정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

Summary

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

Abstract

교양된 설치류 두뇌 분할은 신경 및 그들의 정상적인 vivo에서 상호 작용의 대부분을 유지 하는 환경에서 명과의 세포질이 고 분자 행동을 공부 하 고 유용 합니다. 다양 한 유전자 변형 마우스 라인 또는 붙일 태그가 단백질 또는 야생 타입 두뇌 조각에서 기자 들의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터의 사용에서 얻은 조각 고해상도 이미징 형광 현미경 검사 법에 의해 허용. 비록 뇌 조각, 조각 문화를 결합 하 여 수행 하는 기능을 영상에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다 오래 기간 동안 라이브 분할 영역에 특정 셀의 반복적인 고해상도 이미징 문제 행 세 하고있다. 이것은 최고의 사용자를 보호 하 고 교차 오염을 방지 하는 닫힌된 시스템에서 수행 하는 이후 외 인 단백질의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터 사용 하는 경우 이것은 특히 사실. 간단한 수정 롤러 튜브 뇌 조각 문화 방법에 많은 주 동안 조각의 반복 고해상도 이미징 동봉된 시스템에서 허용 하는 보고 됩니다. 경작 photoetched coverslips에서 조각 신속 하 고 정확 하 게 다른 치료 전후 시간이 지남에 동일한 필드를 이미지를 무대 위치를 표준 마크의 사용을 허용 합니다. 예 특정 신경 얼룩 및 hippocampal 조각 건축에서 변화를 관찰 하는 식, 형광 단백질의 바이러스 중재 신경 식 및 cofilin 병리학의 개발이이 방법의 사용에 대 한 표시 됩니다. 이전 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드의 올리고 슬라이스 치료 응답에 Alzheimer의 질병 (광고)의 해 마에서 관찰 되었다.

Introduction

해리 신경 설치류 두뇌의 지역에서의 기본 문화 연구자에 의해 병 적 응답을 관찰 하는 데 사용 하는 중요 한 도구 연루 자극 이다. 그러나, 이러한 연구 결과 뉴런만 2d에서 고 glial 지원 시스템 없이 보는 단점이 있다. 또한, 그것에 매우 높은 밀도 (640 뉴런/m m² 또는 표면적의 약 16%)의 조건 하에서 성장 하지 않는 한 불가능 하다 hippocampal 세포 몸, 짧은 거리 보다 더 모 수석 또는 축 삭의 무작위 결과 따라 신경 생존 4 주 이상¹을 제한 연령 관련 pathologies의 확장된 연구에 대 한 천연된 문화를 사용 하 여 크게 떨어진다. 쥐 두뇌에서 준비 하는 조각의 경작 주 또는 몇 개월에 대 한 조직된 세포 건축과 생존 능력을 유지 하 여 이러한 한계를 극복 하는 매력적인 옵션 이다. 조각 문화에 설치류 두뇌의 많은 다른 영역을 유지 하기 위한 조건 설명된²되었습니다.

두 가지 주요 방법을 뇌 조각의 장기적인 문화 위해 널리 이용 된다: 공기-액체 인터페이스³ 막에 경작 또는 밀봉 된 튜브에 coverslips에 경작 폭⁴를 제공 하는 롤러 인큐베이터에서 회전 수. 세포 막에 경작 하는 조각 직 립 현미경과 물 집중 목표⁵를 사용 하 여 고해상도 형광 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 또는, 조각 세포 막에 교양 있다 유리 하단 요리는 거꾸로 한 현미경⁶을 사용 하 여 모 수석 등뼈의 좋은 해상도 달성 하기 위해 양도 되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 세포 막에 성장 조각 이미징의 중간 변화를 필요로 하 고 자주를 방지 하거나 줄이기 위해 오염^5,6antifungal 항생제 사용할 오픈 시스템 있습니다. 공기-매체 인터페이스에서 막에 조각 우수한 형태 및 생존, 유지 하지만 실험만 작은 셀 그룹에 다음과 같은 하지 않으면 높은 확대에 반복적인 이미징 동안 정확한 위치에 반환 하는 것은 매우 어려운 형광 성 감 적 표현. 세포 막에 성장 조각 transgenes^5,6의 바이러스 중재 식이 사용 되었습니다, 비록 biosafety 프로토콜 동봉된 문화 시스템에 사용 되는 특정 바이러스 성 벡터에 대 한 고용 수 필요할 수 있습니다. 단백질 및 세포 생리학의 기자 태그 붙일 표현. 또한, 침수 목표 문화⁵에 따라 샘플 사이 오염 제거를 해야 합니다. 막 인터페이스 문화의 주요 응용 프로그램 시간 포인트⁷에서 생리학과 고해상도 이미징을 결합 이다.

