라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

요약

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

초록

기본 cilium 많은 진 핵 세포의 표면에는 microtubule 기반 돌출 이며 포함 단백질의 독특한 보완 기능을 비판적으로 세포 운동 성 및 신호 합니다. 속눈썹 자신의 단백질을 합성 할 수 있다, 이후 약 200 독특한 속눈썹 단백질 cytosol와 기본 속눈썹 사이 매매 될 필요가 있다. 그러나, 그것은 여전히 전송 경로 라이브 기본 속눈썹 현재 존재의 제한 때문에이 단백질의 3 차원 (3D) 위치를 지도에 대 한 기술 도전 기법. 도전을 정복, 최근 우리가 발전 하 고 고속 가상 3D 슈퍼 해상도 현미경 검사 법, 단일 포인트에 지-여기 하위 회절 (속도) 현미경 검사 법의 전송 경로 대 한 3 차원 공간 위치를 결정 하 되 나를 고용 둘 다 cytosolic와 라이브 셀의 기본 속눈썹에 막 단백질. 이 문서에서는, 우리 속도 현미경 검사 법, 형광 단백질 분류 속눈썹 단백질, 라이브 cilium 개별 단백질의 실시간 단일 분자 추적 및 공적을 표현 하는 세포의 준비의 자세한 설치를 선보일 예정 이다 3D 공간 확률의 밀도 속눈썹 단백질에 대 한 전송 노선 지도.

서론

1873 년에 Ernst Abbe를 정한 이후 기존의 가벼운 현미경의 해상도 때문에 객관적인^1,2에서 빛 회절 제한 약 200 nm 될 믿고 되었습니다 있다. 현재, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 기술을 휴식이 제한 하 고 하위 회절 (< 200 nm) 해상도와 동적 이미지 캡처를 허용. 기술은 일반적으로 두 개의 광범위 한 범주로을: 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경 기반으로 접근, 샘플³; fluorophores의 비선형 광학 반응으로 인해 하위 회절 조명 볼륨을 생성 하는 photoactivated 가벼운 현미경 검사 법 (팜) 그리고 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)-지역화 fluorophores의 중심을 다음 reconstitute 이러한 중심 수학 함수를 활용 하는 슈퍼 해상도 기법을 기반으로 양식 슈퍼 해상도 이미지^4,5. 현재, 상대적으로 단순한 광학 설치 인해 손바닥과 폭풍 광범위 하 게 채택 된다만 생물학 준비의 긴 비디오의 각 프레임에 fluorophores의 작은 하위 집합을 활성화 하 여. 이로써 더 정확 하 게 지역화, 형광의 2D 가우스 피팅 하 여 불리 포인트 확산 기능 (PSF), 비디오의 각 프레임에 놓여있는지 표시 된 단백질의. 다음 생물 준비^1,2의 슈퍼 해상도 이미지를 단일 이미지 비행기 각 붙일 표시 된 분자의 2D 위치 위에 수 있습니다. 이러한 단일 분자 지역화 슈퍼 해상도 현미경에 접근을 확실히 생물 샘플의 영상 이었다 수행 하는 방법을 혁명, 아직도 도전을 극복할 수 있다. 예를 들어 폭풍 팜 수 생물 샘플의 고정 후 그들의 최고의 공간 해상도 달성 고 따라서 현재의 붙일 표시 된 단백질의 정적 표현 전자 현미경의 비슷한 제한입니다. 또한, 라이브 셀에 각 붙일 표시 된 단백질에 대 한 높은 공간적 해상도 달성 하기 위해 샘플 해야 될 몇 군데 단백질 역동성을 캡처 수 있는 매우 긴 프레임에. 따라서, 그것은 이러한 주요 기술 장애물을 극복 하기 위해 필요입니다.

