이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

8.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56515

⸱

2018년 3월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

초록

다양 한 방법 설명 림프 종 또는 lymphoproliferative 증후군 환자에서 NK/T 세포 라인을 설립 되었습니다. 이러한 방법을 피더 셀, 순화 NK / T 세포, 혈액 10 mL로 또는 일리노이-2 높은 복용량 사용. 이 연구는 재조합 인간 일리노이-2 (rhIL-2)의 추가 함께 주변을 경작 하 여 NK, T 세포 라인 혈액 단 세포 (PBMC)를 설정 하는 강력 하 고 간단한 전략으로 새로운 메서드를 제공 하 고 전체 혈액의 2 mL 만큼 약간 사용 합니다. 셀 2 주에 신속 하 게 증식 수 고 3 개월 이상 유지 됩니다. 이 방법으로 7 NK 또는 T 세포 라인 높은 성공율으로 설립 되었습니다. 이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 더 많은 경우의 CAEBV 또는 NK/T 세포 림프 종에서 셀 라인 구축에 적용.

서론

엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 유비 쿼터 스 이며 감염 B 셀 뿐만 아니라 T 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병 (LPD) 및 림프 종/백혈병, EBV 관련 hemophagocytic 등의 수는 lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme와 같은 림프 종, extranodal NK/T-세포 림프 종, 비 강 유형 및 호전적인 NK 세포 백혈병1,2,3. 이러한 가운데는 심각한 만성 활성 EBV (SCAEBV) 질병, 사고, 동남 아시아에서 주로 그리고 있는 지금 LPD EBV 감염 T 나 NK 세포4,,56, 의 클론 확장으로 인 한 것으로 간주 됩니다. 7, 하지만 명백한 면역 결핍 없이 전염 성 mononucleosis (IM)에 존재-처럼 높은 EBV DNA로 서 지속적으로 또는 recurrently, 발열, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, 및 간 기능 장애 등 증상에 로드는 말 초 혈액8,9. CAEBV 가진 환자는 빈약한 예 지10,11및 그것의 병 인 그리고는 EBV의 역할은 분명 하다. 따라서, EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병에서 파생 된 라인 세포 및 림프 종 백혈병의 발생률이 높은와 NK 또는 T 세포 확산 및 그것의 관계를 유도 EBV의 메커니즘을 명확히 셀 모델로 매우 도움이 또는 림프 종입니다.

날짜 하려면, 여러 셀 라인 다른 기법12,13,14,,1516함께 설립 되었습니다. 인간 NK 세포 선, NK-YS, NK 세포 림프 종/백혈병, 피더로 그리고 rhIL-2 mL15당 20U의 농도에서 존재 마우스 stromal 세포 라인 공동 경작에 의해 설립 되었다. KAI3 다른 NK 세포 선 심각한 모기 알레르기를 가진 환자 또는 헌 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL), SCAEBV에서 설립 되었다 B 세포 EBV, 피더 세포와 100U/mL16rhIL-2의 추가 변형. SNK6와 SNT8는 rhIL-2 (700U/mL)12의 높은 복용량을 추가 하 여 비 강 NK/T 세포 림프 종 환자 들의 종양 조직에서 파생 되었다. 유사한 기술, SNK-1 셀 CAEBV 환자, PBMC에서 T 세포를 제거 하 고 rhIL-213,17700U/mL을 추가 하 여 양식에서 했다. SNT13와 SNT15는 CD4 + 및 CD8 + 세포18제거 하 여 설립 되었다. 지금까지, EBV-NK/T LPD 환자에서 다른 T 세포와 NK 세포 선이 방법19모두 개발 되었다.

