 수술의 끝에서 찍은 x 선 이미지 안정 앵커리지를 나타내는 대 퇴 골의 절반 스레드 핀의 아무 완화 했다. 핀 병렬 및 잘 보존 했다입니다. Osteotomized 사지 마 과정 (그림 2) 뼈의 경도 축에 잘 부합 했다. 대기 시간 기간의 끝에, 아무 석 회화 영역 표시 (그림 2B) 했다. 주의 기간의 끝에, 몇 가지 석 회 질된 분야 기존 외피가 (그림 2C) 가까이 보였다. 통합 (주 45)의 28 일 후 osteotomized 사지 사이 간격의 비 석 회화 지역 작은 고 periosteal 굳은 살 핀 (그림 2D)의 수준에서 뿐만 아니라 갭 근처 ...

토론

이 연구는 쥐 다리 길이, 외부 fixator의 제거 후에 동물에 의해 생리 적 체중 부하를 허용 상세한 외과 기술에 대 한 적절 한 외부 fixator 디자인 구성 재현 가능한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 할 프로토콜 기능 재생성된 뼈 이끌어 냈다. 통합의 47 일 후 제거 만든 외부 fixator와 동물에 의해 생리 적 체중 부하의 2 일 재생 굳은 살의 골절을 유도 하지 않았다. 마이크로-CT 개조 덕분에 완전 한 브리징의 증거 확인 재생성 된 굳은 살 기능 했다. 이전 연구는 명확 하 게 석 회화 브리지의 존재 재생성 된 굳은 살¹⁹유지할 수 있는 부하 사이 긍정적인 상관 관계를 설명 했다. 또한, 재생성 된 굳은 살에 대 한 발견 하는 vBMD vBMD controlateral 다리²⁰에서 대 퇴 골의 diaphysis 부분에 대 한 발견의 약 67% 이었다. 우리는 또한 이전²¹을 설명 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케이&이큐트; tamine	Renaudin	578 540-2	동물 사육장
Mé에 의한 공급; DÉ tomidine	Virbac	6799091	동물 사육사
Sevoflurane	Centravet	567 477-2	동물 사육
Buprenorphine	Indivor 프랑스	3400932731060	동물 사육
Enrofloxacine	ChannelPharmaceutical Facturing	FR/V/4955220	동물 사육사
Piezotome	Satelec Acteon	F57510
동물 사육장에 의한	난방 애완 동물 패드	Therasage	AL8365936
치과 X-ray	S.A.R.L 혁신 mé dicales et dentaires	WYZ - BLUEX
Winiwix Software	Softys Dental	PFT
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Betadine Solution	Mundipharma Medical Company	D08AG02	동물 사육사
공급 재흡수성 봉합사 (5.0)	Ethicon	JV1023	동물 사육
Rugine	Word Precision Instruments	503406
Mayo-Hegar 바늘 홀더	Word Precision Instruments 공급
금속 드릴	Beuterlock	V020944018003
Micro Olsen-Hegar 바늘 홀더	Word 정밀 기기	501989
Mayo 가위	Word 정밀 기기	501752
메스	Word 정밀 기기	500236
Sprague-Dawley	Janvier	없음	12 약자와 남성