라이브 셀에 빠르게 움직이는 단백질 또는 RNAs를 감지 하는 데 적합된 한 높은 spatiotemporal 해상도 얻으려면, 우리가 개발한 슈퍼 해상도 속도 현미경 우리의 실험실 (그림 1)^{6,7, 8}. 속도 현미경에서 몇 가지 주요 기술 발전 이전 성공적으로 작은 분자의 nucleocytoplasmic 전송 추적을 설정한, 단백질 mRNA, 바이러스 핵 아메리카를 통해 기 공 단지 (Npc)^{6, 7 , 8}. 짧게, 속도 현미경의 다음 기능 것입니다 사용을 추적할 수 라이브 셀, Npc 등 기본 속눈썹에에서 서브 마이크로미터 회전 대칭 구조를 통해 빠른 속도로 움직이는 고분자: (1) 한 경사 또는 수직 조명 PSF 수 있습니다 (그림 1); 초점면에서 작은 회절 제한 볼륨 내에서 단일 분자의 여기를 (2) 경사 PSF 크게 밖의 초점 형광을 방지 하 고 따라서 신호 대 잡음 비율을 향상 시킬 수 있습니다. (3) 100-500 kW의 광학 밀도 / cm² 조명 PSF에서에서 빠른 검색 속도 (> 500 Hz)와 단일 fluorophores에서 수집 하는 광자의 수천 수 있습니다. (4) 빠른 탐지 속도 또한 크게 감소 단일 분자 공간 지역화 오류 (< 10 nm) 분자 확산 주요 요인 중 하나입니다 있기 때문에 살아있는 세포에서 형광 성 분자를 이동의 공간 궤도 결정 분자를 이동 하는 것에 대 한 단일 분자 지역화의 결점을 일으키는. (5) 음 2D 3d 변환 알고리즘 NPC 또는 기본 cilium 분자에 대 한 3D 공간 확률 밀도 지도 전송 경로 제공을 통해 있습니다. 그것은 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 조정 시스템 간의 3D 공간 확률 밀도 보다는 3D 지도 단일 분자 추적 (그림 2)를 생성 하는 데 사용은 주목 된다. 이전, 전자 현미경 검사 법 데이터 NPC^9,10 및 기본 cilium¹¹ 둘 다 회전 대칭 구조를가지고 계시 했다. 원칙적으로, 임의로 NPC 또는 기본 cilium 통해 이동 하는 분자 확산 회전 대칭 배포판 또한 있어야 한다. 무작위로 실린더 내부 분자 확산의 높은 숫자 더 결과 대략 균일 한 NPC에 그만큼 횡단면 보기에서 회전 대칭 배포판 생성 그림 2에서 같이, 공간 두 개의 이웃 링 (그림 2E) 사이 각 매우 작은 하위 영역 내에서 배포. 이 균일 한 분포 지도 원통형 시스템에서 θ 차원 공간 분포는 일정. 다음 3 차원 좌표 (R, X, θ) 2D 좌표 (R, X, 상수) 수를 단순 수 있습니다. 사실, 우리의 변환 프로세스는 직교 및 원통형 시스템 간의 2D (R, X, 상수)를 2 차원 (X, Y)에서입니다. 상수 θ, 방정식 A를 사용 하 여 계산 됩니다 그림 2E에서 공간적 밀도 p 말합니다.

궁극적으로, 단일 분자 추적 생물학 연구에서 광범위 한 응용 프로그램은, 따라서, 그것은 자연 기술의 과다 특정 생물 학적 틈새^12,13,14을 채우기 위해 개발 될 것 이다. 이러한 속도 현미경의 경우 이다입니다. 이전에 3D 변환 알고리즘으로 사용할 경우,이 기술은 환승 NPCs, 하위 diffraction 크기와 회전 대칭 생물학 구조⁶통해 분자의 3D 전송 경로 해결 하기 위해 개발 되었다. 이 논문에서는, 기본 속눈썹 우수한 모델 세포도 표시 됩니다. 기본 속눈썹은 대부분 포유류 세포^15,16,17의 표면에서 프로젝트는 원통형, 안테나 모양의 세포 (~ 125 nm radius). 그들은 외부 신호를 수신 하 고 성장 및 대사^15,16와 일반적으로 관련 된 세포내 응답 전송에 대 한 책임이 있습니다. 따라서, 구조 단백질의 플럭스, 막 횡단 수용 체와 세포내 메신저의 전송의 재활용 기본 속눈썹의 중요 한 책임입니다. 셀 몸과 기본 속눈썹 사이 접합에는 전환 영역 또는 TZ,이 통해이 모든 단백질 전송 발생^{11,,1819, 중요 한 선택도 장벽 20}. TZ의 제어 기능 이외에 두 개 이상의 전송 프로세스, intraflagellar 전송 및 수동 확산이 지역^16,21, 를 통해 단백질의 움직임에 대 한 책임 것으로 생각 ²². 인간의 건강 관점에서 기본 속눈썹의 손실 및 다운스트림 신호의 후속 규제 많은 암의 특징입니다. 또한, Bardet-Biedl 증후군, polycystic 신장 질환 등 많은 유전 질환, 불완전 단백질 전송²³와 연결 됩니다. 하위 회절 제한 크기와는 TZ 통해 선택적 단백질 수송의 복잡 한 과정 기본 속눈썹이이 기술에 대 한 주요 대상으로 확인합니다. 이 방법은 종이에 속눈썹 막 횡단 단백질, somatostatin 수용 체 3 (SSTR3)의 추적을 시연할 예정 이다 우리²⁴, 알 렉 사 Fluor 647 IFT, IFT20²⁵, 융합된 GFP 분자와 표시의 구성 요소와 외부 표시.

