DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

Summary

혜성 분석 결과 단일과 이중 가닥 DNA를 포함 하 여 DNA 손상 나누기를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 화학 요법의 치료 효과 평가 하기 위해 암 세포의 DNA 손상을 측정을 설명 합니다.

Abstract

DNA 손상의 수명 동안은 각 셀에 대 한 일반적인 현상이 며 genomic DNA의 화학 구조에의 한 변경으로 정의 됩니다. 암 치료, 라디오-및 화학 요법 같은 엄청난 양의 추가 DNA 손상, 세포 주기 검거와 apoptosis 제한 암 진행을 이끌어 소개. 실험적인 암 치료 기간 동안 DNA 손상의 정량적 평가 차적인 에이전트의 효율성을 정당화 하기 위해 중요 한 단계입니다. 이 연구에서 우리는 단일 셀 전기 이동 법 분석 결과, 일컬어 혜성 분석 결과, 단일 계량 수 있는에 집중 하 고 이중 가닥 DNA 생체 외에서휴식. 혜성 분석 결과 DNA 손상 부 량 효율적이 고, 실행 하기 쉬운 낮은 시간/예산 요구 및 높은 재현성. 여기, 우리 U251 glioma 셀에 olaparib/temozolomide 조합 치료의 차적인 효과 평가 하 여 전 임상 연구에 대 한 혜성 분석 결과의 유틸리티를 강조 표시 합니다.

Introduction

혜성 분석 결과 처음 개발 되었다 Ostling와 요한슨에 의해 1984 년에 DNA의 마이그레이션 중립 조건¹아래 핵에서 조각으로. 기술은 나중 싱 외., 보여주는 알칼리 상태를 실질적으로 특이성 및 재현성 분석 결과²의 증가 의해 개발 되었다. 그 이후, 중립 혜성 분석 결과 주로 데 반면에 알칼리 성 혜성 분석 결과 DNA 손상, 싱글 등의 작은 금액에 대 한 더 민감한 이중 가닥 DNA 틈, 알칼리 정한 사이트, DNA-DNA 이중 가닥 DNA 틈, 검색 또는 DNA-단백질 cross-linking 그리고 DNA 단일 가닥 나누기 불완전 절단과 관련 된 사이트^3,4복구. 두 분석 된 DNA의 시각화를 허용 하 고 양적 DNA 손상을 평가 하는 간단한 방법을 제공. 혜성 분석 결과 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전 독성 연구를 위한 중요 한 방법으로 간주 되 고 초기 약물 후보 선택, 환경 모니터링, 인간의 biomonitoring 다른 연구 분야에 적용 됩니다. 그리고 기본 DNA 손상에 연구 하 고⁵를 복구.

분석 결과의 원리가 이다 전기 분야에서 조각난된 DNA는 핵양체 몸에서 (일컬어 "혜성 머리") 마이그레이션합니다와 agarose 젤 (일컬어 "혜성 꼬리")에서 DNA 얼룩을 형성. 뉴클레오티드 얼룩과 DNA 손상의 범위 "혜성"이 단일 셀 전기 이동 법에 의해 형성을 분석 하 여 측정할 수 있습니다. 꼬리 순간의 계산 더 비교 다른 실험적인 그룹 간의 DNA 손상 시킬 수 있습니다. DNA 손상 탐지의 전통적인 방법에 비해, 혜성 분석 결과 이며 직접, 민감한, 저렴 한, 상대적으로 간단한.

방사선 치료와 chemotherapies 단일 가닥을 생성 하 여 암 치료에 대 한 일반적인 전략은와 이중 가닥 DNA는 염색체⁶에 나누기. DNA 복구 억제제의 최근 발전 조합 화학요법에 의해 더 효과적인 차적인 효과 허용 하 고 따라서 잠재적으로 빈 혈, 감염, 골 수 억제^7, 같은 조직의 부작용을 감소 ⁸.이 연구에서 우리는 많은 (ADP-ribose) (PARP) 억제제, olaparib (Ola)⁹의 조사 했다. PARP 풍부한 핵 단백질 이며 많은 (ADP-ribose) 폴리머¹⁰을 형성 하 여 DNA 기본 절단 복구에 대 한 책임입니다. Temozolomide (TMZ)는 구두로 사용 가능한 alkylating 에이전트 이며 glioma 환자 치료를 위해 널리 이용 되는. DNA 손상 척도를 혜성 분석 결과 사용 하 여 우리는 olaparib/temozolomide 조합 치료 glioma, 치료 하는 효과적인 전략을 제안 glioma 세포에서 DNA 손상 향상 결합 olaparib temozolomide 깊이 설명 temozolomide 혼자¹¹와 비교.

