방법 논문

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

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DOI:

10.3791/56455

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2017년 11월 9일

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1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

이 논문에서

요약

이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.

초록

실험적인 자기 면역 신경 염 (EAN) 자기 면역 주변 demyelinating 질병의 잘 평가 실험 모델 이다. EAN 질환 말 초 신 경계 (PNS)의 구성 요소에 대 한 선 동적인 공격을 직접 neurogenic 펩 티 드와 마우스를 면역에 의해 유발 됩니다. 최근 발전은 myelin 단백질 제로 (P0)106-125 또는 P0180-199 펩 티 드 백 일 해 독 소의 주사 함께 보조 제공을 사용 하 여 상대적으로 내성 C57BL/6 마우스 라인에서 EAN의 유도 활성화 했습니다. C57BL/6 스트레인에 EAN을 유도 하는 능력이 마우스 배경에 존재 하는 수많은 유전 도구 사용에 대 한 허용 하 고 따라서 질병 병의 정교한 연구 및 심문에 새로운 치료제의 기계 작업의 수 유전자 변형 접근 조합입니다. 이 연구에서는 EAN C57BL/6 쥐에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 성공적으로 유도 하는 간단한 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 neuropathological 기능의 배열과 함께,이 모델에서 발생 하는 기능적인 적자의 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 따라서,이 모델은 인간의 주변 demyelinating neuropathies의 병 인을 공부 하 고 myelin 복구를 촉진 하 고 면역에 신경 손상 으로부터 보호 하는 것을 목표로 하는 잠재적인 치료의 효능을 결정 하는 강력한 실험 모델 신경 염입니다.

서론

주변 neuropathies 일 수 있다 근원에서 유전 인수, 인수 neuropathies 있는 어느 대사, ischaemic, 염증, 또는 독성 침. 이 질병도 유용 하 게 axonal 또는 근원에서 demyelinative로 분류 됩니다. 가장 일반적인 주변 neuropathies는 급성 염증 성 Demyelinating 증 (AIDP, Guillain-바레 증후군, GBS 라고도) demyelinating 인수 및 만성 염증 Demyelinating 증 (CIDP)1, 2 , 3 , 4. 둘 다 pathogenetically의 주변 신경 demyelination 일으키는 myelin 칼 집에 대 한 지시 자가 면역 반응에 의해 특징 이다. 이 질병에서 활성화 된 T 세포 혈액 신경 방 벽을 교차 하 고 PNS 내 면역 반응을 생성. 다음은 신경 내에서 대 식 세포의 활성화 demyelination phagocytic 공격을 통해 직접 또는 간접적으로 통해 분 비 염증 성 중재자, 마비 및 감각 부전5등 임상 장애의 결과로 발생 합니다. Demyelinated 축 삭 demyelination 다음 remyelinated 수 있는 능력을 유지 하는 동안 remyelination 자주 지연 또는 불완전, 돌이킬 수 없는 손상을, 벌 거 벗은 axons의 민감성에 따른 임상 영구의 주요 원인 장애입니다. 현재 가장 효과적인 치료는 immunomodulatory, 하지만 그들의 효 험에도 불구 하 고 많은 경우에는 복구는 종종 느린 고 25% 환자 크게 줄일 그들의 삶의 질6, 잔여 기능적인 적자를 경험할 것 이다 7.

EAN demyelinating pathogenesis 및 비 발한 치료 대리인4를 평가 하는 수단으로 귀중 한 통찰력을 제공 하고있다 주변 신경 병의 널리 사용 되는 동물 모델 이다. 이 모델은 토끼, 다른 종에서 유도 될 수 있다 쥐, 쥐 및 기니 피그와 neurogenic 항 원 가진 면역에 의해 유발 됩니다. 그러나, 궁극적으로 성공적인 EAN 유도 발생 하는 질병에 대 한 적절 한 면역 반응에 따라 다릅니다. 면역 기능에 종 (및 남북 species/스트레인) 변화를 감안할 때, 항 원 및 adjuvants의 여러 조합은 성공적으로 EAN을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. Murine 유전 도구 점에서 C57BL/6은 가장 널리 사용 되 고; 그러나, 전통적인 P2 단백질 펩타이드 57-81 (P257-81) 취약 SJL 마우스 스트레인8 질병에서 발생 하는 불법 pathogenesis C57BL/6 스트레인에 기능적인 적자를 선도를 수 없습니다. 보조 결합에 민감 화 패러다임 P0106-125 또는 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여 전달 하는 다행히도, 백 일 해 주사와 함께 독 소 정교한 유전자 도구에 활용 될 수 있도록이 장애물을 극복할 수 있는 murine EAN 모델입니다.

