방법 논문

생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

DOI:

10.3791/56499

⸱

2018년 1월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1UMR E-4320 TIRO-MATOs CEA/DRF/BIAM, Université Nice Sophia-Antipolis, 2UMR 7272 Institut de Chimie de Nice CNRS, Université Nice Sophia-Antipolis, 3CEA, Direction de la Recherche Fondamentale (DRF), Biosciences and Biotechnologies Institute (BIAM)

이 논문에서

요약

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우라늄은 골 대사에 영향을 미칠으로 알려져 있다. 여기, 선물이 생존, 분화, 및 osteoclasts 뼈 재흡수를 담당 하 고 세포의 기능에 자연 우라늄 노출의 효과 조사 하기 위한 프로토콜.

초록

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우라늄은 뼈 생리학 방해을 보여줘 왔다 그리고 그것은 잘이 금속 뼈에 축적 되어 설립. 그러나, 작은 뼈 세포의 행동에 자연 우라늄의 효과 대 한 알려져 있다. 특히, osteoclasts 뼈 매트릭스의 재흡수에 대 한 책임 셀에 우라늄의 충격은 문서화 되어 있지. 이 문제를 조사, 우리 osteoclast 선구자의 모델로 자연 우라늄의 원본과 murine RAW 264.7 세포 라인으로 uranyl 아세테이트를 사용 하 여 새 프로토콜을 설립 했다. 여기, 우리가 상세한 osteoclast 선구자에 우라늄 세포 독성을 테스트 하 고는 osteoclastogenesis에 그리고 성숙한 osteoclasts의 resorbing 기능에 미치는 영향을 평가 하는 데 필요한 모든 분석 실험. 우리가 개발한 조건, 특히 uranyl 포함 된 문화 미디어의 준비와 RAW 264.7 시드 셀 안정적이 고 높은 생식 결과를 얻을 수 있습니다. 또한, 우리 osteoclasts의 크기 또는 resorbed 매트릭스의 비율 등 다양 한 매개 변수 분석을 촉진 하기 위하여 소프트웨어 도구의 사용을 최적화 했습니다.

서론

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우라늄은 자연 발생 방사능 요소 토양, 공기 및 물;에 따라서, 동물과 인간은 그들의 규정식에 있는 자연 우라늄에 노출 됩니다. 자연 소스 뿐만 아니라 우라늄 어떤 환경에서 그것의 풍부를 증가 anthropogenic 활동에서 유래. 우라늄 화학 및 방사능 위험 포즈. 그러나, (이 동위 원소 혼합물 포함 99.27 238U, 0.72 235U, 그리고 0.006 234U) 자연 우라늄 낮은 특정 활동 (25.103 Bq.g-1)가 있기 때문에 건강에 미치는 영향에 기인의 화학 독성입니다.

무엇이 든 해당 항목 경로 (흡입, 섭취, 또는 피부 노출), 대부분 우라늄의 배설물 제거는 시체를 입력 하 고 단지 작은 부분에 도달 하면 조직의 순환. 혈액에서 우라늄의 약 67%에 신장에 의해 필터링 되 고 24 h1내 소변에서 시체를 나뭇잎. 나머지는 주로 신장과 뼈, 우라늄의 독성2,,34의 두 가지 주요 표적 기관에 입금 됩니다. 여러 연구 ....

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프로토콜

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1입니다. Uranyl 아세테이트 솔루션의 준비

  1. 100 mM uranyl 아세테이트 솔루션의 2 개 mL를 준비 하려면 추가 uranyl 아세테이트 (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; 85 mg M = 424 g.mol-1) 5 mL에 플라스틱 튜브를 고체 상태에서.
  2. 플라스틱 튜브에 증류수 2 mL를 추가 하 고 플라스틱 스 토퍼 맞지.
  3. 고체의 총 해체까지 튜브를 적극적으로 악수. 24 시간 냉장고에 솔루션을 넣어.
    주의: uranyl [U(VI)]의 조작 일부 화학 및 방사능 위험을 선물 한다. 모든 샘플 준비 해야 하 고 특정 실험실에서 임시 장비와 특징. 모든 U VI 포함 된 액체 특별히 할당 된 폐기물 용기에 수집 및 독성 폐기물로 폐기. 건조 폐기물 (pipets, 튜브 등) 0.1 N HNO3 솔루션을 solubilize 및 U(VI) 제거 세척 될 수 있습니다.
  4. microelectrode와 pH 미터를 사용 하 여 솔루션의 pH를 확인 합니다.
    참고:는 microelectrode 한다 이전 보정 상업 버퍼 솔루션을 사용 하 여 (pH = 4와 pH = 7).