프로토콜

1. 재고에서 속도입니다 NIH-3T3 세포 준비

1. 실험에 앞서 1.5 주 37 ° C에 녹고 고 3 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 110 mg/mL와 함께 보완으로 25 cm² 셀 문화 플라스 크에 세포를 전송 하 여 냉동된 재고에서 NIH-3T3 세포의 신선한 문화를 복구 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 및 1% 페니실린/스.
2. 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
3. 분할 매 2 일에 대 한 80 %confluency 세포의 세포 주기를 위해 실험 하루 전에 적어도 세 번. 37 ° C에서 2 분 동안 0.25 %trypsin 셀 trypsinize, 트립 신을 발음 하 고 매체의 2 mL와 함께 그것을 대체. 피펫은 반복 셀 클러스터 헤어, 원하는 셀 수를 제거 하 고 미디어의 전체 볼륨을가지고 매체 3 mL를 다시.
   참고: NIH-3T3 NPHP-4, localizes는 TZ²⁶, mCherry에는 C에 융합 단백질을 표현 하기 위해 유전자 설계 이전 했다. mCherry 이다 fluorophore 561 nm 조명을 양적 TZ 선택도 배리어를 지역화 하 고 기본 속눈썹 방향으로 흥분 될 수 있는.
4. 2 일 전에 실험, 접시 35 m m 유리 하단으로 셀 단계 1.1 같은 매체의 1.5 mL와 60-70 %confluency 접시 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다.
5. 하루는 실험 전에 화학적으로 원하는 플라스 미드와 셀 transfect. 500-1000 원하는 플라스 미드의 ng (아래 참고 참조) transfection 시 약 30 분에서 35 Aspirate 미디어에 대 한 항생제 없이 감소 된 혈 청 미디어의 0.25 ml에서 1:2.5 비율에 m m 유리 하단 접시를 혼합 하 고 0.25 mL 플라스 미드 / transfection 시 믹스 플러스 항생제 없이 감소 된 혈 청 미디어의 여분의 1.25 mL. 감소 된 혈 청 미디어 성공적인 transfection를 촉진, 기본 속눈썹 성장 유도를 살려 셀 충분히 실험을 수행 하는 목적을 제공. 다음 날에 실험에 대 한 보육을 셀을 반환 합니다.
   참고: IFT20의 단일 분자 추적을 수행할 때 사용된²⁵는 유전자 변형 IFT20 GFP에의 C에 융합을 포함 하는 플라스 미드. 단일 분자를 수행할 때 SSTR3의 추적 수락자 펩 티 드 (AP) 도메인에는 N에 융합 하는 유전자 변형 SSTR3를 포함 하는 플라스 미드 이며 C terminus GFP 사용된²². SSTR3 구문 이외 biotin 리가 BirA를 포함 하는 플라스 미드를 공동 표현 해야 합니다 및 transfection 미디어 10 µ M biotin으로 보충 해야 합니다. BirA biotin 응급실의 수준에서 새로 합성된 AP-SSTR3-GFP 분자의 AP 도메인에 다음 연결합니다. Alexa647 3 streptavidin에 있는 4 개의 biotin 바인딩 사이트 활용 된 평균 수 있습니다 다음 보완 될 AP-SSTR3-GFP 분자는 셀^{22,27의 외부 표면에 붙일 라벨을 이미징 이전 미디어} . GFP와 AlexaFluor647;이 방법에 사용 됩니다. 그러나, 만약 그들이 마찬가지로 높은 사진-안정성과 양자 항복 다른 형광 프로브를 사용할 수 있습니다.
6. 외부에서 표시 된 SSTR3 구문, 유리 바닥에서 미디어 실험 하기 전에 1 시간을 요리, 세척 5 회 인산 버퍼 (PBS), 염 분의 1 mL와 함께 셀 및 감소 된 혈 청 미디어의 1 mL 1 µ M와 보충 추가 제거를 사용 하는 경우 Alexa647 활용 streptavidin입니다.
7. 실험을 하기 전에 더 이상 15 분 유리 하단 접시에서 미디어를 제거 하 고 5 번 1 mL의 PBS로 레이블이 transfected 세포를 씻어.
8. 이미지 버퍼 (20 mM HEPES, 110mm KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1mm EGTA, pH 7.3)의 1 mL 유리 하단 접시에 놓습니다.
   참고: 이미지 버퍼에 셀은 3 h 보다 더 이상에 대 한 가능한. 따라서, 각 요리에만 2 시간 실험의 수행 됩니다.