여기, C57BL/6 쥐에 EAN의 감 응 작용을 위한 간단한 방법을 제시 합니다. 또한, 질병과 관련 된 기능 및 neuropathological 적자를 평가 하는 포괄적인 상세한 접근 제공 됩니다. P0180-199 펩 티 드9 P057-81 대체10우선 선정 되었다. P0180-199 모델 생산 P057-81 대체10에 비해 덜 심각한 임상 증상을 설명 및의 소개를 잠재적으로 견딜 것 이므로 해로운 유전자 섭, (와 같은 삼 투 펌프 이식) 수술에서 회복 이며 의무가 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트4. 그러나, 디딜 방 아 걸음 걸이 기능 테스트 및 여기서 설명 하는 조직학 프로토콜 수 쉽게 적용할 P057-81 유발 변종에 질병을 공부 하는 때.

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프로토콜

여기에서 설명한 모든 절차 Florey 연구소 신경 과학 및 정신 건강 (멜버른 두뇌 센터) 동물 윤리 위원회 승인 했다 고 과학에 대 한 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습을 따라 목적.

1. EAN 유도

참고: EAN 남성 C57BL/6 쥐 세 6-8 주 사이에서 성공적으로 유도 될 수 있다. 유도 프로토콜 총에서 9 일이 걸린다. 0 첫 번째 면역의 날을 말합니다. 이 프로토콜에 대 한 주사 마 취 실시 했다 (단계 1.1.2 아래 참조).

  1. 일에-1:
    1. 백 일 해 독 소를 준비 (재료의 표 참조) 솔루션의 1.6 µ g/mL의 멸 균 0.1 m M 마우스 isotonic 인산 염을 사용 하 여 식 염 수 (MT-PBS) 버퍼링.
    2. Isoflurane와 anesthetization:
      1. anesthetization 챔버에 마우스 (C57BL/6, 남성, 6-8 주)를 놓고 1 L/분에 산소 흐름을 조정
      2. Isoflurane 기화 기 설정, anesthetization, 및 호흡 하는 모니터에 대 한 2.5%로 조정 하 고 대기 2 분, 또는 때까지 기본 반사 (각 막 및 뒷 다리)는 더 이상 반응
    3. Anesthetization 상공에서 마우스를 제거 하 고 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 30 1/2 G 바늘으로 복 (i.p.) 주사를 통해 위의 백 일 해 독 소 솔루션의 250 µ L 관리.
    4. 면역 주사 inoculum 준비:
      1. P0 180-199 펩 티 드의 2 mg/mL 해결책을 사용 하 여 준비 솔루션 (와 함께 > 98% 순도, 시퀀스 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) 0.9% 염 분에서.
      2. 준비 솔루션 B 결핵균의 20 mg/mL 해결책을 사용 하 여 참조 테이블의 재료 Freund에 ' s 완전 한 보조 (FCA, 구성: 15% mannide monoolate + 파라핀 오일 0.5 mg/mL의 85% desiccated 살해와 말린 M 진 균 butyricum)의.
      3. 주입, 최종 inoculum을 비드 때리는에 해결책 A와 B의 동일 볼륨 부분을 결합 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 최대 속도로 혼합.
        참고: 솔루션 A와 B 재고 유지 및 수 최대 한 달에 4 ° C에서 저장 된 있지만 결합 된 최종 inoculum 갓 마우스 주입의 일에 대비해 야 합니다.
  2. Inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L를 관리 하는 일에 0, 23 G 바늘을 사용 하 여 피하 주사를 통해 마우스에.
    참고: 주사 수 수 위에 양 어깨 사이 또는 뒷 다리와 꼬리 사이 꼬리 등.
  3. 하루 1에 1.2 µ g/mL의 백 일 해 독 소 솔루션 (MT-PBS)에서 만들고 i.p. 주입 30 1/2 G 바늘으로 0.5 mL 주사기를 사용 하 여 통해 마우스에 250 µ L 관리.
  4. 에 3 일, 반복 단계 위의 1.3.
    참고: 재고 솔루션 A와 B 구성 고 1 달 최대 4 ˚C에 저장 될 수 있습니다. 그러나, A와 B, 재고 솔루션을 결합 하 여 생산 최종 주사 inoculum 주사의 일에 이루어져야 합니다.
  5. 8 일에 관리 inoculum (준비 단계 1.1.4에서에서 설명)의 50 µ L 피하 주사를 통해 마우스에 (단계 위의 1.2 참조), (각 동물)에 대 한 1.2 단계 에서처럼 동일한 사출 사이트