Protocol

1. 시 약 준비

1. 1 x PBS
   1. 900 mL dH ₂ O 100 mL 10 x PBS를 희석 하 고 pH 미터를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. 실내 온도에 상점.
2. 세포 솔루션 (LS)
   1. 2.5 M NaCl, 100 m m disodium EDTA, 10 mM Tris 자료, 및 900 mL dH ₂ O 200 m m NaOH 준비, 그것은 일반적으로 완전 해산을 혼합 수 있도록 약 20 분 걸립니다. 10 pH 미터를 사용 하 여 pH를 조정 합니다. 추가 1% 나트륨 lauryl sarcosinate 및 1% 트라이 톤 X-100 1000 mL를 최종 볼륨을 조정. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 쿨.
3. 알칼리 성 전기 이동 법 솔루션 (AES), pH > 13
   1. 200 m m NaOH와 1 m m disodium EDTA 800 mL dH ₂ O. 조정 산도 준비 하 고 pH는 > 13. 1000 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다. 사용 하기 전에 신선한 확인 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 냉각.
4. 중립 전기 sollution (NES)
   1. 빙 초 산 100 mM Tris 기지와 300 mM 아세트산 나트륨 1000 mL dH ₂ O. 조절 pH 9.0 혼합 하 여 준비 1000 mL 중립 전기 이동 법 버퍼. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 4 ° C에 쿨.
5. DNA 강수량 솔루션 (DPS)
   1. 10 mL 7.5 M 암모늄 아세테이트 주식의 준비. DNA 강수량 솔루션 50 ml, 6.7 mL 7.5 M 염화 아세테이트 43.3 mL 95% 에탄올 혼합. 실내 온도에 상점.
6. 얼룩 솔루션
   1. 추가 1 µ L 10000 녹색 형광 핵 산 얼룩 (예를 들어, SYBR 녹색) 30 mL 트리 스-EDTA 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 m m disodium EDTA, pH 7.4)에 게 x 4 ° C. 보호에서 빛.
7. 1% 낮은 녹는 agarose
   1. 1% 낮은 녹는 포인트 agarose (1 g 100 mL dH ₂ O) 전자 레인지에 녹여. 모든 15-20 s는 agarose는 완전히 녹은 것을 확인 하는 agarose를 소용돌이 친다. 사용 하기 전에 적어도 20 분 동안 37 ° C 물 목욕에는 agarose를 놓습니다.
8. 미리 따뜻한 피 펫 팁
   1. P200 피 펫 팁의 좁은 끝 3 mm와 37 ° C에서 따뜻한 agarose를 pipetting 전에 잘라.

2. 혜성 슬라이드 준비

1. 코팅 슬라이드
   1. 는 agarose는 완전히 녹은 때까지 또는 2-3 분 동안 전자 레인지에 녹여 1 %agarose (1 g 100 mL dH ₂ O). 유리 현미경 슬라이드는 agarose 찍어와 보풀 지우기를 사용 하 여 슬라이드의 한 면을 닦아 내십시오.
   2. 누워 건조 또는 빠른 건조를 위해 50 ° C에가 열 하는 평평한 표면에 슬라이드; 건조 후 투명 agarose 필름을 형성 한다. 사용 하기 전에 37 ° C에 코팅된 슬라이드 배치.
2. 단일 셀 정지의 준비
   1. 문화와 치료 glioma 셀
      1. &
      2. 
         

5. 
   
   
   

Results

현재 프로토콜 혜성 분석 결과 실행 및 데이터 분석 (그림 1)에 대 한 단계별 워크플로 설명합니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 결과 나타났다 U251 세포 독 소 루비 취급 (1 µ M, 20 h)의 혜성 꼬리 더 오래 되었고 더 높은 DNA 강도, 화학 요법 (그림 2)으로 조각난된 DNA의 상당한 축적을 제안 했다.

중 알칼리 성 또는 중성 혜성 분석 결과 대 한 정량 분석 독 소 루비 치료 (그림 3A) DNA 손상을 나타내는 후 크게 증가 혜성 꼬리 형성을 했다. 결과 평균 ± SEM 및 t으로 제시-테스트 통계 비교를 위해 사용 되었다. 두 분석 실험에서 꼬리 순간의 부 량 ...

Discussion

혜성 분석 결과 세포 수준에서 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 측정 하는 효율적인 도구 이다. 분석 결과 연구에 관한 genotoxicity 및 biomonitoring¹³, 기본 병 변, DNA crosslinks, 약물 개발 및 알칼리 민감한 사이트에서까지 "황금 표준"으로 널리 적용 되었습니다. 현재 연구에서 우리가 알칼리와 중립 혜성 분석 실험에 대 한 두 가지 단계별 프로토콜 각각 보였다. 결합 하 여 단일 셀 전기 이동 법, 형광 현미경 검사 법, 및 이미지 해석, 모두 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 생체 외에서손상 DNA의 정도 평가 하는 양적 접근을 제공 합니다.

몇 가지 주요 단계는 혜성 분석 결과의 성공적인 실행을 위해 필수적입니다. 예를 들어 치료 시 약 준비의 단계에 취해야 한다. 각 솔루션을 갓 준비 하 고 내 생 적인 DNA 손상을 방지 하거나 샘플 준비 하는 동안 복구를 사용 하기 전에 적어...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
나트륨 라 우릴 사르코시 네이	시그마	L7414
트리톤 X-100	시그마	93443
나트륨 아세테이	시그마	32318
빙초 산	시그마
암모늄 아세테이	시그마	A1542
SYBR 그린	인비트로겐	S33102
낮음 융점 아가로스	인비트로젠	16520
아가로스	인비트로겐	16500
95% 에탄올	WARNER-GRAHAM#	64-17-5
트립신	GIBICO	25300-054
Name<	strong>Company	카탈로그 번호	코멘트
소모품
유리 조직 슬라이드	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	DENVILLE
피펫 팁	SHARP
strong>Name	>Company	카탈로그 번호	코멘트
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
수평 전기영동 챔버	TREVIGEN	Cometassay ES II
전원 공급 장치	Bio-Rad
인큐베이터	Quincy Lab	모델 12-140E
형광 현미경	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf