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방법 논문

풍선-기반 부상 마우스 복 부 대동맥에서 Myointimal 증식을 유도 하

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56477

⸱

2018년 2월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University Heart Center, 2Department of Surgery, Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University of California San Francisco (UCSF), 3Cardiovascular Research Center (CVRC) and DZHK German Center for Cardiovascular Research, 4Cardiovascular Surgery, University Heart Center

이 논문에서

요약

이 문서에서는 대동맥 풍선 부상 후 murine 모델 myointimal 증식 (수소)의 개발 연구를 보여줍니다.

초록

동물 모델의 사용은 수소, 동맥 협 착 증에 대 한 하나의 주요 원인의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 이 문서에서는, 큰 동물에 설립된 선박 부상 모델 비교는 murine 풍선 노출 모델을 설명 합니다. 풍선 카 테 터 대동맥 노출 모델 임상 설정을 모방 하 고 유사한 pathobiological 및 생리 적 변화를 리드. 간단히, 대동맥 abdominalis에 수평 절 개 후, 풍선 카 테 터 혈관에 삽입, 팽창, 고 됩니다 retrogradely 소개. 풍선의 인플레이션 intima 상해 및 선박의 overdistension 이어질 것입니다. 카 테 터 제거 후 대동맥 절 개 한 stiches 함께 종료 됩니다. 이 문서에 표시 된 모델은 재현, 수행, 쉬운 및 신속 하 고 안정적으로 설정할 수 있습니다. 그것은 특히 비싼 실험 치료제, 경제적인 방식으로 적용 될 수 있는 평가 적합 합니다. 다른 녹아웃 마우스 종자를 사용 하 여 수소 개발에 다른 유전자의 영향 평가 될 수 있다.

서론

동맥 협 착 증 관상 동맥 및 주변 동맥에 병 적 상태와 환자1의 사망률에 큰 효과가 있다. 1 기본 병 적인 메커니즘은 myointima 증식 (MH), 증가 확산, 마이그레이션, 및 혈관 평활 근 세포 (SMC)2에서 세포 외 기질 단백질의 합성에 의해 특징입니다. SMC는 선박의 미디어 계층에 있으며 루멘의 표면에 자극에 따라 마이그레이션할. 물질로 신호 등 성장 인자, cytokines, 셀 연락처, 지질, 기질 구성 요소, 기계적 전단 고 힘3,4,,56을 스트레칭. 부상 병 적인 또는 의원 성, 혈관 벽의 내 피 세포 및 평활 근 세포 손상 원인 및 염증 성 반응, 자극 고 따라서 수소7.

다른 동물 모델 동맥 상해 및 myointima 증식 연구를 현재 사용할 수 있습니다. 큰 동물 같은 돼지 또는 개 인간과 유사한 동맥 및 관상 동맥 해부학을 공유의 장점은 특히 혈관 기술, 절차, 및 장치8조사 연구에 적합. 그러나, 돼지 모델 개 하나만 배 부상11가벼운 응답 하는 동안 더 높은 thrombogenicity9,10, 단점이 있다. 또한, 모든 큰 동물 모델 특별 한 주택, 장비, 및 직원, 높은 비용으로 연결 되 고 항상 기관에 제공 하지 않습니다 필요 합니다. 작은 동물 모델에는 쥐와 쥐 포함 됩니다. 쥐에 비해, 쥐 있고 저렴 한 비용의 장점 다양 한 모델에 밖으로 노크의 존재. 이 비디오에서 설명 하는 모델 ApoE-/-생쥐 서양 다이어트 먹이 밀접 하 게 혈관 동맥 경 화성 혈관12의 임상 설정 모방 하 결합 될 수 있다. 이전 모델 유도 철사 부상13, 액체 건조14,15봄 또는 팔목 부상16통해 혈관 상해. 상해의 자연 크게 개발 및 수소의 헌법에 영향을 미칠 것 이다, 혈관 상해를 유발 하는 풍선 카 테 터를 사용 하 여 이므로 임상 설정을 모방 하는 가장 좋은 방법은.

이 문서에서 우리는 쥐에서 풍선 카 테 터와 수소를 유도 하는 소설 방법을 설명 합니다. 풍선 카 테 터 (1.2 m m x 6 m m) RX 포트 (그림 1A)와 함께 사용 하면 된다고 내 층의 하 고, 동시에, 선박에의 한 overdistension의 유도에 있습니다. 이러한 요소 둘 다는 MH의 개발에 대 한 중요 한 트리거입니다. 이 모델에 대 한 관측 시간 28 일17이다.

