방법 논문

추출 및 카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 그들의 대사 산물의 고압 액체 크로마토그래피로 분석 하는 편리한 방법

DOI:

10.3791/56445

⸱

2018년 3월 1일

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

선물이 3 monoamine 신경 전달 물질의 동시 결정 하 고 두 유아 소변에 그들의 대사 산물의 전기 화학 검출 (ECD) 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 결합 하 여 편리한 고체 상 추출. 우리 또한 유아에 대 한 뇌 손상의 조기 진단에 대 한 잠재적인 biomarker로 대사 산물 MHPG를 식별합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

추출 및 생물 학적 체액에서 카 테 콜 아민 신경 전달 물질의 분석은 신 경계 기능 및 관련된 질환 평가에 매우 중요 하지만 그들의 정확한 측정은 여전히 도전 이다. 많은 프로토콜 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 포함 하 여 악기의 다양 한 신경 전달 물질 측정에 대 한 설명 했습니다. 그러나, 단점, 복잡 한 작업 또는 감지 하드는 피할 수 없는 여러 대상 이며 현재, 지배적인 분석 기술은 여전히 HPLC로 인해 민감한 전기 또는 fluorimetric 탐지와 결합 그것의 높은 감도 그리고 좋은 선택입니다. 여기, 상세한 프로토콜에서에서 설명 하는 전처리 및 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD) 고압 액체 크로마토그래피와 catecholamines의 검출을 위한 electrospun 복합 nanofibers 구성을 사용 하 여 유아의 실제 소변 샘플 폴리스 티 렌으로 adsorbent와 고분자 크라운 에테르의 포장 섬유 고체 상 추출 (PFSPE) 메서드 라고도합니다. 우리는 소변 샘플을 쉽게 nanofiber 포장 단단한 단계의 열을 어떻게 샘플에서 analytes는 빠르게 농축 될 수 있다, precleaned 수 있습니다 desorbed, 방법과 ECD 시스템에서 발견을 보여줍니다. PFSPE 감소 시간, 비용, 목표의 손실의 감소에 대 한 수 있도록 생물 학적 샘플에 대 한 전처리 절차를 크게 간소화 합니다.

전반적으로,이 작품에서는 세 monoamine 신경 전달 물질 (노르 (NE), (E) 피 네 프 린, 도파민 (DA))의 동시 결정 하 고 두 개의 HPLC ECD 시스템에 결합 하는 고체 상 추출에 대 한 간단 하 고 편리한 프로토콜 그들의 대사 산물 (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) 및 3, 4-dihydroxy-phenylacetic 산 (DOPAC)) 유아의 소변에서. 설립된 프로토콜 요도 catecholamines의 차이 주 뇌 손상 위험이 높은 유아와 건강 한 컨트롤 사이의 그들의 대사 산물을 평가 하기 위해 적용 되었습니다. 비교 분석으로 카 테 콜 아민 대사 산물의 경우 유아의 뇌 손상에 대 한 위험이 조기 진단 위한 중요 한 후보 마커를 있을 수 있습니다 나타내는 두 그룹 사이의 요도 MHPG에 상당한 차이가 나타났다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

카 테 콜 아민 신경 전달 물질과 체액에 그들의 대사 산물 내용을 신경 기능에 영향을 하 고 대부분1에 응답 자극의 균형에 영향을 미칠 수 있습니다. Abnormities는 pheochromacytoma, ganglioneuroma, 신경, 신경 성 질환1,2등 질병의 다양 한을 발생할 수 있습니다. 추출 및 체액에서 catecholamines에의 결정은 관련 질병의 진단에 의미가 있습니다. 그러나, catecholamines 생물 학적 샘플에 낮은 농도에서 존재 하 고 쉽게 산화 된다. 또한, 그들은 매우 많은 양의 중간3에서 간섭 때문에 elute 어렵다입니다. 따라서, catecholamines 생물 학적 체액에서의 동시 검출은 여전히 도전.

