마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

요약

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

초록

우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.

서론

Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형¹. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩^2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.

배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌^4,,56같은 조직에서 성공적으로 수행 되었습니다. 골격 근육의 경우 같은 물리적으로 저항 조직, 구조 단백질의 높은 콘텐츠 및 그것의 핵의 절연 전시 중단은 특히 도전적 이다. 이 특이성을 감안할 때, 다른 조직에 대 한 최적화 된 프로토콜 주지 않는다 만족 스러운 결과 골격 근육에 대 한.

여기는 칩-학년 chromatin 물리적 조직, 포름알데히드 고정, 그리고 핵 및 쥡니다의 방해를 포함 하는 마우스 골격 근육 조직에서 분리 하는 프로토콜에 설명 합니다. 염색 질이이 조직에서 적합 한 칩에 대 한 준비를이 방법의 효율성은 다양 한 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정⁷칩 정량 및 칩 seq를 수행 하 여 시연 했다.

이 새로운 기술은 이전에 보고 된 프로토콜⁸ 시간, 녹음 방송 요인의 게놈 현지화에 변화 하는 동안 오래 콜라 소화 단계를 구성 보다 훨씬 빠른 고 유전자 발현에 변경 자리를 차지할 수 있습니다. 핵은 분리 하 고 고정 속도 여기에 설명 된 메서드를 특히 매력적인 chromatin 네이티브 게놈 인 상태를 더 충실 하 게 준비 하 게 만듭니다. 또한, 비록 근육 조직에서 chromatin 격리 또는 단백질 추출에 대 한 다른 방법 설명된^8,,910 되었고 선택 된 유전자, 아니 칩 seq에 칩 정량 실험을 위해 사용 그들을 사용 하 여 데이터 보고 되었습니다. 여기 보고 메서드는 전사 인자와 히스톤 수정 칩 seq에 적합 하 고 따라서 또한 적합 해야한다 3/4 C 또는 HiC chromatin 구조 캡처 응용 프로그램.

프로토콜

관리 및 실험 동물의 사용에 관한 기관 지침에 따라 그리고 국가 동물 관리 지침 (유럽 위원회 지시 86/609/CEE;에 따라 마우스 유지 했다 프랑스어 법령 no.87-848). 모든 절차는 프랑스 국가 윤리 위원회에 의해 승인 했다.

1. 절연의 근육 조직

경부 전위에 의해

1. 희생 한 성인 6 8 주 오래 된 마우스. Sterlise 70% 에탄올과 그것을 rinsing 하 여 사지 및 좋은 포인트가 위와 집게를 사용 하 여 뒷 다리 근육 (Gastrocnemius, Tibialis 앞쪽 허벅지 근육)를 해 부.
   참고: 하나의 마우스 조직의 약 500 밀리 그램을 산출 해야 한다.
2. 소규모의 동질적인 준비 얼음 소형 버퍼의 1 mL를 포함 하는 2 mL 테스트 튜브에 있는 근육을 말하다 (< 2-3 m m ³) 조각을 사용 하 여가 위를 잘 하 고 5-10 분 4 ° C에서 벤치 가기 교 반기에 떨고 관 두고

2. 조직 세포

참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.

1. 14 mL 라운드-하단 튜브는 homogenate 전송 및 5 mL 차가운 소형 버퍼 (EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 PMSF)에서 resuspend.
2. Homogenise 15-30의 라운드-하단 14 mL 튜브에 대 한 느슨한 dounce (20-30 선 3 분 이내) 또는 기계적 조직 균질 화기를 사용 하 여 다진된 근육 조직
   .
   참고: 세포의 효율성, 가벼운 현미경에 의해이 단계에서 평가 될 수 있다 하 고, 필요한 경우 추가 중단을 수행할 수 있습니다.
3. 15 mL 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 10 ml 차가운 소형 버퍼를 사용 하 여 볼륨을 채우기. homogenate 다음 마우스와 함께 진행 하기 전에 아래와 같이 수정.

3. 고정

1. 1% 최종 농도에 포름알데히드를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 흔들어.
2. 고정 및 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 동요를 막으려고 각 관에서 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가.

4. 핵 준비

참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.