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프로토콜

동물은 실험실 동물의 원칙에 대 한 가이드 준수 인도적인 치료를 받은 하 고 준비 하 여 연구소의 실험 동물 자원, 건강의 국가 학회에 의해 출판. 모든 동물 프로토콜 ('Amt에 Gesundheit und Verbraucherschutz, 타트 (건강 및 소비자 보호를 위한 사무실) 함부르크') 책임 있는 지방 기관에 의해 승인 되었다.

1. 카 테 터 준비

참고: 카 테 터에 관한 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

  1. 카 테 터 홀더에서 카 테 터를 가져가 라.
  2. 밖으로 원심 포트를 통해 루멘에서 guidewire를 당겨.
  3. 카 테 터의 원심 끝에 cyanoacrylate 접착제 한 방울 넣어.
    주의: 라텍스 또는 니트 릴 장갑을 착용 한다.
  4. 카 테 터의 RX 포트에는 guidewire를 놓고 원심 포트 루멘을 통해 사전. 나중에, 당겨는 guidewire 다시 약간 공간을 두도록 ~ 5 mm의 끝에.
  5. 접착제를 건조 수 있도록 5 분 기다립니다.
  6. guidewire를 이동, 수정 되어야 합니다. 그것은 여전히 모바일, 단계 1.3-1.6을 반복 합니다.
  7. 1.5 mL 0.9% 식 염 수로 3 mL 주사기를 풍선 인플레이션 포트에 연결.
  8. 풍선 인플레이션 테스트 주사기 플런저를 밀어. 두고 0.6 mL 주사기에 식 염 수 있습니다.

2. 마우스 준비

  1. 14 주 약 30 g 무게의 나이에 남성 쥐를 얻을.
    참고: 우리는 동물 실험실 동물 연구소에서 얻은 사용 합니다. 우리 여기 C57BL/6J 사용.
  2. 유도 챔버를 사용 하 여 2.0-2.5 %isofurane (500 mL/min 산소 유량)와 마우스를 anaesthetize.
  3. 생리대에 그것의 뒤에 마우스를 놓고 마우스의 코 및 입 안 면 마 취 유지 합니다. 뒷 다리와 꼬리를 반사의 부재를 확인 곤란 하 여 마 취의 충분 한 깊이를 확인 합니다.
  4. 헤어 트리머를 사용 하 여 복 부 머리를 제거 합니다.
  5. 뒷 다리를 확산 하 고 수정 테이프를 사용 하 여 그들의 위치.
  6. Povidone-요오드, 뒤에 80% 에탄올을 사용 하 여 복 부 영역을 치료. 두 번 이상이 단계를 반복 합니다.
  7. 외과 용 드 레이프를 사용 하 여 수술 부위의 오염 얻이 되지 않습니다 보장 하기 위해. 따라 피부와 근육 층을 열고는 교육 알바 복 부 장기 노출 시저 (또는 메스).
  8. 0.9% 염 분 촉된 장갑에 내장을 그들을 축축한 유지로.
  9. 두 개의 미세 집게를 사용 하 여 복 부 대동맥 위에 지방 조직을 제거.
  10. 인슐린 주사기 (30 G)를 사용 하, 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)에 250 µ L 덤플링 솔루션 (50 U/mL)의 주입 하 고 그것의 조직 분포에 대 일 분을 기다릴. 헤 파 린 hemostasis 억제 하 고 수술 하는 동안 원하지 않는 응고 방지.
  11. 두 개의 집게를 사용 하 여 그것의 분기와 그 보내는 분기 선박 infrarenal 대동맥 해 부.
  12. 높은 온도 cauterizer와 클램핑 된 지역에 배치 될 것으로 예상 된다 하는 쪽 배 선
  13. 신장 동맥 바로 아래 infrarenal 대동맥 클램핑 함으로써 혈액의 흐름을 중지.
  14. 두 번째 클램프 바로 위에 대동맥 분기 원심 위치에 놓습니다.
  15. 작은 가로 절 개를 그릇에 따라 클램프의 중간에가 위를 사용 하 여 수행 합니다.
    참고: 절 개의 크기 배 둘레의 1/3에 해당 해야 합니다.
  16. 절 개에 (30 G) 바늘으로 주사기를 삽입 하 고 250 µ L 덤플링 솔루션 (50 U/mL)와 대동맥을 플러시.
  17. 10-0 봉합을 사용 하 여, 절 개의 각 측면에 하나의 단일 매듭을 배치 합니다.
  18. 절 개 배 확장기를 삽입 하 여 대동맥 팽창 하 고 약간 배를 확산. 팽창 2 ~ 3 회 반복 합니다.
  19. 0.9% 식 염 수와 풍선 카 테 터를 보습.
  20. 대동맥으로 평면화 된 풍선 카 테 터를 삽입 하 고 대동맥에 인접 클램프 승급.
  21. 근 위 클램프에 도달, 신중 하 게 인접 클램프 열고 ~0.6 mL 식 염 수를 주입 하 여 혈액 누출을 방지 하기 위해 풍선을 부 풀 려.
    참고: 혈관을 팽창 된 풍선의 비율은 1.5:1 이다.
  22. 약 2 cm 역행 카 테 터를 사전.
  23. 확장 된 카 테 터, 주사기를 방출 하 여 약간 풍선 deflating 동안 당겨.
  24. 카 테 터 대동맥의 절 개를 도달할 때 인접 클램프를 다시 연결 합니다. 풍선을 완전히 빼 다 고 그것을 제거 합니다.
  25. 250 µ L 덤플링 솔루션 (50 U/mL)와 대동맥 30 G 주사기를 사용 하 여 린스 합니다.
  26. 10-0 봉합을 사용 하 여 대동맥 절 개를 닫습니다. 장소는 복 부 쪽에 하나 또는 두 개의 바늘 뒤 측면 양쪽에 바늘을 중단.
  27. 원심 클램프를 엽니다. 출혈, 경우 클램프 다시 닫고 추가 바늘을 배치 합니다.
  28. 신중 하 게 인접 클램프를 엽니다.
  29. 그것을 지원 하 고 어떤 출혈을 멈추게 하는 봉합에 두 개의 면봉을 배치 합니다.
  30. 그것을 유지 하기 위해 봉합에 흡수 hemostats를 놓습니다.
    참고: 대동맥 펄스 distally 절 개에서에서 표시 되어야 합니다.
  31. 내장 복 부에 다시 놓습니다.
  32. 된 37 ° c에 미리 데워 살 균 0.9% 식 염 수와 복 부 구멍을 씻어
  33. 6-0 실행 봉합을 사용 하 여 복 부 근육 레이어를 닫습니다.
  34. 5-0 실행 봉합 피부를 닫습니다.
  35. 마우스를 허용 하기 전에 Carprofen 4-5 mg/kg을 피하 주사. 그것은 식을 얻고 있다 때까지 동물을 모니터링, sternal recumbency를 유지. 동물 혼자 장에 계속 완전 한 회복.
  36. 3 일에 대 한 진통제로 서 식 수 (50 mg/100 mL)에 Metamizole를 추가 하 고 매일 동물을 모니터링. 일반적으로 달콤한 처럼 마우스 metamizole의 맛 하 고는 수술 후 즉시 마시는 시작 합니다. 선호 하는 경우 metamizole 대신 지속 릴리스 에이전트를 사용할 수 있습니다.
    참고:이 모델에 대 한 관찰 기간은 28 일입니다.

