이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.
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이 논문에서
요약
초록
분자 유전자 연구에 대 한 강력한 도구, 인 애기 thaliana 식물 생물학으로 하 고, 특히, 식물 생식 생물학에서에서 가장 눈에 띄는 모델 종 중 하나입니다. 그러나, 식물 형태학, 해부학, 그리고 ultrastructural 분석 전통적으로 포함 포함 시간과 절차 밝은 필드, 스캐닝, 및 전자 현미경 단면. 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 현미경 분석, 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 분자 기술의 지속적인 세련미에 최근 진행 상황에 대 한 수요 증가를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 개발. 이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 기본 기술, 청소를 제대로 해 부에 대 한 기술 설명 그리고 일부 얼룩 절차 전체-마운트의 생식 구조 관찰.
서론
꽃은 가장 중요 한 중 장기 적의 정의. 꽃 식물 몇 백만 90-130 년 전에 나타나1, 너무 빨리 그들의 급속 한 외관 찰스 다윈2"지독한 미스터리"로 기술 되었다 다양 하 고. 꽃 개발에 대 한 식물 연구자의 관심사는 다양 하다. 일부 연구는 전체, 또는 꽃3,,45,6의 특정 해 부, 구조, 및 기능 속성의 진화로 이해 하는 꽃의 진화 근원에 집중 . 그들에 의존 하는 성적 및 성적 재생산의 모드 뿐만 아니라 꽃 형태와 구조, 높은 변형 꽃 매우 복잡 한 구조를 확인 합니다. 유전 및 분자 조사7과 결합 될 수 있는 빛과 전자 현미경 기술을 사용 하 여 꽃 기관의 해부학 및 구조적 기능을 특성화 하기 위해 다양 한 노력을 주도하 고 있다. 또한, 과일과 씨앗, 소스 꽃은 인간과 동물 영양에 대 한 파라마운트 중요성의 이다. 따라서, 꽃 및 과일 개발의 특성화는 늘어나는 인구와 생태 보존 전략 변화 환경
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프로토콜
1. 꽃과 Silique 고정
- 수확 꽃과 식물에서 siliques 첫 번째 꽃의 개통에 동기화.
참고: 여기에 사용 된 실험 조건에서 식물 시작 重와 Skoog (MS)에서 토양에 이식 후 약 21 일 꽃. 씨앗은 4 ° C에서 3-4 일에 대 한 층 화와 출 아 했다/성장 22 ° C/16 h 빛과 18 ° C/8 h에서 MS 접시에 어두운 (그림 1) 동일한 조건 하에서 보관 하는 냄비에 영양분이 풍부한 토양에 묘 종을 이식 하기 전에 8 ~ 10 일 동안. 복제의 수는 특정 연구 목적에 따라 달라 집니다 하지만 각 치료에 대 한 (5 개별 공장)에서 5 inflorescences의 최소 권장 합니다. 꽃은 실험 단위, 복제 당 10 꽃의 최소 권장 합니다. - Inflorescences 또는 꽃 (그림 1E-H) 작은 위 (예를 들어, 손톱이 위)를 사용 하 여 자르고 (단일 화 서/꽃 고정)을 위한 microcentrifuge 튜브 또는 (대 한 집단 fixations) 원뿔 튜브에 즉시 배치 Carnoy의, 메탄올/아세트산, 또는 FPA50 fixatives 만든 갓 포함 하는 응용 프로그램에 ....
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결과
애기 는 corymb (그림 1)에서 배열 하는 양성 꽃 inflorescences 베어링 Brassicacea 가족에 속한다. 각 꽃에는 4 개의 sepals, 4 개의 꽃잎, 6 예 (4 개의 길고 2 개의 짧은), 및 4 개의 동심 whorls25,26에 배열 두 선천적인 융합된 carpels (그림 1 층-H)로 구성 된 syncarpous gynoecium는 있다. 애기 는 tenuinucellate, anatropous ovules 난소 (45-80 ovules의 합계)의 2 개의 locules의 각 내에서 두 개의 행 (각 행의 ovules 12-20)에 정수 리 placentation에.......
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토론
애기, 모든 꽃 발달 단계에 걸친의 단일 화 서 내의 많은 꽃 봉 오리의 존재 연구 효과 치료의 발달 기능을 특성화 하기 위한 독특한 기회를 제공 꽃 발달의 다른 단계 걸쳐 동시에. 다른 개별 공장 사이 좋은 기준점은 주 화 서의 첫 번째 꽃의 개통. 식물 꽃 동기화 하는 방식으로 처리 됩니다 만큼 가능한 (예를 들어, 4 ° C에서 층 리 동기 씨 발 아 및 따라서 꽃도 더 극대화 하는 3-4 일), 그리고 그들의 첫 번째 꽃 같은 날에 열리는 식물만 치료 사이의 복제; 배포 하는 일괄 처리로 찍은 계속 되는 일에 준비 일괄 처리 실험을 복제를 사용할 수 있습니다. 다음이 절차, 더 강력한 비교 분석, 시간과 사이 식물, 환경과 발달 변화에 대 한 제어를 수행할 수 있습니다.