리뷰 요 catecholamines 스트레스, 측정 될 수 있습니다 그리고 그들의 수준은 신생아5처리 촉각 자극에 응답 하는 중요 한 생물 학적 마커 표시 되었습니다. 연구에 따르면 조 사건에서 고통을 모든 유아 뇌 부상4,,56에 대 한 위험이 있으며 부상 catecholamines 비정상적인 릴리스 체액에 관련된 문제를 발생할 수 있습니다. 고급 자기 공명 기술을 이전 단계7,8뇌 손상을 감지할 수 있는 존재 한다. 그러나, 첫 번째 48 h 내 비정상적인 neurodevelopmental 과정 하면 영구적인 뇌 손상 의료 이미지11분명 되지 않습니다. 게다가, 높은 비용 및 부족 한 악기 자원을 다른 요인 함께 인해 이러한 전문된 신경 이미징 기법에 대 한 액세스를 모든 신생아 단위에 대 한 없습니다. 그러나, (예: catecholamines 및 그들의 대사 산물) 쉽게 친근 하 고 실용적인 바이오 마커를 사용 하 여 이러한 단점을 극복할 수 고 인간의 체액에 바이오 마커 검사 수 있습니다 뇌 손상의 조기 진단에 도움이 프롬프트 이어질 신생 유아 neuroprotection9필요의 식별. 소변에서 catecholamines 체액 및 neuroactivity 기능으로 그들의 양 사이의 직접적인 상관 관계 때문에 간단 하 고 명백한 인덱스 수 있습니다.

생물 학적 체액 중 뇌 척추 액체 (CSF) 및 플라즈마 샘플 쉽지 않은 기존 외상 성 절차를 통해 얻을 수 그리고 그것은 또한 매우 어려운 접착 단백질 및 기타 불순물, 선도 하는 귀찮은 간섭 제거 하 고 시간이 걸리는 샘플링 과정 반복된 탐지를 위한 적합 하지 않습니다. 또한, 어린이 위한 아니다 거의 충격적인 패션에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 따라서, 요 샘플링은 샘플링의 다른 형태의 보다 더 나은 그것은 비 침략 적, 간편한 작동, 그리고 반복 해 서 행 해질 수 있다. 소변 샘플은 풍부 하 고 쉽게 저장 하 고, 큰 이점이 생물 샘플의 다른 형태의 표시.

생물 학적 체액에 catecholamines 척도를 주요 방법 등 radioenzymic 분석 실험10, 면역 매 분석 실험 효소 연결 된11, voltammetry12 열 렌즈 분석13. 하지만 단점이 존재, 복잡 한 작업 등 및 감지 하드 여러 대상을. 오늘, 지배적인 분석 기술은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)14, 그것의 높은 감도 및 좋은 선택 때문에 민감한 전기15 또는 fluorimetric 검출16와 결합 이다. 같은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 기술로 질량 분석 (LC/MS) 및 액체 크로마토그래피/질량 분석/질량 분석 (LC/MS/MS), 분석 및 정량화는 신경 전달 물질의 높은 얻을 수 있습니다 / 정확성과 특이성17,18. 그러나, MS 기술 비싼 계측 뿐만 아니라 대부분의 기존 실험실에서 보편적으로 적용 하는 방법 어렵게 실질적으로 자격 갖춘된 인력을 필요 합니다. ECD HPLC 시스템은 일반적으로 가장 전통과 임상 실험실에 있고 따라서 연구 그룹 화학 결정에 대 한 사용을 위한 일반적이 고 좋은 선택 되고있다 하지만 그들은 샘플의 청결을 시스템에 도입 해야 미 양19. 따라서, 정화 하 고 분석 하기 전에 샘플을 응축에 매우 중요 하다. 정화 단계에 대 한 고전적인 방법 이며 액체-액체 추출14,,1520 오프 라인 고체 상 추출, 활성된 알 루미나 열21,22 포함 하 여 및 diphenylborate (DPBA) complexation23,,2425,26.