2. 속도 현미경 검사 법

참고: 속도 현미경 설치 포함 1.4 나 100 × 기름 침수 apochromatic 목표, 35 mW 633 nm 그-Ne 레이저, 50 mW 고체 488 nm 및 561-nm 레이저, 온-칩 곱셈 이득 거꾸로 형광 현미경 충전 결합 장치 카메라와 데이터 수집 및 처리 (그림 1)에 대 한 현미경 소프트웨어 패키지. 개별 채널 이미징, GFP, mCherry, 및 Alexa647 흥분 488 nm, 561, 또는 633 nm 레이저, 각각. 단일 분자 추적에 대 한 단일 지점 조명 개별 붙일 표시 된 분자를 추적 하는 데 사용 됩니다. Epifluorescence 이미징, 오목 렌즈는 빔 조명 유니폼 분야에 확장 레이저 조명 경로에 배치 됩니다. 형광 방출 동일한 목적에 의해 수집 된, (405/488/561/635) dichroic 필터와 배기 필터 (405/488/561/635), 필터링 및 단일 분자 추적에 대 한 500 Hz 또는 대 한 2 Hz에서 위의 CCD 카메라와 함께 몇 군데 epifluorescence 이미지입니다.

1. 현미경의 단계로 유리 하단 플레이트를 부착 하 고 원하는 구문을 제대로 표현 하는 셀을 찾습니다. 일단 적당 한 셀을 발견 했습니다, 레이저의 단일 지점 조명에 해당 하는 영상 평면에 위치와 함께 기본 속눈썹의 기지에서 NPHP4 mCherry 자리를 맞춥니다.
2. Epifluorescence NPHP4-mCherry IFT20-GFP 및 AP-SSTR3-GFP 디지털 현미경 소프트웨어 패키지를 사용 하는 경우 "포커스 컨트롤" 창의 "카메라" 탭에서 "스냅" 기능을 사용 하 여 이미지를 캡처합니다 ( 재료의 표참조).
   참고:이 이미지는 이후 단일 분자 위치에 대 한 참조로 작동할 것 이다.
3. 참조 이미지는 얻은 로컬 레이블이 단일 분자의 농도 줄일 수 있습니다. 사진-블리치 20에 대 한 1 mW 레이저 조명 TZ s 또는 형광 강도 배경 형광의 가까이까지.
   참고: 때 정확한 농도 통제 될 수 있다, 0.1-1 nM 단일 분자를 레이블이 사용 됩니다.
4. 단일 분자 추적에 대 한 준비, 레이저 조명 전력 ~0.15 mW GFP와 함께 표시 하는 단일 분자 또는 분자 Alexa647 표시에 대 한 ~0.5 mW를 줄일 수 있습니다.
5. 최대한 빨리 레이저 파워 및 이미징 매개 변수 설정, 최대 이득 및 강화 및 2 ms 프레임 속도, 단일 분자 이미징, 적절 한 조명 레이저 고 비-photobleached, 그들은 이송으로 단일 분자를 표시 기록 통해 "포커스 컨트롤" 창의 "카메라" 탭에서 "스트림" 버튼을 클릭 하 여 TZ의 photobleached 지역.
   참고: 비디오의 2 분 더 이상 무시할 수준으로 속눈썹 드리프트의 효과 최소화 하기 위해 캡처할 수 해야 합니다.
6. 단일 분자 비디오를 캡처 후 정확 하 게 중심의 관심 (아오이)의 각 단일 분자의 여기 PSF 포괄 영역에서 localizes Gelles 랩, 망원경 등의 2D 가우스 피팅 알고리즘을 사용 하 여 비디오를 처리 합니다.
7. 모든 단일 분자 위치 정밀도를 선택 < 10 nm 단일 분자 위치 2D 가우스 기능 장착의 분포에 따라 속눈썹의 센터 수정.
   참고: 사용 하 여 2D 3D 변환 알고리즘, IFT20-GFP와 AP SSTR3 노선의 3D 전송 노선 명확 하 게 표시 됩니다 속눈썹 또는 속눈썹 axonemal 막에 각각.