3입니다. histopathology

  1. 28 일 후 풍선 부상 대동맥을 수확 단계 2.2 2.9에서에서 설명한 대로 쥐를 준비 하 여.
  2. 가 위를 사용 하 여 풍선 부상 대동맥 (분기 신장 혈관 위에 0.3 m m 사이)를 제거 하 고 그것의 심 혼을 절단 하 여 마우스를 안락사.
  3. 0.9%로 선박의 루멘 플러시 NaCl.
  4. 밤새 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 수확된 한 배를 해결 하 고 5 시간 동안 2 시간, 2 시간, 1 시간에 80% 에탄올, 95% 에탄올에 대 한 70% 에탄올으로 시작 하는 에탄올과 100% 에탄올의 농도 증가에 탈수. 그런 다음, 품 어 크 실 렌에 샘플 2 시간 동안 3 번 샘플 파라핀을 침투 하기 전에.
    참고: 0.9% 수확된 배를 내리는 대신 NaCl, 4%와 플러시 수 PFA.
    주의: PFA 및 크 실 렌 독성이 있으며 특별 한 관리와 처리 해야 합니다.
  5. 파라핀에 샘플을 포함 하 고 있는 톰을 사용 하 여 5 µ m 두께의 조각으로 잘라.
  6. 3 시간 5 분 동안 크 실 렌과 슬라이드를 deparaffinize.
  7. 에탄올의 감소 시리즈를 사용 하 여 조직 슬라이드 리하이드레이션 2 시간 5 분, 3 분 95%, 80%, 70% 에탄올의 뒤에 100% 에탄올으로 시작 합니다.
  8. 슬라이드 설명된18로 Masson의 trichrome 얼룩과 얼룩.
  9. 2 시간 10 분 대 한 100% 에탄올에 얼룩진된 슬라이드를 탈수. 2 시간 10 분 대 한 자일 렌을 하 고 설치 매체에 탑재.
  10. 밝은 분야 현미경 슬라이드를 볼. 5 배 확대와 0.12의 숫자 조리개와 렌즈를 사용 하 여 개요 그림 이나 자세한 관찰을 위해 0.35의 숫자 조리개와 20 x 확대와 렌즈에 대 한.

