라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

요약

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

초록

기본 cilium 많은 진 핵 세포의 표면에는 microtubule 기반 돌출 이며 포함 단백질의 독특한 보완 기능을 비판적으로 세포 운동 성 및 신호 합니다. 속눈썹 자신의 단백질을 합성 할 수 있다, 이후 약 200 독특한 속눈썹 단백질 cytosol와 기본 속눈썹 사이 매매 될 필요가 있다. 그러나, 그것은 여전히 전송 경로 라이브 기본 속눈썹 현재 존재의 제한 때문에이 단백질의 3 차원 (3D) 위치를 지도에 대 한 기술 도전 기법. 도전을 정복, 최근 우리가 발전 하 고 고속 가상 3D 슈퍼 해상도 현미경 검사 법, 단일 포인트에 지-여기 하위 회절 (속도) 현미경 검사 법의 전송 경로 대 한 3 차원 공간 위치를 결정 하 되 나를 고용 둘 다 cytosolic와 라이브 셀의 기본 속눈썹에 막 단백질. 이 문서에서는, 우리 속도 현미경 검사 법, 형광 단백질 분류 속눈썹 단백질, 라이브 cilium 개별 단백질의 실시간 단일 분자 추적 및 공적을 표현 하는 세포의 준비의 자세한 설치를 선보일 예정 이다 3D 공간 확률의 밀도 속눈썹 단백질에 대 한 전송 노선 지도.

서론

1873 년에 Ernst Abbe를 정한 이후 기존의 가벼운 현미경의 해상도 때문에 객관적인^1,2에서 빛 회절 제한 약 200 nm 될 믿고 되었습니다 있다. 현재, 슈퍼 해상도 가벼운 현미경 검사 법 기술을 휴식이 제한 하 고 하위 회절 (< 200 nm) 해상도와 동적 이미지 캡처를 허용. 기술은 일반적으로 두 개의 광범위 한 범주로을: 자극 방출 소모 (호텔 위치) 현미경 기반으로 접근, 샘플³; fluorophores의 비선형 광학 반응으로 인해 하위 회절 조명 볼륨을 생성 하는 photoactivated 가벼운 현미경 검사 법 (팜) 그리고 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)-지역화 fluorophores의 중심을 다음 reconstitute 이러한 중심 수학 함수를 활용 하는 슈퍼 해상도 기법을 기반으로 양식 슈퍼 해상도 이미지^4,5. 현재, 상대적으로 단순한 광학 설치 인해 손바닥과 폭풍 광범위 하 게 채택 된다만 생물학 준비의 긴 비디오의 각 프레임에 fluorophores의 작은 하위 집합을 활성화 하 여. 이로써 더 정확 하 ....

프로토콜

1. 재고에서 속도입니다 NIH-3T3 세포 준비

1. 실험에 앞서 1.5 주 37 ° C에 녹고 고 3 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 110 mg/mL와 함께 보완으로 25 cm² 셀 문화 플라스 크에 세포를 전송 하 여 냉동된 재고에서 NIH-3T3 세포의 신선한 문화를 복구 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 및 1% 페니실린/스.
2. 5% CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
3. 분할 매 2 일에 대 한 80 %confluency 세포의 세포 주기를 위해 실험 하루 전에 적어도 세 번. 37 ° C에서 2 분 동안 0.25 %trypsin 셀 trypsinize, 트립 신을 발음 하 고 매체의 2 mL와 함께 그것을 대체. 피펫은 반복 셀 클러스터 헤어, 원하는 셀 수를 제거 하 고 미디어의 전체 볼륨을가지고 매체 3 mL를 다시.
   참고: NIH-3T3 NPHP-4, localizes는 TZ²⁶, mCherry에는 C에 융합 단백질을 표현 하기 위해 유전자 설계 이전 했다. mCherry 이다 fluorophore 561 nm 조명을 양적 TZ 선택도 배리어를 지역화 하 고 기본....

결과

이 섹션에서는 기본 속눈썹의 TZ SSTR3 Alexa647 하 ~ 15 nm 외부 링커로 연결의 전송 경로 연구에 속도 현미경 수행에서 얻은 데이터를 보여 줍니다 (그림 3A). 그것은 3D 변환 알고리즘을 확인 하는 이중 목적을 제공 합니다. Alexa647은 레이블 기본 cilium 따라서, 3D 수송 루트의 외부 표면 그 위치에서 고밀도 전송 경로 공개 해야만 한다. NIH-3T3 안정적으로 표현 하는 NPHP3-mCherry는 TZ에는 AP-SSTR3-GFP와 페 고 incubated streptavidin 활용 된 Alexa647와 위의 프로토콜에 따라 해야 합니다. MCherry 라벨의 넓은 필드 이미징은 GFP 셀 원하는 SSTR3 구문 표현 했다 보장 하기 위해 사용 하는 동안에 TZ를 지역화 하는 데 사용 됩니다. 또한 633 nm 광원을 사용 하 여 Alexa647 라.......

토론

이 프로토콜 속도 현미경의 기본 cilium, 셀룰러 신호 세포 기관이 매우 효율적인 단백질 수송에 의존 하는 응용 프로그램을 설명 합니다. 속도 현미경 단일 지점 조명은 TZ에 중심을 통과 높은 해상도 (< 10 nm) 위치 붙일 표시 된 분자를 제공할 수 있습니다. 이전 그것은 전인대^6,,78매매 단백질 연구에 적용 되었다. 그러나, 그것은 어떤 하위 회절 셀룰러 구멍을 통해 밀매 공부를 확장할 수 있습니다. 이 기술은 장점이 다른 고해상도 이미징 기술을 통해 공간 및 시간 해상도 라이브 셀 시스템에서 단일 단백질 수송의 역학을 캡처할 수 있는 < 10 nm 그리고 < 2 ms, 각각. 또 다른 장점은 이다 하나만 붙일 레이블 관심사의 단백질을 해야 합니다 transfection, 단백질 지 방화, 속도 현미경을 수행 하려면 공부 하는 일반적인 분자 생물학 접.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25 cm2 조직 배양 접시	Corning	VV-01936-00
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFisher	15140122
소 태아 혈청	ThermoFisher	10438018
DMEM	ThermoFisher	10566-016
OPTIMEM	ThermoFisher	31985062
트립신	ThermoFisher	25300054
인산염 완충 식염	Sigma-Aldrich	P3813-1PAK
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
35mm 유리 바닥 접시	MatTek	P35GCOL-0-14-C
AlexaFluor 647-conjugated streptavidin	ThermoFisher	S21374
비오틴	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
633 nm He-Ne 레이저	Melles Griot	25-LHP-928-249
561 nm 고체 상태 레이저	Coherent	OBIS 561-50 LS
488 nm 고체 상태 레이저	Coherent	1185053
반전 형광 현미경	Olympus	IX81
1.4-NA 100× 오일 이멀젼 아포크로매틱 대렌즈	Olympus	UPLSAPO 100&회;
온칩 곱셈 이득 전하 결합 장치 카메라	Roper Scientific	Cascade 128+
Dichroic 필터	Semrock	Di01- R405/488/561/635-25x36
방출 필터	Semrock	NF01-405/488/561/635-25X5.0
슬라이드북 6.0	Intelligent Imaging Innovations		디지털 현미경 소프트웨어

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