명 리 외. 사용 하고있다 폴리머 수 지는 화학적으로 흡착 제는으로 크라운 에테르로 수정 인간의 소변에서 200727이후 catecholamines을 선택적으로 추출. 또한, 2006 년에, Haibo 그 외. 보여주는 boronate 선호도 추출 매 byutilizing에 대 한 손쉬운 종합 접근 functionalizable nanomagnetic 다면체 oligomeric silsesquioxane (포스) 기반된 nanomagnetic 합성, catecholamines에의 농축에 적용 인간의 소변 (더욱, 피 네 프 린 및 isoprenaline)28. 그들은 또한 나노 전기 불리고는 nanoscale 중합체 섬유 물자 형성 기술을 사용 하 여 작업을 수행 하기 위해 나노 소재 활용을 했다. 전기 프로세스는 작동 전압을 제어 하 고 다른 매개 변수29는 회전 솔루션의 내용을 변경 하 여 직경, 형태, 그리고 제품의 공간 맞춤을 조정할 수 있습니다. 기존 SPE 카트리지 비교, electrospun nanofibers는 추출 하 고 복잡 한 매트릭스에서 대상 analytes 풍부 매우 적합 한 그들은 높은 효율으로는 analytes를 adsorb 높은 표면 지역에 양 비율을 갖추고 있습니다 그리고 더 쉽게 제어 표면 화학 속성을 대상 화합물의 편리한 부착을 전시 한다. 이러한 속성을 있도록 SPE adsorbents, 크게 고체 단계와 탈 착 용 금액30,31,,3233감소에 대 한 좋은 선택. 소변 샘플에서 catecholamines에 대 한 electrospun nanofibers 폴리스 티 렌 (PCE-PS)와 apolymeric 크라운 에테르의 구성 3 catecholamines (네브라스카, E, 및 다)34를 선택적으로 추출 하 사용 되었다. 종이 선택적 크라운 에테르 흡착 네브라스카, E, 및 다, catecholamines 수소 결합을 형성을 통해 바인딩하는 정확한 기하학을 기반으로 했다 어떤의 대상 표시. 결과 표시 소재 크라운 에테르 효과적으로, 생물 학적 샘플에 포함 된 다른 간섭 화합물을 제거. 이 보고서에 의해 영감, 새로운 메서드는 catecholamines의 선택적 추출에 의해 개발 되었다 electrospun 복합 nanofibers PCE 추 구성의 사용

이 문서에 메서드를 보고 이전34 개선 되었고 성공적으로 E, 네브라스카, 고 다, 뿐만 아니라 그들의 대사 산물, MHPG 및 DOPAC, 소변에서 분석 뿐만 아니라 고용. 우리는 또한 흡착 과정의 메커니즘에 대 한 새로운 가능성을 탐험. 메서드 표시 만족 추출 효율과 5 analytes에 대 한 선택도 하 고 메서드가 perinatal 뇌 손상와 건강 한 컨트롤 위험이 높은 유아에서 소변의 분석에서 검증 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

부모 로부터 동의 얻어, 그리고 연구에 대 한 제도적 검토 보드 승인을 얻은. 연구는 인간을 포함 하는 실험에 대 한 세계 의학 협회 (헬싱키의 선언)의 윤리 강령에 따라 수행 되었다. 연구에 등록 되 고에 대 한 동의 서 면 제공 하는 모든 참가자의 보호자. Zhongda 병원 윤리 위원회 승인을 동남 대학와 제휴도 입수 했다.

