마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

요약

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

초록

우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.

서론

Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형¹. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩^2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.

배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌

프로토콜

관리 및 실험 동물의 사용에 관한 기관 지침에 따라 그리고 국가 동물 관리 지침 (유럽 위원회 지시 86/609/CEE;에 따라 마우스 유지 했다 프랑스어 법령 no.87-848). 모든 절차는 프랑스 국가 윤리 위원회에 의해 승인 했다.

1. 절연의 근육 조직

경부 전위에 의해

1. 희생 한 성인 6 8 주 오래 된 마우스. Sterlise 70% 에탄올과 그것을 rinsing 하 여 사지 및 좋은 포인트가 위와 집게를 사용 하 여 뒷 다리 근육 (Gastrocnemius, Tibialis 앞쪽 허벅지 근육)를 해 부.
   참고: 하나의 마우스 조직의 약 500 밀리 그램을 산출 해야 한다.
2. 소규모의 동질적인 준비 얼음 소형 버퍼의 1 mL를 포함 하는 2 mL 테스트 튜브에 있는 근육을 말하다 (< 2-3 m m ³) 조각을 사용 하 여가 위를 잘 하 고 5-10 분 4 ° C에서 벤치 가기 교 반기에 떨고 관 두고

2. 조직 세포

참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.

1. 14 ....

결과

핵을, 우리는 15 또는 45 s, 18000 및 22, 000 rpm ( 재료의 표참조)에 대 한 해 부와 다진 근육 조직의 기계적 균질 수행. 모든 조건에서 핵에서 조직, 분리 될 수 있었다 하지만 수익률은 낮은 속도 (그림 1A-B)를 사용 하 여 최적의. Douncing 3-5 분 (그림 1A및 데이터 표시 되지 않음), 핵 수 또한 준비 하지만 기계적 균질 화 방법의 선택, 15로 작은 핵의 최적의 수율을 달성 될 수 있다 s, 특히 시간의 중요 한 증가 허용 여러 샘플 해야 처리 (그림 1B). 2.7 x 10까지이 프로토콜을 사용 하 여 조직 (1 마우스의 조직에 해당)의 500 mg에서⁷ 핵 chromatin의 100 .......

토론

여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 하 고, 아무 적당 한 장치를 사용할 수 있는 경우 중단도 수행할 수 있습니다 세포는 현미경의 효율성의 평가 정착 단계를 진행 하기 전에 권장은 douncing에 의해. 전체 조직 lysates의 고정 보다는 고립 된 핵의 고정 허용 더 재현 쥡니다 작은 볼륨에서 짧은 기간에 대 한. 우리 또한 토마스 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 장애, 전에 조직 수정 보다는 lysates 중단 후 수정 선택 ¹⁰ 미리 조직 고정 이동할의 감소 효율성 귀착되는. 이 프로토콜.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
T 25 디지털 ULTRA-TURRAX	T 18 ULTRA-TURRAX	0009022800
PMSF	시그마-알드리치 치미 SARL	P7626-25G
프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무료	Roche 진단	11873580001
단백질 G 세파로스 비드	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P-3296
단백질 분해효소 K	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P-2308
셀 스트레이너 70um	Corning BV	431751
셀 스트레이너 40um	Corning BV	352340
포름알데히드 EM 등급	Euromedex	15710-S
Rnase A	Fischer Scientific	12091039
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 25:24:1	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P3803
BSA	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	B4287-25G
효모 tRNA	시그마-알드리치 CHIMIE	R5636
글리코겐 블루	AMIBION	AM9516
Pol II ChIP 항체	Santa Cruz	SC-9001
H3K27ac ChIP 항체	활성 모티프	39133
Tead4 ChIP 항체	Aviva 시스템 생물학	(ARP38276_P050)
IGEPAL	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	I-3021
E220 집속 초음파기	Covaris E220
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
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