3입니다. 2D 3D 변환

1. 일단 몇 천 지역화는 cilium에서 분자 (신호 소음 비율 > 11를) 환승에 대 한 수집, X 차원으로는 cilium의 긴 축을 선택 합니다. 위치 Y 차원 히스토그램을 확인 하 고 10 nm 단위로 빈 합계를 얻을.
   참고: 2D 3D 변환 손 또는 어떤 소프트웨어 또는 프로그래밍 언어에 의해 평가 될 수 있습니다. 저자는 성공적으로 Matlab에 파이썬 2.7 변환을 구현 했습니다.

결과

이 섹션에서는 기본 속눈썹의 TZ SSTR3 Alexa647 하 ~ 15 nm 외부 링커로 연결의 전송 경로 연구에 속도 현미경 수행에서 얻은 데이터를 보여 줍니다 (그림 3A). 그것은 3D 변환 알고리즘을 확인 하는 이중 목적을 제공 합니다. Alexa647은 레이블 기본 cilium 따라서, 3D 수송 루트의 외부 표면 그 위치에서 고밀도 전송 경로 공개 해야만 한다. NIH-3T3 안정적으로 표현 하는 NPHP3-mCherry는 TZ에는 AP-SSTR3-GFP와 페 고 incubated streptavidin 활용 된 Alexa647와 위의 프로토콜에 따라 해야 합니다. MCherry 라벨의 넓은 필드 이미징은 GFP 셀 원하는 SSTR3 구문 표현 했다 보장 하기 위해 사용 하는 동안에 TZ를 지역화 하는 데 사용 됩니다. 또한 633 nm 광원을 사용 하 여 Alexa647 라...

토론

이 프로토콜 속도 현미경의 기본 cilium, 셀룰러 신호 세포 기관이 매우 효율적인 단백질 수송에 의존 하는 응용 프로그램을 설명 합니다. 속도 현미경 단일 지점 조명은 TZ에 중심을 통과 높은 해상도 (< 10 nm) 위치 붙일 표시 된 분자를 제공할 수 있습니다. 이전 그것은 전인대^6,,78매매 단백질 연구에 적용 되었다. 그러나, 그것은 어떤 하위 회절 셀룰러 구멍을 통해 밀매 공부를 확장할 수 있습니다. 이 기술은 장점이 다른 고해상도 이미징 기술을 통해 공간 및 시간 해상도 라이브 셀 시스템에서 단일 단백질 수송의 역학을 캡처할 수 있는 < 10 nm 그리고 < 2 ms, 각각. 또 다른 장점은 이다 하나만 붙일 레이블 관심사의 단백질을 해야 합니다 transfection, 단백질 지 방화, 속도 현미경을 수행 하려면 공부 하는 일반적인 분자 생물학 접...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25 cm2 조직 배양 접시	Corning	VV-01936-00
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFisher	15140122
소 태아 혈청	ThermoFisher	10438018
DMEM	ThermoFisher	10566-016
OPTIMEM	ThermoFisher	31985062
트립신	ThermoFisher	25300054
인산염 완충 식염	Sigma-Aldrich	P3813-1PAK
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
35mm 유리 바닥 접시	MatTek	P35GCOL-0-14-C
AlexaFluor 647-conjugated streptavidin	ThermoFisher	S21374
비오틴	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
633 nm He-Ne 레이저	Melles Griot	25-LHP-928-249
561 nm 고체 상태 레이저	Coherent	OBIS 561-50 LS
488 nm 고체 상태 레이저	Coherent	1185053
반전 형광 현미경	Olympus	IX81
1.4-NA 100× 오일 이멀젼 아포크로매틱 대렌즈	Olympus	UPLSAPO 100&회;
온칩 곱셈 이득 전하 결합 장치 카메라	Roper Scientific	Cascade 128+
Dichroic 필터	Semrock	Di01- R405/488/561/635-25x36
방출 필터	Semrock	NF01-405/488/561/635-25X5.0
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