플라스틱 튜브 안에 coverslips와 롤러 튜브 메서드는 coverslip 제거 하지 않고 어떤 전기 생리학 또는 고해상도 이미징 허용 하지 않습니다. 따라서,이 메서드는 장기 연구는 후 고정 관찰 한⁸에 가장 자주 적용 되었다. 여기에 설명 된 롤러 튜브 문화 기술을 활용 하지만 만큼 문화에 대 한 반복적으로 몇 군데 수 coverslips에 조각으로 교 련된 아웃 튜브에 유지 되는 방법이입니다. 동봉 된 시스템 이미징에 대 한 중간 변화를 요구 하 고 높은 확대, 일 또는 주 후에 정확한 필드 이전 몇 군데 이미징 수 있도록 하는 표준 마크를 제공 하는 photoetched coverslips를 활용 하 여.

우리 쥐 해 마 메모리 및 학습에 관련 된 주요 뇌 영역에에서 변화를 검사 하려면이 메서드를 적용 합니다. 쥐 해 마 종종 병 적인 또는 연령과 관련 된 변화 인지 장애⁹, 광고에서 발생 하는 개발 하는 동안 관찰 모델으로 공부 된다. 우리의 방법은 AD⁸의 특징은 Aβ 펩 티 드, 증가 등 환경 변화에 대 한 응답에서 시간이 지남에 단일 슬라이스 내에서 개발 하는 병리학 변화를 공부 하는 특히 적합 합니다. 한 병리학 인간과 설치류 광고 뇌와 관련 된 cofilin 걸의 존재 이며 봉, 필 라 멘 트 cofilin와 말라의 후자 포함 번들은 1:1 어 금 니 비율^{10,11, 12}. 봉 고정 조각 cofilin GFP hypoxia⁸, 대상이 표현 라이브 설치류 뇌 조각 내에서 뿐만 아니라 쥐 해 마 Aβ 치료 따르는의 관찰 되었습니다 그리고 그들은 광고에서 본 시 냅 스 기능 장애에 기여할 수 그리고 선입니다. 여기 우리는 시간 코스와 다른 바이러스에 의해 도입 된 표현된 exogenous 공상 형광 단백질의 조각 내에서 분산을 관찰 하는 것이 새로운 자란 메서드를 사용 합니다. 우리는 다음 cofilin 막대 및 수용 성 Aβ 올리고 (Aβ_o)와 치료에 대 한 응답에서 hippocampal 조각에 집계 병리학의 발전에 따라 cofilin 기자 구문의 신경 특정 식을 이용 한다.

Protocol

동물 사용 동물 관리 및 사용 지침의 콜로라도 주립 대학에 승인 된 사육 및 동물 사용 프로토콜 준수는 다음과 같습니다.

참고: 프로토콜 아래 장기 인큐베이션 및 hippocampal 조각의 간헐적인 이미징에 대 한 준비 및 문화 메서드를 설명합니다. 단일 hippocampal 슬라이스 플라즈마 응고를 사용 하 여 특별히 준비 photoetched coverslip에 연결 하 고 롤러 인큐베이터에서 유지 됩니다 교 련된 아웃 롤러 튜브의 평평한 면에는 coverslips는 봉인 하는 다음. 플라즈마 혈전 형광 단백질 표정 및 고해상도 이미징에 대 한 바이러스 감염 전에 plasmin로 해산 됩니다. 형광 신경 중요 한 염료 슬라이스 내의 뉴런을 이미지 하는 데 사용 됩니다.

1입니다. 준비 롤러 튜브 랙

1. 그림 1 에 표시 된 서식 파일을 사용 하 여 눈금 막대에 표시 된 크기에 인쇄. 손톱으로 펀치 구멍을 중심으로 하는 서식 파일에서 작은 구멍 (대형 충분히 좋은 포인트 마커).
2. 15 cm 조직 문화 접시 (공칭 지름 14 cm)의 바닥에 서식 파일을 설정 하 고 구멍의 위치를 표시 합니다. 두 번째 접시에 이것을 반복 합니다.
3. 드릴 비트 플라스틱에 사용 하기 위해 설계 된, 구멍 센터 접시의 가장자리에서 2.5 c m로 6 각형 배열 (4.8 cm 센터-에-센터)에 각 접시에 6 개의 1.5 cm 직경 구멍을 드릴. 3 개의 구멍 (직경에서 3 m m) 가장자리를 equidistantly 그림 1A와 같이 큰 구멍의 2 사이 12 m m 드릴.
4. 각 접시의 바닥으로, 서로 마주 장소는 2.5 인치 긴 기계 나사 (3/16 인치 직경) 두 번째 플랫 와셔 조각 뒤 작은 구멍 중 하나를 통해 플랫 와셔와 폴 리 에틸렌 튜브 (스페이서, 4.7 cm), 다른 플랫 와셔 두 번째 조직 문화 접시, 다른 플랫 와셔, 잠금 와셔 및 너트.
5. 1.4 다른 두 기계 나사, 및 모든 기계 나사 장소에 때까지 느슨하게 강화 단계를 반복 합니다. 그런 다음 안전 하 게 너트를 조입니다.
6. 마지막 롤러 튜브를 랙 하단 접시의 구멍에 밧줄 고리 (5/16 인치 두께, 5/8 인치 구멍 직경)을 작동 (그림 1B; 자리에 두 개의 튜브와 함께 표시). 고유 번호로 각 선반에는 스티커를 놓습니다.

2입니다. 롤러 튜브 및 Coverslips의 준비

1. 롤러 튜브에 구멍을 드릴링 지 그 만들기
   1. 1.5 c m 구멍 8 cm 깊은 같은 각도에서 5.5 인치 나무 블록 x 4 x 2의 센터 측에 블록 삽입과 거의 평행한 것 롤러의 편평한 측 지 튜브 (그림 2A).
   2. 둥근 나무 파일을 사용 하 여 확대와 테이퍼 튜브 삽입을 허용 하도록 구멍을 구멍을 확대 (롤러 튜브는 모자 끝 직경에서 경미하게 더 큰) (그림 2B).
   3. 1.5 cm 직경 수직 구멍, 블록의 측면에서 5.5 cm 그리고 가운데 옆 구멍 (그림 2C)에.
   4. 측면 구멍은 충분히 테이퍼는 때 슬라이스에 대 한 구멍 센터를 위치 튜브 표시 된 자리를 중심으로 1.5 c m 세로 구멍에 원하는 자리에 표시 된 롤러 튜브를 삽입 합니다.
   5. 튜브를 제거 하 고 튜브의 끝에 자리에서 거리를 측정 한다. 이 거리는 지 그에서 구멍의 센터에서 표시 하 고 올바르게 위치 ( 그림 2C화살표) 드릴링에 대 한 튜브를 중지를 제공 하는 네일 삽입.
   6. 쇠 톱을 사용 하 여 부상을 방지 하기 위해 나무 블록의 표면으로 플러시 못 잘라.
   7. 경우 슬롯 수에 그것을 허용 하는 드릴 프레스 고정 (그림 2D 검은 화살표)는 지 그의 하단에 스프링 클립을 추가 합니다. 그렇지 않으면, C-클램프를 사용 하 여 드릴 프레스에 안전 하 게 지 그를.
2. 지 그를 사용 하 여 개최 하 고 위치 (그림 2A)까지 편평한 측으로 평면 양면된 11 cm 플라스틱 문화 관 6 m m 직경 구멍 바닥에서 1.0 cm 센터 위에서 설명한 고 튜브의 측면 사이 중심.
   참고: 플라스틱을 위한 드릴 비트는 사용 되어야 한다.
3. 회전 시키는 버 제거 도구 (그림 2E) 구멍의 가장자리를 매끄럽게 그리고 4 홈 안쪽에 구멍의 가장자리 (그림 2E, 삽입) 회전 하는 동안 구멍의 배출 촉진을.
4. 12 m m 구멍 펀치, 12 mm 직경 디스크 비 독성 이중 양면된 접착 실리콘 고무 시트에서를 잘라. 사용 공식 로고는 한 구멍 종이 펀치 (6 m m 직경)를 표준으로 보호 되어, 각 디스크의 중심에 구멍을 만들.
5. 뚫고 튜브 70% 에탄올을 린스, 공기 건조 그들 생물 안전 캐비닛, 튜브 및 생물 안전 캐비닛에 UV 램프 (30 70 cm 평균 거리에서)에서 40 분 대 한 천공된 접착제 디스크 소독.
6. 위치를 변경할 튜브 및 디스크 20 분 후에 모든 노출된 표면 살 균 된다. 무 균 조건 하에서 껍질을 화이트 접착제 디스크에서 백업 하 고 실리콘 고무 튜브, 구멍 (그림 2F) 정렬의 외부에 부착.
   주의: 자외선에 노출을 피하기 위해, 눈 보호를 착용 하 고 UV 램프를 켜기 전에 캐비닛을 닫습니다.
7. 12 m m 직경 photoetched (100 센터 번호가 1 m m 사각) 독일 유리 coverslips 청소. 집게와는 coverslips를 부드럽게 잡고 절대 에탄올, 물, 다시, 절대 에탄올 뒤 뒤에서 찍어와 마지막으로 에탄올을 구울 화 염에 coverslips을 찍어. Coverslips 냉각 허용 합니다.
8. 집게는 coverslips 개최, 아세톤에 2 %3-aminopropyltriethoxysilane로 10 미 린스 초순와 coverslips와 건조 공기를 허용.
9. 캐비닛 생물학 안전 내부 살 균 필터 종이에 coverslips를 설정 하 고 UV 빛 켭니다. 20 분 동안 coverslips의 각 측면을 노출 합니다.
   주의: 자외선에 노출을 피하기 위해, 눈 보호를 착용 하 고 UV 램프를 켜기 전에 캐비닛을 닫습니다.