1. 열과 추출 및 Catecholamines의 결정에 필요한 솔루션의 준비

  1. PFSPE 열을 준비 합니다. 5-6 aliquots로 PCE PS nanofibers의 1-2 mg을 분할 하 고 0.5 m m 직경을 가진 정밀한 강철 막대를 사용 하 여 질서 200 µ L의 양으로 피 펫 팁의 끝에 그들을 압축.
  2. 2.427 g 우 레 아, 0.034 g 요 산, 0.09 g 크, 0.297 g trisodium 시트르산, 0.634 g 염화 나트륨, 0.45 g 염화 칼륨, 염화 암모늄 0.161 g, 0.089 g 염화 칼슘이 수화물, 황산 마그네슘 0.1 g 무게에 의해 인공 소변을 준비 heptahydrate, 0.034 g 나트륨 중 탄산염, 0.003 g 나트륨 수 산 염, 0.258 g 나트륨 황산 염, 0.1 g 나트륨 디 인산 염, 그리고 0.011 g disodium 수소 인산 염, 디졸브 200 mL에 위의 화학 이온을 제거 된 물.
  3. 화합물의 2 mg 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 2 mg/mL diphenylborate (DPBA) 솔루션의 재고 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 어둠 속에서 솔루션을 저장
  4. 분석 표준
    참고: 화학 구조 및 속성 catecholamines의 불안정, 그리고 그들은 쉽게 분해. 표준의 준비 과정 매우 신속 하 고 직접적인 햇빛에 노출 되지 않도록 해야 합니다.
    1. 네브라스카, E, 다, MHPG, DOPAC 및 별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 내부 표준 3, 4 dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA 1.0 밀리 그램 무게. DHBA 솔루션을 사용 하기 전에 100 ng/mL를 물에 희석.
    2. Analytes 완전히 분해 때까지 빠른 속도로 어둠 속에서 준비 된 표준 흔들 리 다. 이것은 기본 주식; 몇 주까지-20 ° C에서 저장 합니다.
    3. 2 차 1000 ng/mL 분석 주식을 준비 합니다. 네브라스카, E, 다, DOPAC 및 MHPG, 증류수 5 mL 원심 분리기 튜브, 4,975 µ L에 5 µ L 각 기본 분석 재고의 전송 및 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장. 이러한 솔루션 신선한 매일을 준비 합니다. DHBA, 증류수 5 mL 원심 분리기 튜브에서 4,995 µ L로 기본 주식의 5 µ L를 전송 및 4 ° c.에서 별도로 어둠 속에서 그것을 저장합니다
    4. 표준 곡선을 만드는 보조 분석 재고 더 희석을 만들기 (예., 보충 표 2). 4 ° C에서 어둠 속에서 솔루션을 저장 하 고 신선한 매일 준비 합니다.
    5. 표준 재고를 사용 하 여 적절 한 농도로 ECD 검출기의 최적의 전압을 테스트 합니다. analytes가 가장 좋은 피크 모양의 찾을 값을 전압을 변화 한다.
  5. 30% 인산, 15% 이기를 포함 하는 eluant를 준비 하 고 55% 증류수. Eluant 용 매 10 ml, 5.5 mL 증류수, 사용 하 고 물에 이기의 1.5 mL 및 인산에 의해 드롭의 3 mL를 추가 합니다.

2. 실제 소변 샘플 및 모바일 단계 준비

  1. 어머니 무 균 소변 컵을 사용 하 여 그들의 유아의 첫 번째 아침 소변을 수집 했습니다. 폴 리 프로필 렌 튜브와 라벨 샘플을 즉시 전송 합니다. 그런 다음,-20 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.
  2. 소용돌이 원심 분리기 1,510 x g에서 10 분에서 오 줌 샘플 룸 온도 (RT) 대부분 미 립 자 방해의 제거를. 퇴적 물을 버리고 고 추가 실험 supernatants 수집 합니다. Analytes를 효과적으로 추출 하기 위해 centrifuging 직후 PFSPE 전처리 (3 단계)로 이동 합니다.
  3. 모바일 단계 준비
    1. 깨끗 한 병, 적어도 1 기사 준비 모바일 단계의 구성 보충 표 1;에 나열 된 1 L 모바일 단계, 구 연산 산, 에틸렌 diamine tetra 아세트산 (EDTA) disodium 소금, monometallic 나트륨 orthophosphate의 7.02 g 93.06 mg의 측정 6.7242 g에 대 한 1-heptanesulfonic 산 나트륨 소금, 404.5 마그네슘과 나트륨의 3.5 g 병으로 하이드 레이트. 40 mL 이기를 추가 하 고 1000 ml 증류수. 선동 하 고 솔루션에 문제 모두 해산 될 때까지 15 분 동안 초음파 진동.
    2. 유리 전극으로 pH 미터를 사용 하 여, 포화 수산화 나트륨 솔루션 4.21로 모바일 위상의 pH 값을 조정 합니다.
    3. 0.45 μ m polyvinylidene 불 소 미소 한 구멍이 있는 막과 불순물을 제거 하는 진공 흡입 장치 모바일 단계를 필터링 합니다.
    4. 15 분에 대 한 초음파 진동을 사용 하 여 모바일 단계 사용 하기 전에 각 시간을 드.