2. 임상 점수

  1. 하루 0에 시작 하는 매일 밖으로 임상 점수 수행.
  2. 각 마우스의 0, 1, 2, 3, 또는 4 4 게시 된 기준 따라 점수를 제공합니다. EAN 임상 점수 표 1을 참조 하십시오.
    참고: 일관성을 위해 노력 하 여야 한다 동시에 쥐를 매일 같은 연구원에 의해.

3. 기능 평가 모터

참고: 동물의 동일한 코 호트에 대 한 임상 점수와 병렬로 모터 성능 평가. 모터 기능 평가 기구는 걸음 걸이 기능 이미징 시스템 (재료의 표 참조) 설치 되어 있는지 컴퓨터에 연결 되어야 합니다. 또한 평가 될 모든 쥐를 EAN 유도 전에 실행 중인 작업 익숙해져 한다는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 연습 실행 (마우스 당 2 테스트 실행) 3 일전 질병 유도 (하루-3) 수행 됩니다.

  1. 모터 기능 평가 장치 및 조명 버튼 스위치 설정.
  2. 아저씨 마우스 단단히 고 꼬리를 잡고 빨간 잉크 가득 컨테이너에 그것을 낮추는 방법으로 발 잉크.
    참고:이 단계는 C57BL/6 스트레인에 대 한 필요 하지만 마우스 스트레인 흰색 코트 색상으로 사용 하는 경우 건너뛸 수 있습니다.
  3. 걷는 구획에 마우스 고 15 cm에서 디딜 방 아의 속도 설정/미
  4. 디딜 방 아와 클릭은 " 기록 " 이미징 시스템 걸음 걸이 기능을 사용 하 여 마우스의 실행 모션 캡처 버튼 (재료의 표 참조).
  5. 타이머를 사용 하 고 36 각 실행 측정 s. 36 s, 정지 녹음 및 중지 디딜 방 아 후.
    참고: 성공적으로이 36 s 간격에 실행 중인 작업을 완료할 수 없는 쥐 실패 한 것으로 간주 됩니다.
  6. 지정 된 폴더에 비디오 파일을 저장.
  7. 평가를 각 마우스에 대 한 위의 단계를 반복 합니다. 3 일 마다 같은 실행 작업 마우스 테스트.
  8. 걸음 걸이 함수 매개 변수 (자료의 표 참조)에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여 편집 된 비디오 파일을 분석.
    참고: 다른 모터 매개 변수를 분석 하는 방법의 세부 사항을 다 소프트웨어 사이 그렇게 제조 업체를 참조 하십시오 ' 분석 전에 s 지시. Axonal의 조직학 증거를 얻기 위해 immunohistochemistry 또는 전자 현미경 검사 법, 동물 조직 어떤 단계 게시물 모터 기능 평가 특정 목표에 따라 연구에 반입할 수 있습니다 통해 수 초 손상.

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결과

P0180-199 펩 티 드에서 monophasic 질병 임상 점수 C57BL/6 마우스 리드 EAN 유도 첫 예방접종 (dpi), 그리고 최대한 점수 심각도 25에서 관찰은 6 일 게시물에서 발병 뒤 일부 임상 점수 40에서 개선 기간 (그림 1)4,9. 걸음 걸이 기능 측면에서 마우스 빠르면 6 dpi, 간단한 실행 중인 작업에 실패 35 dpi 마우스에 의해 간단한 디딜 방 아 실행 하는 작업을 완료 하는 데 작은 용량을가지고 시작 하 고 55 dpi4 (그림 1) 에서도 능력을 실행에 개선 하지 않으면. 마우스는 EAN 점차적으로 시간이 지남에 실행 작업을 수행 하는 기능에 거부를 유도 한다....

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토론

이 보고서는 EAN C57BL/6 마우스에 P0180-199 펩 티 드를 사용 하 여, EAN으로 유도 된 쥐에 있는 주요 neuropathological 및 기능적인 적자의 정량화를 활성화를 유도 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 EAN 유도 프로토콜에 고유한 면역 주사를 수행 하는 동안 마 취를 사용 하 여가입니다. Isoflurane 마 취의 사용은 크게 inoculum의 총 볼륨 최소한의 오류 및 스트레스 동물을 원하는 위치에 피하 주입 되도록 기능을 향상 시킵니다.