3. hippocampal 슬라이스 준비

1. 해 부를 시작 하기 전에 조직 헬기에 대 한 양 날 면도날의 반쪽을 준비 합니다. 블레이드를 신중 하 게 손가락으로 세로로 접어 하 고 절반에 스냅.
2. 절대 에타 놀에서 rinsing 하 여 다음, 그들을 청소 하 고 건조 공기를 면봉을 사용 하 여 아세톤과 블레이드 반쪽 린스.

조직 헬기에 반 블레이드를 장착 하기 전에 70% 에탄올으로 헹 궈 서 소독.

따라 프로토콜 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회; isoflurane 마 취 후 잘린에 의해 4-7 일 오래 된 마우스 또는 쥐 강아지를 안락사 하 고가 위 또는 단두대와 머리를 제거 합니다.
참고: 뇌 조각 문화 프로토콜 마우스 또는 쥐 긴장 또는 유전자 형의 독립적입니다. 서로 다른 유전적 배경 가진 많은 유전자 변형 마우스 라인 사용 되었습니다.

70% 에탄올으로 머리를 헹 구 고 60 mm 페 트리 접시에. 롤러 튜브에 두뇌 슬라이스의 마지막 장착까지 다음 단계를 모두 불 임을 유지 하기 위해 층 류 후드에서 수행 됩니다.

#21 외과 블레이드를 사용 하 여, 피부 및 두개골을 통해 화살 컷을 확인 합니다. #5 Dumont 집게와 껍질 다시 피부와 두개골은 뇌를 노출 합니다.

닫힌된 집게와 부드럽게 애타게 전체 뇌 밖으로 소 뇌의 뒤에 두뇌 줄기를 통해 포 셉으로 곤란 하 게 하 여 그것을 공개. 4 ° C Gey의 균형 소금 Solution/0.5% 포도 당 (GBSS/포도 당)을 포함 하는 살 균 60 mm 접시에는 뇌를 놓습니다.

시각화 (그림 3A) 뇌를 해 부 현미경을 사용 하 여, 뇌 등 쪽을 놓고 잘라 앞 3 분 뇌와 소 뇌의 외과 블레이드 (그림 3B).

1. 집게, 안정성에 대 한 페 트리 접시의 측면에 대 한 트림된 두뇌 후부 쪽과 복 부 측 붙. 부드럽게 화살 중간 주위 멀리 meninges 애타게 고 midbrain 조직 잘 흘린된 뒤 몽 #5 집게 (그림 3C, 점선된 원)를 사용 하 여 제거 합니다.
2. 그것은 오픈 (그림 3C, 파선)을 전파 하는 두뇌의 측면을 따라 두 컷을 확인 합니다. 뇌 아래 등 쪽 측 및 확산 오픈 배치는, 일단 hippocampal 균열 표시 되어야 합니다 (그림 3D, 화살표).
3. Polychlorotrifluoroethylene 플라스틱 필름 조각에 확산 오픈 두뇌를 전송 하 고 조직 헬기의 단계에 부 러 뜨 리 위치. GBSS/포도 당 블레이드 습식 및 해 마 ~ 300 µ m 두꺼운 조각으로 잘라.
4. 전송 피 펫와 함께 GBSS/포도 당 (그림 3E)을 포함 하는 신선한 60 mm 접시에 플라스틱 필름에서 슬라이스 뇌를 플러시. 부드럽게 떨어져 꼬 집 고 잘 밀고 집게, 나머지 meninges와 다른 비 hippocampal 조직 (그림 3F) (그림 3G, H) 조각에서 멀리, 애타게.