4. 면역 형광 검사 현미경 검사 법

  1. 에탄올의 감소 시리즈를 사용 하 여 조직 슬라이드 리하이드레이션 2 시간 5 분, 3 분 95%, 80%, 70% 에탄올의 뒤에 100% 에탄올으로 시작 합니다.
  2. 20 분 동안 증기선에서 항 원 복구 솔루션에 슬라이드를가 열 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.
  3. 실내 온도 아래로 슬라이드 식 지.
  4. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 3 시간 동안 슬라이드를 씻은 후 30 분에 대 한 섹션에 항 원을 차단 솔루션을 적용.
  5. PBS 가진 5 분에 대 한 세 번 슬라이드를 씻어.
  6. 1 차적인 항 체 희석제에 희석 주 항 체와 섹션을 품 어.
    참고: 적절 한 농도 및 부 화 시간 각 항 체에 대 한 개별적 선택 되어야 한다.
  7. 슬라이드 언바운드 항 체를 제거 하는 PBS 가진 5 분 동안 세 번 씻는 다.
  8. 이차 항 체 희석제에 희석 사전 활용 된 이차 항 체와 섹션을 품 어.
    참고: 적절 한 농도 및 부 화 시간 각 항 체에 대 한 개별적 선택 되어야 한다.
  9. 5 분에 대 한 슬라이드 세 번 세척 하 여 언바운드 항 체를 제거 합니다.
  10. 15 분; 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용 하 여 셀 핵 counterstain 최종 DAPI 농도 350 이어야 한다 nM.
  11. 면역 형광 검사 솔루션 장착 호환에 슬라이드를 탑재 합니다.
    참고: 잘못 설치 솔루션을 사용 하 여 형광 신호를 모호한 수 있습니다.
  12. 형광 현미경 슬라이드를 볼. 1.3 숫자 조리개와 40 x 확대 렌즈를 사용 합니다.

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결과

풍선 노출은 쥐에 있는 수소의 개발 연구에 적합 한 모델. 동물 수술에서 잘 복구와 우수한 건강 상태 후 작업을 표시 합니다. 우리는 수술으로 인해 3% 사망률 보다 적은 50 쥐에이 모델을 설립. 그림 1B -C 키 수술 단계를 보여줍니다. 따라 피부 절 개 후는 교육 알바, 대동맥 abdominalis식별. Microsurgical 클램프 (그림 1B)를 배치 합니다. 대동맥의 한가운데에 작은 절 개, 배와 역행 하는 혈액의 흐름 (그림 1C)의 방향에 대 한 슬라이드에 풍선 카 테 터를 설정. 팽창 된 풍선의 운동 된다고 intima의 하 고, 동시에, 그릇의 overdistension에 이끌어 낸다. 대동맥 절 개 한 stiches 함께 종료 ...

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토론

이 문서는 myointimal 증식 개발 연구는 murine 모델을 보여 줍니다 고 기본 병 적인 프로세스의 탐사와 새로운 약물 이나 치료 옵션의 테스트 수 있습니다.

이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 대동맥의 노출입니다. 으로 과도 한 노출 동맥 류 형성과 모델 실패 이어질 것입니다이 단계 동안 특별 한 주의 지불 합니다. 다른 한편으로, 노출 충분히 수행 됩니다, 너무 작은 myointima 개발할 것입니다. 따라서, 노출의 강도 결과이 동물 모델의 성공에 결정적 이다.

수술 절차에 관하여 그릇의 두 벽 선박 patency의 초기 실패에 발생할 수 있습니다 stiches를 설정 하 여 관통 하지는 중요 하다. 우리는 우리가 쥐18의 복 부 대동맥에서 혈관 협 착 증을 유발 하는 마우스 모델을 설명 이전 했습니다. 그러나,이 고 대부분의 다른 모델만 제공 매우 적은 양의 조직 분석에 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 그녀의 기술 지원에 대 한 크리스티안 Pahrmann 감사합니다.