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결과

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주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 얼룩 3 개 이상의 핵 데 큰 보라색 셀 osteoclasts 시각화 사용 되었다. RANKL의 경작 된 RAW 264.7 세포에서 얻은 osteoclasts의 대표 이미지 그리고 uranyl 이온 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclasts 우라늄에 대 한 응답에서의 수와 크기에 변화 전체 우물의 합성 이미지와 확대 사진을 쉽게 볼 수 있습니다.

Osteoclasts의 크기 ImageJ 소프트웨어 (그림 2)를 사용 하 여 분석 했다. 이 목적에 대 한 트랩 osteoclasts 스테인드의 전체 잘 이미지 사용 되 고 동일한 지역에 각 문화 조건의 각 잘 대우 되었다 (그림 2.......

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토론

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우리가 알기로 이것이 처음으로 뼈 세포를 resorbing에 자연 우라늄의 효과 연구를 목표로 자세한 절차 설명 하. 이 방법은 뼈 생리학에 우라늄 영향의 더 나은 이해를 달성 하는 데 유용 되며 우라늄 chelators의 심사에 대 한 흥미로운 새로운 도구를 제공할 수 있습니다. 또한, 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 osteoclatogenesis에 다른 중 금속의 영향을 연구에 적용 될 수 믿습니다.

그것은 알려져 그 uranyl는 문화 미디어18,19,,2021에 무기 및 유기 구성 요소와 complexed. 이러한 complexations speciation 우라늄의 그리고,이 방법으로, 그것의 세포 독성 영향. 이러한 이유로, 프로토콜에 중요.......

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공개 사항

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저자 공개할 게 없다

감사의 글

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저자 Chantal Cros 도움이 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다.
이 연구는에서 교부 금에 의해 투자 되었다는 "Commissariat à l'Energie Atomique 외 보조 에너지 대안" (URANOs-프로그램 횡단 de Toxicologie du CEA와 CPRR CEA-AREVA), ANR에서 (우라늄의 독성: biomineralization의 다단계 접근 뼈, ANR-16-CE34-0003에서에서 처리). 이 작품 또한 좋은 소피아 앙 티 폴리스는 CNRS의 대학에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMLonzaBE12-604F
α-MEMLonzaBE12-169F
EMEM 페놀 레드Lonza12-668E
세포 배양용 물LonzaBE17-724F
PBSSigma-AldrichD8537
페니실린-스트렙토마이신 용액Sigma-AldrichP4333
  L-글루타민 용액Sigma-AldrichG7513
Trypan Blue 용액 0.4%Sigma-AldrichT8154
HyClone 소 태아 혈청GE Life SciencesSH30071.03
7.5% 중탄산나트륨 수용액Sigma-AldrichS8761
Acid Phosphatase, Lekocyte(TRAP) 키트Sigma-Aldrich387A
티아 졸릴 블루 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분말시그마 - 알드리치M5655
디메틸 설폭 사이드시그마 - 알드리치D5879
알리자린 레드 S 나트륨 염, 1 % w / v aq. sol.Alfa Aeros42746
Osteoassay 골 흡수 플레이트, 24웰 플레이트Corning Life Sciences3987
Multiwell 24웰 플레이트Falcon353504
플라스크 75cm2Falcon353133
폴리프로필렌 원추형 튜브 50mlFalcon352070
셀 스크레이퍼 30cmTPP90003
년

참고문헌

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  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early....

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Natural UraniumOsteoclastogenesisRAW 264 7 CellsUranyl AcetateOsteoclast DifferentiationBone Resorption AssayImageJ AnalysisAlizarin Red StainingTartrate Resistant Acid PhosphataseOsteo Assay Plate

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