4. 도금 조각

1. 조각을 받은 후 준비 coverslip photoetched 측면의 중앙에 닭 플라즈마의 2 µ L를 놓습니다. 약간 자리를 달성 한 3-4 m m 직경 플라즈마 확산.
   참고: photoetched 측면 coverslip 숫자는 방향이 올바르게 되도록 해 부 현미경을 통해 볼 때의 최고의 측면이 이다.
2. 1 뇌 조각 살 균 좁은 팁 주걱(그림 4)와 플라즈마 자리 (그림 4B) 전송. 닫힌된 집게를 사용 하 여 GBSS/포도 당에서 슬라이스를 해제 하는 동안 주걱 끝에 슬라이스를 유지.
3. 닫힌된 집게와는 coverslip에 자리 플라즈마 주걱 터치는 coverslip에 슬라이스를 밀어.
4. 믹스 2.5 µ L의 플라즈마와 별도 튜브에 트 롬 빈의 2.5 µ L. 신속 하 게 부드럽게 그것은 (그림 4B)를 혼합 하 고 슬라이스를 위아래로 피펫으로 주변이 혼합물의 2.5 µ L를 배치 합니다.
   참고: 플라스마는 응고 10-15 s 내 그래서이 신속 하 게 이루어져야 합니다. 조각을 접착 문제가 경우 5 µ L 트 롬 빈으로 5 µ L 플라즈마를 혼합 하 고 4-5 µ L를 사용 하 여 조각, 일부는 슬라이스는 coverslip에 평평 거짓말을 혼합 후 제거에.
5. 이전 롤러 튜브에 부착 된 실리콘 고무 접착제의 노출 된 측면에서 다루는 투명 한 플라스틱을 제거 하 고 구멍 (그림 4C) 내에서 분할 영역을 정렬 하는 접착제에 두뇌 슬라이스 coverslip 장소.
6. 접착 되도록 하는 coverslip 아래로 균등 하 게 누르고 그것은 약 1 분 동안 생물 안전 캐비닛에 그것을 전송 하는 동안 엄지 coverslip 심지어 압력 소프트, 적용 됩니다.
7. 생물 안전 캐비닛, 각 관 (그림 4D)를 완전 한 Neurobasal A 문화 매체 (자료 테이블)의 0.8 mL를 추가 합니다.
8. 클램프에 의해 안전 하 게 개최 살 균 면 연결 파스퇴르 피펫으로 통해 5% CO₂/95% 공기 혼합물의 흐름. 가스 혼합물으로 롤러 튜브를 플러시 하 고 빠르게 피펫으로 주위에서 철회로 튜브를 캡.
9. 슬라이스 번호와 튜브 라벨 그리고 수를 랙. 그들은 기하학적으로 균형 보장 롤러 선반에 튜브를 삽입 합니다. 튜브의 홀수가 있는 경우에, 균형을 튜브를 추가 합니다.
10. 롤러에 대 한 롤러 선반에 선회와 35 ° C 롤러 인큐베이터에서 랙에 배치 10-13 RPH (그림 4E). 튜브의 하단에 있는 매체를 유지, 기울기는 인큐베이터의 전면 보드에 올려서 약 5 °를 다시.
11. 슬라이스 및 관찰 날짜의 모든 정보를 기록 하는 데 사용 되는 스프레드시트에 조각과 관을 입력 합니다.
12. 에 약 문화, 하루 6 각 관에 활성 plasmin의 1 µ L (0.002 U) 추가.
13. 혈전을 완전히 분해 후 (일반적으로 몇 시간), 매체를 제거 하 고 plasmin 없이 신선한 매체. 필요한 경우 슬라이스를 plasmin 하룻밤 incubated 수 그리고 매체 변경 다음 날.
14. 슬라이스는 일반적으로 실험에서 사용 하기 전에 적어도 7-10 일 동안 알을 품을. 중간 발음 하 고 당일 3 또는 4 일 7, 그리고 모든 7 일 그 후에 다시 합니다.

5. 대비 바이러스 성 벡터의 Transgene 식

참고: 슬라이스 문화의 뉴런에서 transgenes 표현의 이루어집니다 유전자 조작된 설치류에서 두뇌를 사용 하 여 나는 transgene를 도입 하 여 재조합 복제 결핍 바이러스 감염에 의해.Adenoviruses (AV), adeno 관련 바이러스 (AAV), 및 재조합 lentivirus 벡터 모두 사용 되었습니다 우리의 hippocampal 슬라이스 문화에 뇌 조각에 다른 형광 단백질 키메라의 표현에 대 한.

1. 복제 방법 관심의 RNA를 표현 하기 위한 결핍 AV 설명 되어^13,14준비. Titer 바이러스 감염 U/ml로 virally 표현한 단백질에 항 체를 사용 하 여 직렬 희석 방법에 의해 설명 된¹⁴. Cofilin 집계와 cofilin-걸 막대 형성을 관찰, cofilin-R21Q-mRFP cDNA (플라스 미드 #51279)¹⁶을 사용 합니다.
   참고: synapsin 1 발기인 세포 발기인은 많은 세포 유형¹³높은 식 레벨을 운전 하는 데 유용 하는 반면에 신경 특정 식¹⁵, 탁월한 선택입니다.
2. AAV 여 준비 전송의 공동 transfection 관심사의 유전자를 포함 하는 플라스 미드와는 담당자/모자 플라스 미드, 도우미 플라스 미드의 유무에 관계 없이 앞에서 설명한^17,18바이러스 E1 유전자 공급 HEK293 포장 세포로.
   참고: 재조합 형 AAV 또한 호스트 세포 게놈¹⁹에 타겟된 삽입을 위해 만들 수 있습니다. 전송 플라스 미드에 대 한 우리는 C 터미널 mRFP1 형광 단백질 태그 (플라스 미드 #50856)는 synapsin 발기인 포함 된 AAV 플라스 미드 하류 칼슘 센서 GCaMP5G²⁰로 복제 인간 cofilin 1를 사용 합니다. 인코딩 P2A 자체 cleaving 펩 티 드 순서 DNA의 피스는 GCaMP5G와 cofilin-RFP PCR 단일 AAV 사본²¹에서 두 단백질의 식을 제공 하는 전송 플라스 미드의 준비 동안에 삽입 됩니다.
3. 전송 플라스 미드 유전자 또는 cDNA의 관심 및 통합 신호를 분할 바이러스 성 개 그, 폴, 레 브, 및에 vsv g 유전자 혼합 포장 3 세대 lentivirus 포함의 공동 transfection에 의해 재조합 lentivirus 벡터를 준비 3 별도 플라스 미드^22,23.
4. 전송 플라스 미드를 사용 하 여 복제 시스템²⁴ 번 pLKO.1-GFP (플라스 미드 #30323), synapsin 발기인와 cofilin-R21Q-mRFP는 hPGK 교체로 synapsin 발기인 및 (에서 플라스 미드 #51279) cofilin-R21Q-mRFP cDNA를 조립 발기인 및 GFP cDNA, 각각.
5. 앞에서 설명한²³으로 인산 칼슘에 의해 HEK293T 세포로 최종 플라스 미드 transfect.
6. 4 10 cm에서에서 매체를 수집, 500 µ L 150 K 구분 원심 집중 장치를 사용 하 여에 집중 하 고 빠른 액체 질소에서 동결 후 작은 aliquots에-80 ° C에서 최종 lentivirus를 저장. 세포를 감염에 대 한 aliquot 한번만 녹여
7. 각 바이러스 유형의 볼륨 준비 표현의 다양 한 양의 바이러스 감염 후 transgenes는의 식을 따라 다른 슬라이스 문화의 숫자를 설정 하 여 원하는 학위를 달성 하기 위해 실험적으로 결정 합니다.
   참고: 일반적으로 바이러스의 1-10 µ L 슬라이스 당 사용 됩니다.