3. PFSPE 추출 및 HPLC 분석

  1. nanofibers를 활성화 합니다. 누르고 메탄올의 100 µ L의 물 100 µ L 순차적으로 통해 느린, dropwise 방식에서 5 mL 주사기를 사용 하 여 PFSPE 열.
  2. 믹스 100 µ L 소변 100 µ L 2 mg/ml DPBA 솔루션 및 30 µ L 100 ng/ml의 DHBA 솔루션 (IS, 내부 표준) 0.5 mL EP 튜브 샘플 다음 혼합된 솔루션 PFSPE 열을 전송 합니다. 5 mL 기밀 플라스틱 주사기 공기 압력의 힘을 사용 하 여 PFSPE 열 통해 혼합된 샘플 솔루션을 누릅니다.
  3. SPE 열에 DPBA 솔루션 (2 mg/mL)의 100 µ L을 로드 하 여 열 세 번 걸러 고 5 mL 기밀 플라스틱 주사기를 사용 하 여 공기 압력으로 천천히 카트리지를 통해 솔루션을 밀어.
  4. PFSPE 열에 eluant의 50 µ L을 로드 하 고 0.5 mL EP 튜브 eluate 수집 열을 통해 밀어.
  5. 시스템에서 공기를 드 하 HLPC degasser를 켭니다. 샘플 분석, 이전 시스템 equilibrate 및 기준선 소음 모바일 단계와 0.5 h 이상에 대 한 실행 해야 합니다. HPLC 시스템의 설치 매개 변수를 보여주는 보충 표 1 을 참조 하십시오.
  6. 20 µ L의 eluate 자동 샘플러를 사용 하 여 샘플 그리고 HPLC ECD 시스템에 주입.
  7. 실행 완료 되 면 감지기 인터페이스를 사용 하 여 검출기 셀 끕니다. 이 악기를 손상 시킬 수 있는 검출기, 뒷면 스위치 셀에서 설정 하지 마십시오.
  8. 모바일 단계 구성 10% 메탄올과 90% 물 수동으로 변경 합니다. 적어도 30 분 동안 실행 합니다. 그런 다음, 수동으로 HPLC 급 메탄올 모바일 위상을 변경 합니다. 메탄올에 시스템을 보호 하기 위해 약 15 분 동안 실행 합니다. 권장된 실행 시간을 다음이 단계를 실행 하는 실패는 열 및 검출기 손상 될 수 있습니다. 흐름을 끄십시오 다음에 degasser를 해제 합니다.

4. Phenylboronic 산 카트리지 (PBA) 추출

PBA 카트리지 추출 절차 쿠마 외에 계획에 유사 했다. (2011 년) 25. 모든 솔루션 PBA 카트리지 (100 mg, 1 mL)을 통해 공기를 주사기에 의해 강제로 적용 됩니다.