D.W. 최대 kade 수 있다 재단에 의해 지원 되었다. T.D. 받은 보조금 다른 Kröner Fondation (2012_EKES.04)와 도이치 가운데 (DE2133/2-1_. S. S. 도이치 가운데 (DFG;에서 연구 보조금을 받은 SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10-0 Ethilon 봉합사Ethicon2814G
3 mL 주사기BD 의료309658
37% HClSigma-AldrichH1758
5-0 프롤렌 봉합사EthiconEH7229H
6-0 프롤렌 봉합사 Ethicon8706H
산성 FuchsinSigma-AldrichF8129-25G삼색 염색
항원 회수 용액DakoS1699
AzophloxinWaldeck1B-103삼색 염색
Bepanthen 눈과 코 연고Bayer1578675Eye 연고
Betadine 용액Betadine Purdue PharmaNDC : 67618-152
C57BL / 6JCharles River재고 번호 000664
클램프 애플리케이터Fine Science Tools18056-14턱 치수: 4 x 0.75 mm 길이 : 13 mm
콜라겐 3abcamab7778항체
DAPIThermo FischerD1306
당나귀 안티 염소 IgG AF555InvitrogenA214322 차 항체
당나귀 안티 Rabbit IgG AF488InvitrogenA212062 차 항체
당나귀 안티 토끼 IgG AF488InvitrogenA110552 차 항체
: 당나귀 anti-Rabbit IgG AF555InvitrogenA315722 차 항체
: 에탄올 70 %Th. Geyer: 2270
에탄올 : 96 %Th. Geyer: 2295
에탄올 절대Th. Geyer2246
FAPabcamab28246항체
집게 미세과학 도구11251-20
집게 표준Fine Science Tools11023-10
빙하 아세트산Sigma-Aldrich537020
이발기WAHL8786-451A ARCO SE
HeparinRotexmedicaPZN 386234025.000 IE/mL
고온 소작 키트Bovie18010-00
Image-iT FX Signal EnhancerInvitrogenI36933차단 솔루션
Light Green SFWaldeck1B-211Trichrome staining
Microsurgical clampFine Science Tools18055-04Micro-Serrefine - 4mm
MINI TREK 관상동맥 확장 카테터 1.20 mm x 6 mm / Rapid-ExchangeAbbott1012268-06U
몰리브다토인산 수화물Merck1.00532.0100Trichrome staining
NaCl 0,9%B.BraunPZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
바늘 홀더Fine Science Tools12075-14
NovaminsulfonRatiopharmPZN 03530402Metamizole
Orange GWaldeck1B-221Trichrome staining
ParaffinLeica biosystemsREF 39602004
PBS pH 7,4Gibco10010023
PFA 4%전자 현미경 과학#157135S
Ponceau S 용액Serva 전기영33427트리크롬 염색
1차 항체 희석제DakoS3022
Prolong Gold Mounting solutionThermo FischerP36930면역형광 염색 슬라이드용 장착 솔루션
교체 가능한 미세 팁BovieH101
Resorcin-Fuchsin WeigertWaldeck2E-30Trichrome staining
RimadylPfizer400684.00.00Carprofen
가위Fine Science Tools14028-10
가위 Vannas 스타일Fine Science Tools15000-03
2차 항체 희석제DakoS0809
속효성 접착제 MINIS 3x1gUHU45370시아노아크릴레이트
슬라이드 랙Ted Pella21057
SM22abcamab10135항체
SMAabcamab21027항체
염색 접시Ted Pella21075
수술 현미경LeicaM651
Tabotamp fibrillarEthicon431962흡수성 지혈
Transpore 수술 테이프3M1527-1
U-100 인슐린 주사기BD 의료324825
용기 확장기미세 과학 도구18603-14
Vitro-CludLangenbrinck04-0001
Weigerts 철 헤마톡실린 키트Merck1.15973.0002트리크롬 염색
XyleneTh. Geyer3410
동 구

참고문헌

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  4. Majesky, M. W., Schwartz, S. M. Smooth muscle diversity in arterial wound repair. Toxicol Pathol. 18 (4 Pt 1), 554-559 (1990).
  5. Owens, G. K. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev. 75 (3), 487-517 (1995).
  6. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
  7. Kleemann, R., Zadelaar, S., Kooistra, T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res. 79 (3), 360-376 (2008).
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  10. Mason, R. G., Read, M. S. Some species differences in fibrinolysis and blood coagulation. J Biomed Mater Res. 5 (1), 121-128 (1971).
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  17. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artif Organs. 15 (2), 103-118 (1991).
  18. Stubbendorff, M., et al. Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models. J Vis Exp. (87), e51459(2014).
  19. Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).

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