6. 슬라이스 치료

1. 바이러스 감염 조각
   1. 생물학 안전 장은 바이러스 벡터에 대 한 적절 한 생물 안전 수준 작업에 대 한 승인에서 working, 0.8 mL 전체 매체의 바이러스 (일반적으로 1-10 µ L)의 약 수 믹스.
   2. 표 백제를 포함 하는 컬렉션 함정 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 슬라이스에에서 중간 발음 보조 함정 첫 번째 함정 그리고 진공 근원 사이 항상 사용 됩니다.
   3. 위의 준비는 바이러스를 포함 하는 약 수와 함께이 매체를 대체, 랙, 문화 관을 반환 하 고 인큐베이터에 배치.
   4. 생물 안전 캐비닛에 바이러스 조각이 잠복기의 2-5 일 후 살 균 전송 피 펫과 바이러스 포함 된 매체를 제거 하 고 바이러스를 죽 일 승인 된 항 바이러스 대리인을 포함 하는 병으로 배치 합니다.
2. 중요 한 염료와 뉴런의 얼룩
   1. 준비 및 100 μ M의 농도에서 액체 질소에 aliquots의 빠른 냉동 4 µ L에 의해 형광 신경 중요 한 염료²⁵ 의 aliquots를 저장 하 고 이러한-20 ° c.에 저장 할 하지 동결/동결 해제는 염색 한 번 이상.
   2. 형광 현미경 검사 법에 의해 신경 시각화에 대 한 레이블, 신경 중요 한 염료에의 한 약 수를 녹여 및 완전 한 Neurobasal 매체에 4 mL에 희석 (최종 염료 농도 100 nM).
   3. 포부 (또는 매체 바이러스를 포함 하는 경우 전송 피 펫) 조각에서 매체를 제거 하 고 100 nM 신경 중요 한 염료를 포함 하는 매체의 0.8 mL와 함께 그것을 대체. 인큐베이터에서 롤러 장치에는 분할 영역을 반환 합니다.
   4. 잠복기 2 h에 대 한 조각, 후 염료를 포함 하는 매체를 발음 하 고 생물 안전 캐비닛에 신선한 완전 한 매체의 0.8 mL와 함께 그것을 대체 합니다.
      참고: 중요 한 염료와 조각에서 신경의 라벨 외피의 몇 시간을 필요 합니다. 첫 번째 이미지는 일반적으로 색소 치료 후 24 시간 촬영 한. 신경은 구체적으로 표시 하 고, 신경 영상 더 주고 2-3 일 동안 하락 배경 형광은. 중요 한 염료의 농도 72 h 후 거절합니다.
   5. 시간이 지남에 조각 형태에 변화를 따라 클럭이 슬라이스 7 일 마다.

7. 슬라이스 이미징

1. 거꾸로 현미경에 분할 영역을 봅니다. 밝은 형광 이미징, 이미징, 전에 24 h에 대 한 페 놀 레드 pH 지시자 없이 완전 한 Neurobasal A 매체와 문화 매체를 교환 합니다.
   참고: 여기에서 보고 된 실험에 대 한 조각 볼 수 있습니다 선형 인코딩된 갖춘 거꾸로 회전 디스크 공초점 형광 현미경에 x, y 단 피 z 제어 및 민감한 고해상도 디지털 카메라.
2. 튜브는 coverslip 수직으로 유지 하는 무대 어댑터 (그림 5B)에 배치 되는 주문 품 튜브 홀더그림 5(A)에 롤러 튜브 장치에서 이미지를 슬라이스 문화를 전송합니다 목표 고 긴 간격에 걸쳐 반복적인 이미징 세션 동안 동일한 방향에서 슬라이스를 유지.
3. 위치 (그림 5B)에 튜브를 튜브에 대 한 꽉 무대 어댑터에 슬라이더를 밀어.