1. 고정 lysate 사용 (5-10 스트로크) 느슨한 dounce Homogenise.
   1. 전송 15 mL 튜브와 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기를 핵 및 세포질 파편.
2. 는 상쾌한을 제거 하 고 신선한 5 mL 소형 버퍼에 펠 릿을 resuspend. 필터링은 lysate 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에. 다시는 filtrate 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링.
3. 핵 펠 렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 15 mL 튜브와 1000 x g에서 원심 분리기에는 filtrate 전송.
   참고:이 단계에서 핵 수 있습니다 sonicated 즉시 수, 또는 건조 한 펠 릿으로 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 된 스냅인 ° c.

5. 쥡니다

1. 핵 펠 릿 (기계와 dounce 이동할 위한 50 µ L)의 볼륨을 평가 하 고 포장된 핵 볼륨의 4 번을 3까지 쥡니다 버퍼에 resuspend sonicate sonicator는을 사용 하 여 4 ° C에서 10-15 분 .
   참고:는 염색 질 (6) 아래 설명 된 대로 즉시 분석 또는 냉동 고 수-80에 저장 ° c.

6. 다음 쥡니다 Chromatin 조각 크기를 평가

참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.

1. 드 crosslink chromatin의 30 µ L 1.5 mL 테스트 튜브에 고 추가 20 µ L 5 M NaCl. 500 µ L 볼륨을 완료 하 고 65 ° C에서 밤새 품 어.
   1. 다음 날 치료 1 µ L 성분 K (20 mg/mL 증권), 10 µ L 2 M Tris pH 6.8, 및 10 µ L 42 ° C. 수행 된 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 추출에서 1 시간에 0.5 M EDTA의 수행 및 나트륨 acetat의 1 볼륨 DNA를 침전 한 시간 또는 하룻밤-20-80 ° C에서 100% 에탄올의 e (3 M) 및 2 ° c.
2. 15 분 Decant는 상쾌한 13500 x g에서 원심 분리 하 여 DNA를 작은 찬 70% 에탄올과 5 분 Decant는 상쾌한에 다시 한번 원심 분리기로 깨끗이 펠 릿을 세척 하 고 건조는 펠 릿.
3. 테 버퍼의 원래 볼륨 (30 µ L)에 펠 릿을 resuspend. 260 nm/280 nm에서 흡 광도 분 광 광도 계에 DNA 농도 측정. 플라스틱 1.5 %agarose 젤의 별도 차선에 DNA 크기 사다리와 DNA의 500-1000은 고 chromatin의 조각 크기를 평가 하기 위해 전기 이동 법을 수행.
   참고: 조각 크기 200-500의 기본적인 쌍 사이 여야 하 고 아무 감지 높은 분자량 조각 하 비-또는 저조한-조각화 DNA에 해당 되어야 합니다. Chromatin 솔루션 (5 단계)를 다시 긴 시간 sonicated 고 최적 크기를 얻을 때까지 위에서 설명한 대로 다시 분석 수 필요한 경우.

7. Chromatin Immunoprecipitation (칩)

참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.