위에서 언급 한 기존 방법의 단점 때문에 병원에서 매우 도전적인는 일리노이-2로 10 mL 전 혈의 활용 또는 NK/T 세포의 정화의 높은 복용량의 요구 피더 세포의 고용 포함 어떤 종류의 세포는 EBV latently 확인의 필요성 문화 시작 하기 전에 감염. CAEBV 아시아 아이 들에서 주로 발생 10 mL 혈액 모든 지역에서 얻기 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 피더 세포 없이 rhIL2의 낮은 복용량과 전체 혈액의 2 mL의 볼륨을 사용 하 여 CAEBV 환자에서 PBMC를 경작 NK / T 세포 라인을 구축 하 고 성공률을 새로운 간단한 방법을 개발. 이 방법의 결과 그것의 높은 효율성과 시간 절약을 입증 했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 연구는 연구소의 유전학 그리고 개발 생물학, 과학의 중국 아카데미의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 프로토콜 인간의 복지에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.

참고: 워크플로 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.

1입니다. CAEBV 환자에서 PBMC의 격리

  1. 그라데이션 (예를 들어, Ficoll-패)에 의해 CAEBV 환자의 전체 혈액의 2 mL에서 기본 PBMC 정화 제조업체의 지침에 따라 원심 분리. 또는, 해빙 RPMI 1640 매체 액체 질소에서 PBMC를 cryopreserved.
  2. 18 µ L 세포 현 탁 액에 2 µ L trypan 블루의 (0.4%)를 추가, 얼룩 셀, 셀 카운터 접시에 정지를 전송 및 세포의 농도 자동된 셀 카운터 생존 능력을 측정 3 분 기다려야 합니다.
  3. 2-3 × 106 셀/mL 20% 인간의 혈 청 (56 ° C에서 비활성화 열), 2 m L-글루타민, m을 포함 하는 완전 한 RPMI 1640 문화 매체와 보충의 조밀도에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 항생제 (100 µ g/mL 스, 100 U/mL 페니실린). 씨 24-잘 세포 배양 배지로 잘 당 PBMC 서 스 펜 션의 1 mL.
  4. 잘 당 150 U rhIL-2를 추가 합니다.
  5. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 배양 배지를 배치
  6. 하루에 2, 현미경 (200 배 확대); 세포 형태 관찰 셀은 밝고 라운드 때 좋은 상태에 있습니다.

2. 확장 셀의 가능한 셀 번호 매기기

  1. (200 배 확대), 현미경으로 세포 형태를 관찰 하 고 매체를 변경 하기 전에 셀 번호 매기기에 의해 세포 성장 상태를 모니터링: 18 µ L 세포 현 탁 액을 trypan 블루 (0.4%)의 2 µ L을 추가 하 고 세포의 농도 계산 (1.2 참조 그림 2).
  2. 24-잘 접시에 매체의 500 µ L를 무시 하 고 500 µ L 신선한 완전 한 문화 매체를 추가 합니다. 잘 당 150U rhIL-2를 추가 합니다.
  3. 중간 단계 2.2에서 일주일에 두 번 변경 합니다.
  4. 세포 성장 곡선 (그림 3)를 그립니다.
  5. 실행 가능한 세포의 농도 5 × 106/mL을 초과 하면 1-2 × 106 셀/mL에 각 잘의 농도에 새로운 우물으로 셀을 나눕니다. 이 프로세스는 2-4 주 걸립니다.