마우스 6 dpi4 EAN 유도의이 방법을 사용 하 여 질병의 임상 증상을 표시 하기 시작 합니다. 그러나, 임상 평가 점수에 의해 측정 된 질병 발병 이전 ~ 10 dpi9,10에서 발생할 수 보고 되었습니다. 질병 발병 임상...

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공개 사항

저자는이 작품에 대 한 관심의 없습니다 충돌 있다.

감사의 글

DGG은 NHMRC 피터도 허 티와 다 발성 경화 증 연구 호주 (MSRA) 초기 경력 연구원입니다. JLF는 MSRA 박사 친교에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트 JX를 #APP1058647을 부여 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6, 수컷, 6-8주 된Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxinList Biological Laboratories, Inc., CA, USA#181
0.1 M 마우스 등장성 인산염 완충 식염수(MT-PBS)실험실에는 자체 프로토콜이 있습니다.
IsofluranePharmachem, QLD, AustraliaLaboratories는 투여를 위한 자체 프로토콜을 가지고 있습니다.
P0180– 199 펩타이드Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180– 199, 시퀀스 S– S– K– R– 지앤대시; R– Q– T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R– S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)Difco, MI, USA#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)Difco, MI, USA#263910
16% 파라포름알데히드(PFA)Electron Microscopy Services#15710조직 채취의 날을 4% PFA로 희석합니다.
25% 글루타랄데이드ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia#11-30-82.5% 글루타르알데히드로 묽게 고정합니다.
Sodium azideChem-Supply Pty Ltd, SA, AustraliaSL1890.1M MT-PBS에 10%(w/v) 주식을 생성합니다. 0.03%(v/v)에서 사용합니다.
SucroseChem-Supply Pty Ltd, SA, AustraliaSA03030%(w/v)에서 사용합니다.
최적 절단 온도(OCT) 매체Sakura Finetek, CA, USA#4583
일반 당나귀 혈청Merck Millipore, MA, USA#S30-100자체 실험실에서 결정한 10%(v/v) 또는 기타 농도의 항체 희석제로 사용합니다.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, USA#90o2-31-10.3%(v/v) 또는 자체 실험실에서 결정한 기타 농도의 항체 희석제에 사용합니다.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)Invitrogen (Life Technologies), CA, USAS12700자체 실험실에서 1:400 또는 적정에 사용.
토끼 안티 콘택트In-associated protein-1 (Caspr)Wiezmann Institute of Science의 Elior Peles 교수로부터의 선물1:500 또는 자신의 실험실에서 적정액으로 사용됩니다.
적절한 Alexa Fluor 접합 2 차 항체Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA1:200에서 다양하게 사용하거나 자체 실험실에서 적정합니다. 항체가 형성된 종과 Alexa Fluor의 선택은 각 실험실의 재량에 따라 결정됩니다.
수성 마운팅 솔루션Dako (Agilent), CA, USA각 실험실은 자체 선호도가 있습니다.
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
0.5 mL 주사기, 301/2 g 바늘BD#326105
23g 바늘BD#305143
빨간 잉크 패드빨간 잉크 패드나 빨간 식용 염료를 사용하여 동물의 발을 표시할 수 있습니다.
DigiGate 장치(트레드밀 포함)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate 이미징 시스템eMouse Specifics Inc. 프레이밍햄, MA
스톱워치모든 타이머를 사용할 수 있습니다.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
해부 현미경Zeiss적절한 해부 현미경을 사용할 수 있습니다.
충전된 슬라이드Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeica적절한 cyrostat를 사용할 수 있습니다.
관류 장비 및 해부 기구실험실에는 자체 관류 프로토콜이 있습니다.
불투명 부식 챔버실험실은 불투명 플라스틱 용기를 사용하여 자체 생산할 수 있습니다.
PAP peneGeneTex (USA)왁스 연필 또는 표면 장력을 사용하여 조직 섹션 주위에 웰을 만들 수도 있습니다.
컨포칼 현미경Zeis LSM780적절한 레이저 라인이 있는 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다.
FIJI/Image JNational Institues of Healthfrom www.fiji.sc
이스라엘 #S3023

참고문헌

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
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  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
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  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

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EANP0 180 199

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