  1. 조건 1 80:20 이기-물 (v/v) 순차적으로 1% 개미 산 성 및 50 m m 인산 버퍼 (pH 10)의 1 mL를 포함 하는 카트리지.
  2. PBA 카트리지 통해 버퍼링된 소변 샘플 (1 mL 소변 및 2 mL 인산 염 버퍼, pH 8.5)를 누릅니다.
  3. 워시 1 mL 50: 50 v/v 이기 인산 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 카트리지.
  4. 1 mL 이기-물 (80:20 v/v) 1% 개미 산을 포함 하는 카트리지 elute

5. 식별 및 Catecholamines의 정량화

  1. 선형성
    1. 6 농도 (1.5, 3, 12, 25, 50, 그리고 100 ng/mL); 인공 소변 보조 analytes 재고 희석 인공 소변의 희석 볼륨 보충 표 2다음과 같습니다. 보정 곡선을 건설 하기 위한 18 분석 실험 솔루션을 각 농도와 세 개의 병렬 샘플을 확인 합니다.
    2. 100 ng/mL 실험 솔루션을 인공 소변 DHBA 보조 재고를 10 배 희석.
    3. 단계 3 (PFSPE 추출 절차)에 따라 5.1.1에서 모든 분석 솔루션을 pretreat. 단계 3, HPLC 크로마를 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluate의 20 µ L를 주사.
    4. 농도의 비율에 대 한 Y 축으로 피크 지역 (대상/IS)의 비율을 그려서 5 analytes의 보정 곡선을 건설 (대상/IS) X 축으로 보충 그림 1에서 보듯이.
  2. 감도 대 한 LOD 및 LOQ 값
    1. 샘플의 HPLC 크로마를 (3 단계), 마찬가지로 HPLC ECD 시스템에 빈 인공 소변의 20 µ L를 주사.
    2. 5.2.1에서 크로마에 11 빈 신호 값을 수집 하 고 계산 하는 평균 값 Xb 와 표준 편차 Sb. XL XL, 신뢰의 특정 수준에서 검출 될 수 있는 물질의 최소 신호를 계산 X =b+ K * Sb (K는 신뢰 수준에 의해 결정 계수의 잡음 레벨을 반영 하는 Sb 는 측정 방법 및 기계 소음 수준). 따라서, LOD = (L-Xb) X /S = (K * Sb) /S (S 스탠드 작업 곡선의 기울기 값에 대 한).
    3. 3:1 (K = 3) 검출 (LOD)의 제한에의 한 S/N 및 S/N 10:1 (K = 10) 정량화 (LOQ)의 제한으로 정의 합니다.
  3. 평가 복구
    1. 진짜 하 고 아군 소변 샘플을 준비 합니다. 3 개의 농도를 실제 소변 보조 analytes 재고 희석 (5, 50, 100 ng/mL) 아군된 소변 샘플을 얻기 위해. 각 분석 솔루션에 대 한 3 개의 병렬 샘플을 준비 합니다. 소변 샘플으로 아군 대상의 수량으로 아군된 농도 계산 합니다. S로이 값을 정의 합니다.
    2. 100 ng/mL, 단계 5.1.2 에서처럼 하 희석 DHBA 주식.
    3. 5.3.1에 따라 3 단계에서 각 샘플 솔루션 (PFSPE 추출 절차)를 처리 하 고 크로마 결과 얻기 위해 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluant의 20 µ L를 주입. Analytes의 값 아군된 소변 샘플에서 측정할 대상 화합물의 수량으로 계산 됩니다. T으로이 값을 정의 합니다.
    4. 크로마 결과 얻기 위해 HPLC-ECD (3 단계)로 시스템에 소변 샘플의 20 µ L를 주사. Analytes의 값 소변 샘플에서 측정할 대상 화합물의 초기 수량으로 계산 됩니다. 나는이 값을 정의 합니다.