3. 세포 형질 Cytometry에 의해

  1. 세포는 확장 하는 때, 결정 셀 라인의 고기를 1 × 106 세포를 수집 합니다. 실 온에서 5 분 동안 240 x g 에서 세포를 원심 (NK/T 세포는 튜브의 밑에 침전 것 이다).
  2. 상쾌한, 7 mL PBS를 추가 하 여 강수량을 세척. 실 온에서 240 x g 에 5 분 동안 원심 분리기. 한 번 반복 합니다.
  3. 각 튜브를 200 µ L 인간의 혈 청을 추가 하 고 잘 섞어 실 온에서 10 분 동안 품 어.
  4. 실 온에서 5 분 동안 240 x g에서 셀 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시 1 × 106/mL 찬 PBSA (PBS+0.2%BSA)에서 세포를 일시 중지. 2 × 105 셀을 포함 하는 각 관 5 튜브로 셀을 나눕니다.
  5. 4 ° c.에서 5 분 동안 240 x g에서 원심 분리기 세포 상쾌한 삭제 하 고 다시 PBSA 버퍼 또는 PBSA 10 µ L PE (또는 PE-Cy7)를 포함 하는 셀을 일시 중지와 10 µ L FITC 표시 그림 4에 의해 나타나는 것과 같이 얼음 T 나 NK 세포의 세포 수용 체를 얼룩에 항 체. 셀 PBSA 버퍼 중단 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
  6. 어둠 속에서 얼음에 20-30 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어.
  7. 씻어 감기 PBSA 두 번 셀, 다시 셀 300 µ L 중단 차가운 PBSA.
  8. 와 교류 cytometer 세포 표현 형 분석.
    1. Flow Cytometer 조건 "워크시트 만들기"에 설정 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)를 표시 하는 도트 음모와 실험 서식 파일을 설정 합니다.
    2. FSC 그리고 SSC 전압 최적화 isotype 제어 튜브를 로드 하 고 관심의 세포 인구를 방해 하지 않고 파편을 제거 하기 위해 FSC 임계값 값 최적화. FSC, SSC, FITC, PE PE Cy7를 제외한 모든 매개 변수를 삭제 합니다.
    3. 각 2 색 분석 그룹에 isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 보정을 수행 합니다.
    4. 샘플을 로드 HLA-DR VS CD19, CD56 VS CD16, CD4 VS CD8, CD3 VS CD16 점 세포의 다른 인구를 보여주는 플롯 이다.
      참고: PBMC 보상 제외/isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 수행할 수 사용 되었다. 교류 cytometer와 2 색 면역 형광 표면 마커 표현 분석을 정기적으로 사용 되었다. 다음 항 체가 포함 되어 있습니다: 안티-HLA-DR, 안티-CD4, 안티-CD16 fluorescein isothiocyanate (FITC), 안티-CD8, 안티 CD56 활용, CD3 phycoerythrin (PE)와 활용 및 안티-CD19 PE Cy7와 활용.

4. 확장 및 Cryopreservation NK/T 세포의

  1. 세포 표현 형 분석을 완료 하는 때 매체를 변경 합니다. 신중 하 게는 상쾌한의 절반을 제거 하 고 접시의 바닥에 세포를 만지지 마십시오. 포함 된 셀 판 300 U/mL rhIL-2 신선한 문화 매체의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
  2. 매체의 절반을 변경 셀까지 (2.2)로 3 일 마다 클러스터 현미경 (그림 2) 명확 하 게 볼 수 있습니다. 일반적으로이 프로세스는 2-3 주 걸립니다.
  3. 같은 혈통의 다른 우물을 혼합 후 24-잘 접시에서 T25 문화 플라스 크 셀을 전송. 문화 매체의 볼륨 두 매체의 볼륨까지 노란색으로 10-15 mL을 확장 합니다. RhIL-150 U/mL의 농도와 2를 추가 합니다.
  4. 성장, 2-3 주 후 냉동 하기 전에 중간 24 h를 변경 하면 셀 질량 육안으로 관찰 될 수 있다. 셀 카운터로 세포 농도 측정 합니다.
  5. 240 x g에 5 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 하 고 다시 5-10 배 90% 태아 둔감 한 혈 청 및 10 %dimethylsulfoxide (DMSO)를 포함 하는 냉동 재고 솔루션 106 셀/mL의 조밀도에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. -80 ° C에 분 당 1 ° C의 속도로 십시오 그리고 그 후 액체 질소에 직접 전송.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

후에 3 일 셀 라인의 설립 동안 문화, 다형성 세포 나타납니다 (그림 2)를 시작 합니다. 7 일 후 세포 수와 세포의 생존 능력 (그림 3) 높은 속도로 증가 신속 하 게, 성장. 셀의 작은 클러스터 셀 농도 3-6 × 106을 초과할 수 있습니다 때, 성장 하는 10-14 일 후 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 기간에 문화 접시 2 개 또는 3 개의 우물에 사단에 의해 세포를 확장 한다. 약 한 달 후, 한 번 셀 숫자에 도달 3-5 × 107, 개수는 보존을 위한 충분히 높은.