난방 스트립 및 맞춤 단계 어댑터 (그림 5C)에 내장 된 체온 컨트롤러 사용 하 여 이미징 동안 슬라이스 35 ° C에 온도 유지 합니다.
참고: 튜브 홀더의 세부 단계 어댑터, 및 히터에 액세스할 수 있습니다: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.

낮은 전력을 사용 하 여 (예., 4 X) 객관적이 고 밝은 필드 transillumination photoetched 그리드 패턴 (그림 6A) 조각 아래에 초점. 초기 이미징 세션에 대 한 신속 하 게 찾아서 높은 확대 이미징이 요구 하는 다양 한 지역에 대 한 번호를 기록 하는 슬라이스 주위 스캔 (예를 들어, 뿔 ammonis (CA) 1, CA3가 이랑 (DG), 등).

관심 영역을 포함 하는 첫 번째 그리드 사각형을 스테이지를 이동 합니다. 어 목표 X 20로 전환 하 고 표준 마크를 찾습니다 (예., 에칭된 수의 팁) (그림 6B).

높은 전원 목표 (40 X 또는 60 X) 스위치, 표준 마크, 그리고 레코드 x와 무대의 y 위치를 지역화. 무대의 근처와 기록 표준 마크 (그림 6B, 화살표)에서 그들의 x 및 y 오프셋 필드를 찾아 이동 합니다. 원하는 경우 다른 그리드 영역에서 반복 합니다.
참고: 표준 마크에서이 상쇄 위치 수 조각 몇 군데 같은 coverslip 위치의 일관 된 지적 원래 x 표준 마크의 y 설정을 변경 하더라도 때 튜브 또는 단계 어댑터 제거 되 고 대체.

사용 가능한 경우 현미경 객관적인 제어 또는 압 전 단계 제어를 사용 하 여 각 선택한 필드 내에서 Z-스택 이미지를 캡처하십시오.
참고: 이미지 비행기 보통 0.5 µ m 크기와 이미지 기능 원하는 해상도 따라 2 µ m의 간격으로 얻어진 다. 이미지 기능 인수, 여러 비행기에 확장 하 고 그래서 작은 기능을 시각화, 작은 간격으로 하는 비행기 사이 요구 품질의 3D 이미지를 구축.

각 조각의 가능한 시간 이미징 총을 계속.
참고: 대부분의 이미징 세션 보고 여기 18 분/조각 아래에서 했다. 그러나, 우리가 일부 조각 10 또는 더 많은 시간, 그리고도로 몇 군데 있다 분할의 장기 생존에 명백한 해 없이 단일 세션에서 40 분으로.

Results

얼마나 정확 하 게 확인 하려면 표준 마크를 활용할 수 있는 시간이 지남에 같은 필드 내에서 동일한 셀을 이미지 복원, 하 우리 검사 photoetched coverslips (그림 6A)에 성장 하는 조각. 뉴런은 중요 한 염료와 염색 법에 의해 시각 (100 nM 2 h;에 대 한 비 신경 세포를 얼룩이 되지 않습니다)는 셀²⁵를 해치지 않고 시간이 지남에 따라 뉴런에서 사라집니다. 우리는 표준 식별 마크 단일 그리드 스퀘어 (그림 6A, B), 라벨, 후의 중요 한 염료-표시 24 h 지역 발견 기록 x 그리고 y 오프셋 위치 표준 마크 (그림 6의B)에서 수집, 4 연속적인...