최근에 대 한 보고 우리가 클래식 개간 솔루션에 비해 허가 샘플에 대비를 향상 시킬 뿐만 아니라 꽃과 배아 개발 하는 동안 전 분 역학 하 이블의 개간 솔루션과 Lugol의.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 취리히 대학, IEF 마리 퀴리 그랜트에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. 아에 TransEpigen-254797), 유럽 연구 위원회의 고급 부여 (부여 없음. U.G.를 MEDEA-250358), 그리고 SystemsX.ch, 시스템 생물학에서 스위스 이니셔티브에서에서 연구 및 기술 개발 프로젝트 (그랜트 U.G.에 MecanX).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 및 재료 | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% 분자 생물학 등급 |
| 빙하 아세트산 | Sigma-Aldrich | 320099 | 분자 생물학 등급 |
| 메탄올 | Scharlau | ME03062500 | |
| 포름 알데히드 용액 | : Sigma-Aldrich | F1635 | |
| 프로피온산 | : Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| 클로랄 수화물 | : Sigma-Aldrich | 15307 | |
| 글리세롤 | Roth | : 3783.1 | |
| 아라비아 고무 | Fluka | 51198 | |
| 젖산 | Fluka | 69773 | |
| 페놀 | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | 우리는 액체 페놀이 사용했습니다 (밀도를 사용하여 솔루션에 필요한 부피를 찾으십시오) |
| 클로브 오일 | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| 요오 | 플루카 | 57665 | |
| 요오드화 칼륨 | Merck | 5043 | |
| 공작석 그린 | 플루카 | 63160 | |
| 푹신 산 | 플루카 | 84600 | |
| 오렌지 G | 시그마 | 7252 | |
| 나트륨 도데 실 설페이 | 시그마 - 알드리치 | L3771 | 분자 생물학 학년 |
| 수산화 나트륨 | 시그마 - 알드리치 | 71690 | |
| 인산이 수소 나트륨 | Applichem | A1047,1000 | |
| 인산 나트륨 이염 기성 | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| 인산칼 | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | 형광 증백제 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 독성 |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| 아닐린 블루 | Merck | 1275 | |
| MS 미디엄 | Carolina | 19-57030 | |
| 영양이 풍부한 기질 | Einheitserde | ED73 | |
| 시계 메이커 유리 | 특정 브랜드 없음 | ||
| 15ml 팔콘 원심 분리기 튜브 | VWR | 62406-200 | |
| Dumond 집게 | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| 겸자 | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| 주사기 | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| 준비 바늘 | BD | BD Microlance 304000 | |
| 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | 10143562CE | 절단 모서리 |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| 습한 상자 | : 젖은 종이 타월과 슬라이드 지지대가있는 플라스틱 상자 | ||
| < 강한> 이름 < / 강한> | < 강한> 회사 < / 강한> < | 강한> 카탈로그 번호 < / 강한> | < 강한>코멘트 < / 강한> |
| < 강한> 솔루션 < / 강>< | |||
| 강> 고정제< / 강한> | |||
| Carnoy's (Farmer's) 고정액 | 절대 에탄올 : 빙초산, 3:1 (ml:ml) | ||
| 메탄올/아세트산 고착제 | 50 % (v/v) 메탄올, 10 % (v/v) 빙초산 탈이온수 | ||
| FPA50 고정액 | 포르말린, 프로피온산, 50% 에탄올; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| <강>투명화 용액 | |||
| 클로랄 하이드레이트/글리세롤 | 클로랄 하이드레이트 : 글리세롤 : 물, 8:1:2 (g:ml:ml). 모든 꽃 발달 단계와 DIC 현미경을 통한 실리크 발달에 사용할 수 있습니다. 가장 좋은 정착제는 포르말린 기반 FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5g, 클로랄 수화물 100g, 글리세롤 5ml, 물 30ml입니다. 모든 꽃 발달 단계와 DIC 현미경을 통한 실리크 발달에 사용할 수 있습니다. 가장 좋은 정착제는 포르말린 기반 FPA50 | ||
