RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

요약

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

초록

Osteoclasts 뼈 resorbing 고유는 골의 monocyte/대 식 세포 계보에서 차별화 하는 셀. Osteoclasts의 장애는 뼈 대사 질환, 골다공증 등의 시리즈에 발생할 수 있습니다. 병 적인 뼈 질량 손실의 방지를 위한 제약 목표를 개발 하는 선구자에서 osteoclasts 분화 메커니즘 이해 되어야 한다. 격리 하 고 많은 osteoclasts에서 생체 외에서 문화 능력이 osteoclast 차별화에 특정 한 유전자의 역할을 결정 하기 위해 중요 합니다. Osteoclasts에 복잡 한 1 (TORC1) rapamycin의 포유류/기계적 대상의 비활성화 수 osteoclast 수 감소와 증가 뼈 질량; 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 mTORC1 비활성화 osteoclast 형성에의 영향을 공부 하 고 분리 하 고 마우스 골 수에서 osteoclasts 문화 RANKL 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 일반적으로 1 주일 이내 거 대 한 osteoclasts의 많은 수에서 결과. 랩 터 의 삭제 osteoclast 형성 장애 고 분 비 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소, 그 mTORC1을 나타내는 osteoclast 형성에 대 한 중요 한의 활동을 감소.

서론

뼈는 끊임없이 변화 장기 이며 osteoblasts 그리고 생활 내내 osteoclasts에 의해 개조. Osteoclasts 광물 화 된 매트릭스 재흡수에 대 한 책임은 osteoblasts 합성 하 고 새로운 뼈 매트릭스¹분 비. 뼈 재흡수와 골 형성 사이 균형은 뼈의 유지 보수를 포함 하는 뼈 건강에 중요 한 대량 및 자극과 상해에 대 한 응답. 이 균형을 방해 하는 경우 골다공증 및 치 주 질환을 포함 한 일련의 뼈 대사 질환 발생할 수 있습니다. 이 질병에서 뼈 질량 손해 osteoclastic 뼈 재흡수 osteoblasts^2,3의 능력을 형성 하는 뼈를 초과 합니다. 따라서, 골다공증 같은 골격 질환을 치료 하 제약 목표를 개발 하기 위하여 그것은 생성 및 osteoclasts⁴의 생물학을 이해 하는 중요 한.

Osteoclasts 독특한 거 대 한 multinucleated 세포 나 뼈 표면 근처에 위치 하 고 monocyte/대 식 세포 가족¹에 속한다. Ibbotson K. J. 외.

프로토콜

동물에 관련 된 모든 절차 실험실 동물 케어 (APLAC)에 스탠포드 행정 패널에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행한 및 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 연구소 생화학 및 세포의 승인 생물학입니다.

1입니다. 준비

1. Osteoclast 특정 랩 터 삭제 마우스 (랩 터^{플로리다/플로리다}; 생성 Ctsk-cre, 향후 랩^Ctsk) Ctsk-cre 쥐와 랩 터^{플로리다/플로리다} 쥐를 교배 하 여. 랩 터^{플로리다/플로리다} 마우스를 사용 하 여이 연구에서 WT 컨트롤.
2. 고립 된 뼈를 유지 하는 얼음 용기가 있다.
3. 문화 매체를 준비 합니다.
   1. 최소 필수 중간 알파 (α-MEM) 1 x 글루타민, 페니실린-스와 10% 태아 종 아리 혈 청을 보완 하 여 α-MEM 문화 매체를 준비 합니다.
   2. 골 대 식 세포 유도 매체 20 ng/mL에서 α-MEM 매체와 M-CSF의 50 mL의 구성 된 준비.
   3. Osteoclast 유도 매체....

결과

현재 프로토콜을 사용 하 여, 많은 수의 거 대 한 osteoclasts에 볼 수 있었다 주 6; 거 대 한 osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 차별화의 한 더 날 수 있습니다 (그림 1) 필요. 성공적인 osteoclast 대형 함정 얼룩 (그림 2A)에 의해 확인 됐다. Osteoclasts 이상의 3 핵으로 거 대 한 와인 레드/보라색 셀을 했다. 250 개 이상의 osteoclasts WT BMMs (그림 4A)에서 96 잘 접시의 각 우물에서 얻은 했다.

랩 터 의 삭제는 서쪽 더 럽 히 분석에 의해 확인 되었다, mTORC1의 비활성화는 S6 ribosom.......

토론

Osteoclastogenic 분석 결과 격리 하 고 문화 osteoclasts 생체 외에서^12,13가장 널리 사용 되는 방법 이다. 동안 여러 RANKL 기반 osteoclast inductions 설명된^13,,1415, 현재 연구는 이전 방법에 따라 일부 수정 프로토콜을 설명 합니다.

이전 연구에서 BMMs는 절연^14,15직후 도금 했다. BMMs 중간 엽 줄기 세포를 즉시 접시에 준수는 섬유 아 세포 BMMs를 분리 하는 도금 전에 하룻밤 기본 매체와 경작 했다 하는 것이 좋습니다. M.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Raptorfl/fl 마우스	The Jackson Laboratory	013188
Ctsk-cre 마우스			S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM	Corning	10-022-CVR
글루타민	기비코	25030081
페니실린 스트렙토마이신	Gibico	15140122
태아 송아지 혈청	BioInd	04-001-1A
재조합 마우스 M-CSF 단백질	R& D	Q3U4F9
재조합 마우스 RANKL 단백질	R& D	Q3TWY5
RBC 용해 완충액	Beyotime	C3702
Trypan 블루	시그마-알드리치	302643
아세톤	Shanghai Chemical Co., Ltd.
구연산염 용액	: Sigma-Aldrich	915
포름 알데히드 용액	Shanghai Chemical Co., Ltd.
산성 인산분해효소, 백혈구(TRAP) 키트	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Fast Garnet GBC 기본 용액	Sigma-Aldrich	3872
아질산나트륨 용액	Sigma-Aldrich	914
나프톨 AS-BI 인산염 용액	Sigma-Aldrich	3871
아세테이트 용액	Sigma-Aldrich	3863
주석산염 용액	: Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	Corning	21-031-CVR
L- 타르타르산	, Sigma-Aldrich	251380
주석산 나트륨, 이염기성 탈수,	Sigma-Aldrich	s4797
Glycine	, Shanghai Chemical Co., Ltd.
MgCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd. (영어)
ZnCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd. (주)
NaOH	상하이 화학 Co. Ltd.
인산가수분해효소 기질	Sigma-Aldrich	P4744
항랩터	세포 신호 기술	2280
항-P-리보솜 단백질, S6 (S235/236)	세포 신호 기술	2317
항-리보솜 단백질, S6	세포 신호 기술	2211
항-베타;-액틴	산타크루즈 생명 공학	sc-130300
37% 포름알데히드	Xilong Scientific
폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인	Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)	Millipore	00000367MSDS
IX71	Olympus
Envision	Perkin Elmer
0.45mm 주사기
가위
모기 집게

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