Discussion

여기에 설명 된 롤러 튜브 메서드 장기 배양 및 슬라이스 뇌 조직의 고해상도 라이브 이미징에 대 한 수 있습니다. 장착 및 유지 보수의 조각에 슬라이스 기법으로 여기 적용 한 주요 문제가입니다. Coverslip 코팅 슬라이스 접착을 지 원하는 홍보 조각 조각;에서 셀의 마이그레이션 및 neurites의 파생물을 강화 하 여 숱이 따라서, 우리는이 기판의 사용을 피 했다. 3-aminopropyltriethoxysilane와 함께 처리 하 여 유리에 아미노 그룹의 삽입 향상 조각, 준수 하지만 coverslip에 너무 약간 또는 너무 많은 치킨 플라즈마 준수 문제를 슬라이스 잃게 발생할 수 있습니다. 적절 한 접착에 필요한 플라즈마의 볼륨 교양된 뇌 조각의 크기에 따라 이며 따라서 쥐 hippocampal 슬라이스는 약 4 배 더 큰 영역에 마우스 뇌 조각 보다 큽니다. 만약 너무 많은 플라즈마는 조각 아래에서 응고, 세포 접착 하는 coverslip 장애인 이며 plasmin 치료 위치를 변경 하거나 완전히 분리 되도록 분할을...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15cm 배양 접시의 바닥	VWR Scientific	25384-326
필립스 헤드 머신 스크류 (#10-32)	에이스 하드웨어		2.5" 길이와 3/16" 지름
플랫 와셔 #10	ACE 하드웨어
머신 스크류 너트 (#10-32)	ACE 하드웨어
고무 그로밋	ACE 하드웨어		5/16", 두께; 5/8", 구멍 직경; 1.125", OD
폴리에틸렌 튜빙 (5/16"; OD, 3/16"; ID)	ACE 하드웨어		1.8" 길이로 절단
잠금 와셔 #10	ACE 하드웨어
드릴 프레스, 5 속도	Ace Hardware	ProTech 모델 1201
Nunclon Delta 평면 튜브	VWR	62407-076
드릴 비트, 3 mm, 6 mm 및 15 mm	Ace Hardware	Diablo freud 브랜드	플라스틱 절단용 드릴 비트.
목재용 드릴 비트, 1.5cm 및 1mm	Ace Hardware
Wood file, 1/4" 원형	Ace Harware
스프링 클립, 16mm 스냅 홀더	Ace Hardware
스위블 헤드 디버링 도구, 5"	Ace Hardware	26307
접착 실리콘 시트(보안 씰)	Grace Bio-Labs	666581	0.5mm 두께
6mm 홀 펀치	Office 최대
12mm 홀 펀치	thepunchbunch.com
70% 에탄올
포토테크 커버 슬립, 직경 12mm	Bellco Glass, Inc.	1916-91012
분젠 버너
앱솔루트 에탄올
나노 순수
3-아미노프로필트리에톡실란	시그마-알드리치	A3648
아세톤	시그마-알드리치	179124
#5 듀몬트 집게	파인 사이언스 도구	11251-30
McIlwain 조직 헬기	Ted Pella, Inc.	10180
더블 엣지 면도날	테드 펠라	121-6
Whatman 여과지	VWR	28450-182	직경 5.8cm 원으로 절단
폴리-클로로-트리플루오로-에틸렌 (Aclar)	Ted Pella, Inc.	10501-10	5.8 cm 직경의 원으로 절단
#21 수술용 칼날	VWR Scientific	25860-144
#5 Dumont 펜치	파인 사이언스 도구	11251-30
주걱, 스테인레스 끝이 테이퍼된	VWR	82027-518
Gey's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	G9779
Glucose	ThermoFisher Scientific	15023-021	25% (w/v) 용액, 0.2mm 필터 멸균
닭 플라즈마	Cocalico Biologicals	30-0300-5L	멸균수, 2500 x g에서 원심분리기, 4°C에서 30분 재수화; C, 액체 질소에 있는 급속 동결 분취액 및 저장  -80 °C.
트롬빈, 국소 (소)	화이자	트롬빈-JMI	급속 동결 분취액을 액체 질소에 1,000 국제 단위/mL로 희석액으로 제공하고 -80°C에서 보관합니다. 250 units/mL에서 사용합니다.
Cell Roller System	Bellco Biotech	SciERA
롤러 인큐베이터	Forma	Model 3956
N21-MAX	ThermoFisher Scientific	AR008
Pen/Strep (100X)	ThermoFisher Scientific	15140122
200 mM Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081
Glucose	ThermoFisher Scientific	15023-021	25% (w/v) 용액, 0.2 mm 필터 멸균
Neurobasal A	ThermoFisher Scientific	10888-022	완전한 배지: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM 글루타민, 0.180 mL 25% 포도당, 0.250 mL 100x 펜/스트렙.
3세대 렌티바이러스 패키징	Life Technologies	K4975-00
159 K 컷오프 원심분리 필터 (Centricon)	EMD Millipore
렌티바이러스 클로닝 시스템 (InFusion)	Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279	Addgene
Neuronal cell viability dye (NeuO)	Stemcell technologies	1801	한 번 해동하고 4 µ에서 급속 동결; L 부분 표본. -20 °에서 보관하십시오. C
도립 현미경	Olympus	IX83
현미경 대물렌즈	올림푸	공기: 4X, 20; 오일: 40X, 60X,
회전 디스크 컨포칼 시스템	Yokagawa	CSU22
현미경 EMCCD 카메라	광도	캐스케이드 II
선형 인코딩(x,y), 피에조 z 플랫 탑 스테이지	ASI
현미경 레이저 및 통합	Intelligent Imaging Innovations
HEK293T 세포	American Type Culture Collection	CRL-3216
Human Plasmin	Sigma Aldrich	P1867	0.002 U/mL in 0.1% 소 혈청 알부민(0.2mm 필터 멸균), 액체 질소에서 급속 동결 및 -80°C에서 보관.