방법 논문

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

DOI:

10.3791/56515

⸱

2018년 3월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

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높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

초록

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다양 한 방법 설명 림프 종 또는 lymphoproliferative 증후군 환자에서 NK/T 세포 라인을 설립 되었습니다. 이러한 방법을 피더 셀, 순화 NK / T 세포, 혈액 10 mL로 또는 일리노이-2 높은 복용량 사용. 이 연구는 재조합 인간 일리노이-2 (rhIL-2)의 추가 함께 주변을 경작 하 여 NK, T 세포 라인 혈액 단 세포 (PBMC)를 설정 하는 강력 하 고 간단한 전략으로 새로운 메서드를 제공 하 고 전체 혈액의 2 mL 만큼 약간 사용 합니다. 셀 2 주에 신속 하 게 증식 수 고 3 개월 이상 유지 됩니다. 이 방법으로 7 NK 또는 T 세포 라인 높은 성공율으로 설립 되었습니다. 이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 더 많은 경우의 CAEBV 또는 NK/T 세포 림프 종에서 셀 라인 구축에 적용.

서론

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엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 유비 쿼터 스 이며 감염 B 셀 뿐만 아니라 T 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병 (LPD) 및 림프 종/백혈병, EBV 관련 hemophagocytic 등의 수는 lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme와 같은 림프 종, extranodal NK/T-세포 림프 종, 비 강 유형 및 호전적인 NK 세포 백혈병1,2,3. 이러한 가운데는 심각한 만성 활성 EBV (SCAEBV) 질병, 사고, 동남 아시아에서 주로 그리고 있는 지금 LPD EBV 감염 T 나 NK 세포4,,56, 의 클론 확장으로 인 한 것으로 간주 됩니다. 7, 하지만 명백한 면역 결핍 없이 전염 성 mononucleosis (IM)에 존재-처럼 높은 EBV DNA로 서 지속적으로 또는 recurrentl....

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프로토콜

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이 연구는 연구소의 유전학 그리고 개발 생물학, 과학의 중국 아카데미의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 프로토콜 인간의 복지에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.

참고: 워크플로 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.

1입니다. CAEBV 환자에서 PBMC의 격리

  1. 그라데이션 (예를 들어, Ficoll-패)에 의해 CAEBV 환자의 전체 혈액의 2 mL에서 기본 PBMC 정화 제조업체의 지침에 따라 원심 분리. 또는, 해빙 RPMI 1640 매체 액체 질소에서 PBMC를 cryopreserved.
  2. 18 µ L 세포 현 탁 액에 2 µ L trypan 블루의 (0.4%)를 추가, 얼룩 셀, 셀 카운터 접시에 정지를 전송 및 세포의 농도 자동된 셀 카운터 생존 능력을 측정 3 분 기다려야 합니다.
  3. 2-3 × 106 셀/mL 20% 인간의 혈 청 (56 ° C에서 비활성화 열), 2 m L-글루타민, m을 포함 하는 완전 한 RPMI 1640 문화 매체와 보충의 조밀도에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 항생제 (100 µ g/mL 스, 100 U/mL 페....

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결과

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후에 3 일 셀 라인의 설립 동안 문화, 다형성 세포 나타납니다 (그림 2)를 시작 합니다. 7 일 후 세포 수와 세포의 생존 능력 (그림 3) 높은 속도로 증가 신속 하 게, 성장. 셀의 작은 클러스터 셀 농도 3-6 × 106을 초과할 수 있습니다 때, 성장 하는 10-14 일 후 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 기간에 문화 접시 2 개 또는 3 개의 우물에 사단에 의해 세포를 확장 한다. 약 한 달 후, 한 번 셀 숫자에 도달 3-5 × 107, 개수는 보존을 위한 충분히 높은.

또 다른 중요 한 문제 셀 성공적으로 경작 되는 때에 고기를 결정 하는. 우리의 결과 셀 좋은 조건에서 3 개월 이상 성장 T (L19.......

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토론

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이 프로토콜에서 CAEBV 환자의 전체 혈액에서 NK/T 세포 라인을 설립 하는 새로운 기술 개발 되었습니다. 기존의 방법에 비해,이 방법의 주요 장점은 그것의 단순 하 고 작은 양의 혈액의 그것의 필요 조건 그것은 세포 생존 능력의 좋은 조건과 높은 성공률을 전시 하는 동안. 게다가, NK/T 세포 라인 셀 형식 결정으로 사전에 감염 latently EBV 소비 더 많은 혈액과 경작 하기 전에 시간을 확인 하지 않고 PBMC를 경작 하 여 설정할 수 있습니다. 또는 셀 라인 분석 될 수 있다 하 고 세포의 다른 고기 셀 라인 설립 후 cytometry로 순화 될 수 있다. 게다가, 메서드 rhIL 2의 낮은 복용량을 사용 하 고 지류 셀 필요. 이 방법으로 우리 8 CAEBV 환자에서 7 셀 라인을 개발 하 고 한 달 이내에 그들을 cryopreserved. 하나는 셀 라인으로 개발 되지 않았습니다 중요 한 확산 없이 5 개월 이상 살아 유지 될 수 있다 그리고이 뒤에 이유 필요 추가 탐사.

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공개 사항

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D.Z., X.Z., 및 X.C.에 NK/T 세포 선 및 연구에서 설립 셀 라인을 설정 하기 위한이 방법의 잠재적인 사용을 포함 하는 특허 출원의 공동 발명가. D.Z., X.Z., 및 X.C.는이 작품에서 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 나머지 작가 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

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이 작품에서 중국의 국립 과학 재단 (전략적 생물 자원 기술 지원 시스템의 중국 과학 아카데미 (CZBZX-1, ZSSB-004) (KFZD-남서-205), 과학의 중국 아카데미 키 프로젝트 및 교부 금에 의해 지원 되었다 81401640) 자연 과학 기금 (14ZR1434800)을 상해 하 고.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Hu HLA-DR, FITCBD560944 FACS용 항체
Hu CD4, FITCBD555346FACS용 항체
, Hu/NHP CD8 PEBD557086FACS용 항체
, Hu CD3 PEBD555340FACS용
Hu CD16, FITC 3G8BD555406FACS용
Hu/NHP, CD56, PE, MY31BD556647FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728 FACS
human IL-2Roche11147528001
human serumMRCCCC118-125
CO2 incubatorSANYO
CentrifugeTechcompCT6T원심분리
현미경OLYMPUS CKX53CKX53
자동 세포 계수기CountstarIC 1000세포 계수용
24웰 세포 배양 클러스터Corning Incorporated3524폴리스티렌 플레이트
25cm2 세포 배양 플라스크둥지707001폴리스티렌
FBSGibco10270세포 매체
구성 요소 RPMI 매체 1640수명22400089세포 배지
L-글루타민Amresco374세포 배지 구성 요소
100 x 스트렙토마이신 페니실린 용액 BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309세포 배지
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03체외 분리용
동결
용유세포분석기BDBD FACSAria II
소프트 웨어BDBD FACSDiva 소프트 웨어FACS 분석
, , , , , , 항체, , , 항체, 용 항체 림프구 DMSO Sigma D2650의 세포

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompro....

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재인쇄 및 허가

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태그

NK TEBVIL 2

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