| Herr's 4½ 투명액 | 젖산, 염소 수화물, 페놀 결정, 정향 오일, 자일렌, 2:2:2:2:1, 중량으로. 모든 꽃 발달 단계(특히 수술 발달)와 DIC 현미경을 통한 실리크 발달에 사용할 수 있습니다. 가장 좋은 정착제는 포르말린 기반 FPA50 | ||
| SDS/NaOH 용액 | , SDS 및 NaOH 원액을 1% SDS/0.2N NaOH(10배 희석)로 혼합 희석합니다. 꽃과 규질의 발달 단계의 모든 단계에. 가장 좋은 정착제는 메탄/아세트산 정착제입니다. 다른 두 정착제도 사용할 수 있습니다. calcofluor, auramine, DAPI 및 아닐린 블루 염색 용액과 결합할 수 있습니다. | ||
| SDS 원액 | 10 % (w / v) 도데 실 황산나트륨. 10g의 도데실황산나트륨을 80ml의 탈이온수에 녹이고 탈이온수로 최대 100ml를 만듭니다. | ||
| NaOH 원액 | 2 N NaOH 용액 : 40ml의 탈 이온수에 NaOH 4g을 용해시키고 탈 이온수로 최대 100 ml를 만듭니다 | ||
| Combined clearing and staining solution< / strong> | |||
| Herr의 IKI-4 ½ | 표준 4½ (총 9g) 추가 : 요오드 100mg, 요오드화 칼륨 500mg. 이 세척 용액은 모든 꽃 발달 단계와 실리크 발달에 사용할 수 있으며, 대비를 높이거나 전분 역학을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 구조 분석에는 FPA50을 사용하고 정량적 전분 분석에는 Carnoy의 정착제를 사용합니다. | ||
| 알렉산더 염색 | 에탄올 95% 10ml, 공작석 녹색(95% EtOH 중 1%) 1ml, 푹신산(ddH2O 중 1%) 5ml, 오렌지 G(ddH2O 중 1%) 0.5ml, 페놀 5g, 클로랄 수화물 5g, 빙초 아세트산 2ml, 글리세롤 25ml . 이 투명화/염색은 단독으로 또는 Herr's 4½와 함께 사용됩니다. 용액은 성숙한 꽃가루 알갱이와 삼세포 꽃가루 알갱이가 있는 꽃의 꽃가루 중단을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 갓 갓 만든 고정되지 않은 재료에 사용됩니다. | ||
| <강>염색 용액 | |||
| 칼슘플루오르 용액 | Calcofluor 0.007% (g:ml). 원래는 광학 브라이트너로 사용되었습니다. 세포벽의 셀룰로오스, 카르복실화 다당류 및 칼로스를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 꽃가루 알갱이의 내부를 염색하는 데 자주 사용됩니다. 세 가지 정착제를 모두 이 용액과 함께 사용할 수 있습니다. | ||
| 오라민 용액 | 오라민 0.01% (g:ml). 이 친유성 형광 염료는 큐티클, 큐틴, 엑신 등을 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 세 가지 고정제 모두 | ||
| Calcofluor-Auramine 혼합물 | : Calcofluor 용액, 3 : 1. 두 용액에 의한 결합 염색에 사용할 수 있습니다. 다른 비율은 auramine에 관하여 calcofluor의 더 작은 비율을 유지하는 분석될 수 있습니다. | ||
| DAPI 용액 | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7), 0.1% 트리톤-X-100, 1 mM EDTA. 이 용액은 남성과 여성의 감수 분열 중 염색체 확산과 모든 조직의 세포핵을 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 꽃가루 입자 발달을 연구하는 데 자주 사용됩니다. Carnoy's와 메탄올/아세트산은 이 솔루션에 가장 적합한 정착제입니다. FPA50과 같은 포름알데히드 기반 고정제는 염색을 방해할 수 있습니다. UV의 여기 및 약 461nm의 최대 방출. | ||
| 인산나트륨 완충액 (0.1 M) | 양성자 수용체 : 0.2 M Na2HPO4, 양성자 공여자 : 0.2 M NaH2PO4, 비율 양성자 공여체 / 양성자 수용체 : 1.364 (pH 7의 경우) | ||
| 아닐린 블루 용액 | 0.1 % (w / v) 아닐린 블루, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2 % 글리세롤. 이 용액은 여러 발달 단계의 칼로스 및 셀룰로오스를 염색하는 데 사용할 수 있습니다 (예 : 남성 및 여성 terad의 callose 침착, 꽃가루 튜브의 callose plugs). UV의 여기와 약 455의 최대 방출. 또한 세포 함량 염색을 위해 빨간색으로 방출되는 514nm에서 여기될 수 있습니다. |
참고문헌
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z.
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재인쇄 및 허가