    5. 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 백분율 복구 방법론 복구 %로 추정 된다 (t - Ai) = × 100 / (s). 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.
  4. 평가 부정확성
    1. 5, 50, 및 100 ng/mL 농도 단계 5.3.1 에서처럼 아군된 인공 소변 샘플을 준비 합니다. 각 분석 솔루션에 대 한 6 병렬 샘플을 준비 합니다. 매일 신선한 실험 샘플을 준비 합니다.
    2. DHBA 재고 단계 5.1.2 에서처럼 100 ng/mL를 희석.
    3. 하루 정밀 평가 (n = 6). 3 단계에 따라 5.4.1에서 각 샘플 솔루션을 처리 하 고는 크로마를 ECD HPLC 시스템으로 각 특 파 원 eluant의 20 µ L를 주입. 6 번 같은 날에에서 같은 작업을 할.
    4. 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 같은 화합물의 동일한 농도에서 하루에 6 개의 분석 실험의 상대 표준 편차 (RSD)-하루 정밀도로 결정 됩니다. 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.
    5. 간 날 정밀 평가 (n = 6). 6 개의 순차적 일에서 매일 같은 시간에 5, 50, 100의 3 개의 농도 대 한 아군된 인공 소변 샘플을 준비 ng/mL, 5.4.1 및 5.4.2., 3 단계에 따라 각 분석 샘플 솔루션을 처리 하 고.
    6. 결과 얻기 위해 크로마 매일 ECD HPLC 시스템으로 각 해당 eluate 5.4.5에서 20 µ L를 주사. 표준 곡선 방정식에서 샘플에 대상 화합물의 수량을 계산 합니다. 간 날 정밀은 3 개의 농도에서 아군된 인공 소변 샘플에서 분석 실험 수량 RSD 6 순차적 일에서에 표현 됩니다. 평균 값은 표 1에 나와 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 간단 하 고 편리한 PFSPE 메서드 소변 샘플을 pretreat HPLC ECD 시스템;을 통해 탐지를 위한 5 catecholamines 풍부 하 프로세스의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜은 주로 4 단계 활성화, 로드, rinsing, 그리고 방출-PCE PS nanofibers 및 간단한 고체 상 추출 장치의 소량과 함께 포함 되어 있습니다. PCE PS nanofibers의 형태는 표면 및 다공성 분석기를 사용 하 여 평가 했다 ( 재료의 표참조). 텍스처 속성에 내기 (Brunauer, 모트, 텔러) 표면 지역, 기 공 볼륨 및 기 공 크기-2.8297 m2 g-1, 0.009 c m3 g-1, 그리고 12.76 nm, 각각. 이러한 데이터 프로토콜에 사용 되는 재료는 높...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서에 제안 된 PFSPE 메서드는 중요 하 고 그것의 신속성, 단순성, 및 편의 의미 있을 수 있습니다. Adsorbents 프로토콜에 사용 되는 electrospun nanofibers, 높은 표면 영역 볼륨 비율, 있고 높은 효율으로는 analytes를 흡착 한. 절차만 nanofiber의 몇 밀리 그램 및 eluant 용 매, 작은 볼륨을 필요로 하 고는 analytes을 집중 하는 증발 단계를 필요 하지 않습니다. 여기, 우리 설정 검색에 대 한 효과적인 방법에 새 사용자를 허용 하는 HPLC ECD 기반 프로토콜에 대 한 자세한 개요와 3 catecholamines의 2 (네브라스카, E, 다, 고 MHPG, DOPAC) 그들의 대사 산물의 정량화를 제시 했습니다.