Aliquoting 1 mL에 에탄올 50% 슬러리의 의해

1. 블록 단백질 G sepharose 구슬. 펠 릿은 벤치탑에서 1 분 400 x g에서 원심 분리 하 여 구슬 원심 400 x g에서 테 버퍼 원심 분리기의 1 mL로 씻어 고 반복 하는 워시
2. 후 두 번째 원심 분리, 다시 칩 희석 버퍼 BSA (재고 20 mg/mL)의 25 µ L의 1 ml에서를 일시 중단 하 고 20 µ L 효 모 tRNA (재고 10 mg/mL)
   . 4 회전 (40-60 rpm) 하 여 적어도 2 사용 전에 h 구슬 차단 ° c.
   1. Chromatin (5 단계)의 희석 50 µ g 8 ~ 10 배 칩 희석 버퍼를 사용 하 여. 차단 된 비드 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 4에서 2 h (40-60 rpm) 회전에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 사전 허가 chromatin 신선한 튜브 전송 하 4 ° C에 400 x g.
3. Immunoprecipitation에 대 한 1 차적인 항 체 (예, chromatin의 10 µ g 당 1-2 µ g)의 적절 한 금액을 추가 하 고 4 회전 밤새 품 어 ° c.
   참고: 최적의 양의 항 체 공급 업체에서 권장 될 수 있습니다 또는 칩-정량 항 체의 다른 수량으로 최적의 농축 관찰 될 때까지 수행 하 여 실험적으로 결정 될 수 있다. 또한 단백질 G sepharose 사용 하는 항 체의 하위 형식에 따라 단백질 A sepharose에 의해 대체 될 수 있습니다.
4. 추가 차단된 구슬 다음날 고 4 회전 (40-60 rpm) 1 시간에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 작은 구슬, 제거 하는 상쾌한 고 시작 칩 20-30 s 400g x 세척.
5. 세척 칩: 버퍼와 함께 다음 세척을 수행: 낮은 소금 버퍼, 한 번 그리고 높은 소금 버퍼를 두 번 LiCl 버퍼와 두 번 그리고 마지막으로 두 번 테 버퍼와.
   1. 회전 (40-60 rpm) 4 ° C에서 10 분 동안 각 세척을 수행 하 고 작은 벤치 가기 원심 분리기에서 20-30 s 400g x에서 원심 분리 하 여 각 씻어 사이의 구슬.
6. 차입에 대 한 마지막 세척 제거 하 고 동요 하는 동안 실 온에서 15 분 동안 250 µ L 차입 버퍼 (갓 준비) 구슬 resuspend.
7. 원심 분리기 g 및 수집 신선한 튜브 eluate x 400. 이 단계를 두 번 및 다음 드 crosslink 20 µ L NaCl 5 M 및 1 µ L RNase A와 하룻밤 eluate 수행 (10mg/mL), 가수분해, K와 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 extr 치료단계 6 행동.
8. 테 버퍼의 50 µ L에서 resuspend를 사용 하 여 aliquots 칩 정량에 대 한 표준 프로토콜 ¹⁵ 당 칩의 품질을 확인.

결과

핵을, 우리는 15 또는 45 s, 18000 및 22, 000 rpm ( 재료의 표참조)에 대 한 해 부와 다진 근육 조직의 기계적 균질 수행. 모든 조건에서 핵에서 조직, 분리 될 수 있었다 하지만 수익률은 낮은 속도 (그림 1A-B)를 사용 하 여 최적의. Douncing 3-5 분 (그림 1A및 데이터 표시 되지 않음), 핵 수 또한 준비 하지만 기계적 균질 화 방법의 선택, 15로 작은 핵의 최적의 수율을 달성 될 수 있다 s, 특히 시간의 중요 한 증가 허용 여러 샘플 해야 처리 (그림 1B). 2.7 x 10까지이 프로토콜을 사용 하 여 조직 (1 마우스의 조직에 해당)의 500 mg에서⁷ 핵 chromatin의 100 ...

토론

여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 하 고, 아무 적당 한 장치를 사용할 수 있는 경우 중단도 수행할 수 있습니다 세포는 현미경의 효율성의 평가 정착 단계를 진행 하기 전에 권장은 douncing에 의해. 전체 조직 lysates의 고정 보다는 고립 된 핵의 고정 허용 더 재현 쥡니다 작은 볼륨에서 짧은 기간에 대 한. 우리 또한 토마스 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 장애, 전에 조직 수정 보다는 lysates 중단 후 수정 선택 ¹⁰ 미리 조직 고정 이동할의 감소 효율성 귀착되는. 이 프로토콜...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
T 25 디지털 ULTRA-TURRAX	T 18 ULTRA-TURRAX	0009022800
PMSF	시그마-알드리치 치미 SARL	P7626-25G
프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무료	Roche 진단	11873580001
단백질 G 세파로스 비드	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P-3296
단백질 분해효소 K	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P-2308
셀 스트레이너 70um	Corning BV	431751
셀 스트레이너 40um	Corning BV	352340
포름알데히드 EM 등급	Euromedex	15710-S
Rnase A	Fischer Scientific	12091039
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 25:24:1	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	P3803
BSA	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	B4287-25G
효모 tRNA	시그마-알드리치 CHIMIE	R5636
글리코겐 블루	AMIBION	AM9516
Pol II ChIP 항체	Santa Cruz	SC-9001
H3K27ac ChIP 항체	활성 모티프	39133
Tead4 ChIP 항체	Aviva 시스템 생물학	(ARP38276_P050)
IGEPAL	SIGMA-ALDRICH CHIMIE	I-3021
E220 집속 초음파기	Covaris E220
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
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