NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

요약

높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

초록

다양 한 방법 설명 림프 종 또는 lymphoproliferative 증후군 환자에서 NK/T 세포 라인을 설립 되었습니다. 이러한 방법을 피더 셀, 순화 NK / T 세포, 혈액 10 mL로 또는 일리노이-2 높은 복용량 사용. 이 연구는 재조합 인간 일리노이-2 (rhIL-2)의 추가 함께 주변을 경작 하 여 NK, T 세포 라인 혈액 단 세포 (PBMC)를 설정 하는 강력 하 고 간단한 전략으로 새로운 메서드를 제공 하 고 전체 혈액의 2 mL 만큼 약간 사용 합니다. 셀 2 주에 신속 하 게 증식 수 고 3 개월 이상 유지 됩니다. 이 방법으로 7 NK 또는 T 세포 라인 높은 성공율으로 설립 되었습니다. 이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 더 많은 경우의 CAEBV 또는 NK/T 세포 림프 종에서 셀 라인 구축에 적용.

서론

엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 유비 쿼터 스 이며 감염 B 셀 뿐만 아니라 T 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병 (LPD) 및 림프 종/백혈병, EBV 관련 hemophagocytic 등의 수는 lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme와 같은 림프 종, extranodal NK/T-세포 림프 종, 비 강 유형 및 호전적인 NK 세포 백혈병^1,2,3. 이러한 가운데는 심각한 만성 활성 EBV (SCAEBV) 질병, 사고, 동남 아시아에서 주로 그리고 있는 지금 LPD EBV 감염 T 나 NK 세포^4,,56, 의 클론 확장으로 인 한 것으로 간주 됩니다. ⁷, 하지만 명백한 면역 결핍 없이 전염 성 mononucleosis (IM)에 존재-처럼 높은 EBV DNA로 서 지속적으로 또는 recurrentl....

프로토콜

이 연구는 연구소의 유전학 그리고 개발 생물학, 과학의 중국 아카데미의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 프로토콜 인간의 복지에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.

참고: 워크플로 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.

1입니다. CAEBV 환자에서 PBMC의 격리

1. 그라데이션 (예를 들어, Ficoll-패)에 의해 CAEBV 환자의 전체 혈액의 2 mL에서 기본 PBMC 정화 제조업체의 지침에 따라 원심 분리. 또는, 해빙 RPMI 1640 매체 액체 질소에서 PBMC를 cryopreserved.
2. 18 µ L 세포 현 탁 액에 2 µ L trypan 블루의 (0.4%)를 추가, 얼룩 셀, 셀 카운터 접시에 정지를 전송 및 세포의 농도 자동된 셀 카운터 생존 능력을 측정 3 분 기다려야 합니다.
3. 2-3 × 10⁶ 셀/mL 20% 인간의 혈 청 (56 ° C에서 비활성화 열), 2 m L-글루타민, m을 포함 하는 완전 한 RPMI 1640 문화 매체와 보충의 조밀도에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 항생제 (100 µ g/mL 스, 100 U/mL 페....

결과

후에 3 일 셀 라인의 설립 동안 문화, 다형성 세포 나타납니다 (그림 2)를 시작 합니다. 7 일 후 세포 수와 세포의 생존 능력 (그림 3) 높은 속도로 증가 신속 하 게, 성장. 셀의 작은 클러스터 셀 농도 3-6 × 10⁶을 초과할 수 있습니다 때, 성장 하는 10-14 일 후 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 기간에 문화 접시 2 개 또는 3 개의 우물에 사단에 의해 세포를 확장 한다. 약 한 달 후, 한 번 셀 숫자에 도달 3-5 × 10⁷, 개수는 보존을 위한 충분히 높은.

또 다른 중요 한 문제 셀 성공적으로 경작 되는 때에 고기를 결정 하는. 우리의 결과 셀 좋은 조건에서 3 개월 이상 성장 T (L19.......

토론

이 프로토콜에서 CAEBV 환자의 전체 혈액에서 NK/T 세포 라인을 설립 하는 새로운 기술 개발 되었습니다. 기존의 방법에 비해,이 방법의 주요 장점은 그것의 단순 하 고 작은 양의 혈액의 그것의 필요 조건 그것은 세포 생존 능력의 좋은 조건과 높은 성공률을 전시 하는 동안. 게다가, NK/T 세포 라인 셀 형식 결정으로 사전에 감염 latently EBV 소비 더 많은 혈액과 경작 하기 전에 시간을 확인 하지 않고 PBMC를 경작 하 여 설정할 수 있습니다. 또는 셀 라인 분석 될 수 있다 하 고 세포의 다른 고기 셀 라인 설립 후 cytometry로 순화 될 수 있다. 게다가, 메서드 rhIL 2의 낮은 복용량을 사용 하 고 지류 셀 필요. 이 방법으로 우리 8 CAEBV 환자에서 7 셀 라인을 개발 하 고 한 달 이내에 그들을 cryopreserved. 하나는 셀 라인으로 개발 되지 않았습니다 중요 한 확산 없이 5 개월 이상 살아 유지 될 수 있다 그리고이 뒤에 이유 필요 추가 탐사.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Hu HLA-DR, FITC	BD		560944 FACS용 항체
Hu CD4, FITC	BD	555346	FACS용 항체
, Hu/NHP CD8 PE	BD	557086	FACS용 항체
, Hu CD3 PE	BD	555340	FACS용
Hu CD16, FITC 3G8	BD	555406	FACS용
Hu/NHP, CD56, PE, MY31	BD	556647	FACS
hu/CD19 PE-Cy7	BD		560728 FACS
human IL-2	Roche	11147528001
human serum	MRC	CCC118-125
CO2 incubator	SANYO
Centrifuge	Techcomp	CT6T	원심분리
현미경	OLYMPUS CKX53	CKX53
자동 세포 계수기	Countstar	IC 1000	세포 계수용
24웰 세포 배양 클러스터	Corning Incorporated	3524	폴리스티렌 플레이트
25cm2 세포 배양 플라스크	둥지	707001	폴리스티렌
FBS	Gibco	10270	세포 매체
구성 요소 RPMI 매체 1640	수명	22400089	세포 배지
L-글루타민	Amresco	374	세포 배지 구성 요소
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