이 프로토콜의 우수성 주로에서 유래 4 개의 중요 한 단계는 절차 동안, 그림 1에서 보듯이: PCE PS nanofibers 매 빠른 흡수로 이어지...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는이 문서에서 설명 하는 자료에 관한 모든 금융 조직과 충돌의 관심을 증명 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 과학 재단의 중국 (No.81172720, No. 81673230), 사회 개발 연구 프로그램의 장쑤 성 과학 및 기술 부 (제에 의해 지원 되었다 BE2016741), 과학 및 중국의 질 감독, 검사 및 검역 (2015QK055), 아동 발달 및 교육 과학기술부의 과학 학습의 주요 연구소의 오픈 프로젝트 프로그램 일반 관리의 기술 프로젝트 남동 대학 (CDLS-2016-04). 우리는 진심으 원 노래와 Ping Liu 샘플 컬렉션에 우리 지원 인정 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
200 &마이크로; L 피펫 팁컬럼은 나노 섬유를 포함하고,
PFSPE 추출 용나노 섬유
강철 막대 (직경 약 0.5mm)
밀 플라스틱 주사기 (5ml)끝으로 용액을 압축합니다.
, Ltd67-56-1
디페닐보린산 2-아미노에틸 에스테르(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408복합 시약
노르에피네프린(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512분석물
3-메톡시-4-하이드록시페닐글리콜(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377분석물
에피네프린(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503분석물
3, 4- 디하이드록시페닐아세트산(DOPAC)시그마-Aldrich.IncD-9128분석물
도파민(DA)시그마-알드리크.IncH-8502분석물
3, 4-디하이드록시벤질아민 하이드로브로마이드(DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781내부 라벨
아세토니트릴Sigma-Aldrich.Inc75-05-8엘루리안 및 이동상
인산Sinopharm 화학 시약Co., Ltd7664-38-2eluriant
요산Sinopharm 화학 시약Co., Ltd69-93-2인공 소변
크레아티닌Sinopharm 화학 시약Co., Ltd60-27-5인공 소변
구연산 삼나트륨Sinopharm 화학 시약Co., Ltd6132-04-3인공 소변
KClSinopharm 화학 시약Co. , Ltd7447-40-7인공 소변
NH4ClSinopharm 화학 시약Co., Ltd12125-02-9인공 소변
NaHCO3Sinopharm 화학 시약Co., LtdSWC0140326인공 소변
C2Na2O4Sinopharm 화학 시약Co., Ltd62-76-0인공 소변
NaSO4Sinopharm 화학 시약Co., Ltd7757-82-6인공 소변
인산수소Sinopharm 화학 시약Co., Ltd10039-32-4인공 소변
요소Sinopharm 화학 시약Co., Ltd57-13-6인공 소변
NaClSinopharm 화학 시약Co., Ltd7647-14-5인공 소변
MgSO4.7H2OSinopharm 화학 시약Co., Ltd10034-99-8인공 소변
CaCl2Sinopharm 화학 시약Co., Ltd10035-04-8인공 소변
HClSinopharm 화학 시약Co., Ltd7647-01-0인공 소변
구연산Sinopharm 화학 시약Co., Ltd77-92-9인공 소변 및 이동상
EDTA 이나트륨 염Sinopharm 화학 시약Co., Ltd34124-14-6이동상
단금속 오르토 인산 나트륨Sinopharm 화학 시약Co., Ltd7558-80-7인공 소변 및 이동상
1- 헵탄 술폰산 나트륨 염Sinopharm 화학 시약Co., Ltd22767-50-6이동상
수산화 나트륨Sinopharm 화학 시약Co., Ltd1310-73-2이동상
페닐 보론산 칼럼 (PBA 칼럼)Aglilent12102018PBA 추출
Inertsil® ODS-3 5 &마이크로; 남 4.6&배; 150mm 열Dikma5020-06731분리 용 HPLC 컬럼
SHIMADZU SIL-20AC 돌출 자동 샘플러Shimadzu Corporation, 일본SIL-20AC자동 주입 eluriant
SHIMADZU LC-20AD 고성능 액체 크로마토 그래Shimadzu Corporation, 일본LC-20ADHPLC 펌프
SHIMADZU L-ECD-60A 전기 화학 검출기Shimadzu Corporation, 일본분석물용L-ECD-60A
ASAP 2020 가속 표면적 및 기공계 시스템Micromeritics, 미국표면 및 다공성 분석기 
재료를 기에 나노 섬유를 채우고, 팁 메탄올 Sinopharm 화학 시약의 나트륨 피 검출기

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330(1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203(2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Catecholamine NeurotransmittersHigh Pressure Liquid ChromatographyElectrochemical DetectionSolid Phase ExtractionPacked Fiber Solid Phase ExtractionUrine Sample AnalysisNanofiber AdsorbentMonoamine MetabolitesInfant Urine TestingHPLC ECD System

관련 논문