또 다른 중요 한 문제 셀 성공적으로 경작 되는 때에 고기를 결정 하는. 우리의 결과 셀 좋은 조건에서 3 개월 이상 성장 T (L19...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜에서 CAEBV 환자의 전체 혈액에서 NK/T 세포 라인을 설립 하는 새로운 기술 개발 되었습니다. 기존의 방법에 비해,이 방법의 주요 장점은 그것의 단순 하 고 작은 양의 혈액의 그것의 필요 조건 그것은 세포 생존 능력의 좋은 조건과 높은 성공률을 전시 하는 동안. 게다가, NK/T 세포 라인 셀 형식 결정으로 사전에 감염 latently EBV 소비 더 많은 혈액과 경작 하기 전에 시간을 확인 하지 않고 PBMC를 경작 하 여 설정할 수 있습니다. 또는 셀 라인 분석 될 수 있다 하 고 세포의 다른 고기 셀 라인 설립 후 cytometry로 순화 될 수 있다. 게다가, 메서드 rhIL 2의 낮은 복용량을 사용 하 고 지류 셀 필요. 이 방법으로 우리 8 CAEBV 환자에서 7 셀 라인을 개발 하 고 한 달 이내에 그들을 cryopreserved. 하나는 셀 라인으로 개발 되지 않았습니다 중요 한 확산 없이 5 개월 이상 살아 유지 될 수 있다 그리고이 뒤에 이유 필요 추가 탐사.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

D.Z., X.Z., 및 X.C.에 NK/T 세포 선 및 연구에서 설립 셀 라인을 설정 하기 위한이 방법의 잠재적인 사용을 포함 하는 특허 출원의 공동 발명가. D.Z., X.Z., 및 X.C.는이 작품에서 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 나머지 작가 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품에서 중국의 국립 과학 재단 (전략적 생물 자원 기술 지원 시스템의 중국 과학 아카데미 (CZBZX-1, ZSSB-004) (KFZD-남서-205), 과학의 중국 아카데미 키 프로젝트 및 교부 금에 의해 지원 되었다 81401640) 자연 과학 기금 (14ZR1434800)을 상해 하 고.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Hu HLA-DR, FITCBD560944 FACS용 항체
Hu CD4, FITCBD555346FACS용 항체
, Hu/NHP CD8 PEBD557086FACS용 항체
, Hu CD3 PEBD555340FACS용
Hu CD16, FITC 3G8BD555406FACS용
Hu/NHP, CD56, PE, MY31BD556647FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728 FACS
human IL-2Roche11147528001
human serumMRCCCC118-125
CO2 incubatorSANYO
CentrifugeTechcompCT6T원심분리
현미경OLYMPUS CKX53CKX53
자동 세포 계수기CountstarIC 1000세포 계수용
24웰 세포 배양 클러스터Corning Incorporated3524폴리스티렌 플레이트
25cm2 세포 배양 플라스크둥지707001폴리스티렌
FBSGibco10270세포 매체
구성 요소 RPMI 매체 1640수명22400089세포 배지
L-글루타민Amresco374세포 배지 구성 요소
100 x 스트렙토마이신 페니실린 용액 BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309세포 배지
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03체외 분리용
동결
용유세포분석기BDBD FACSAria II
소프트 웨어BDBD FACSDiva 소프트 웨어FACS 분석
, , , , , , 항체, , , 항체, 용 항체 림프구 DMSO Sigma D2650의 세포

참고문헌

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

NK T 세포주만성 활성 EBV말초혈액 단핵구재조합 인간 IL-2유세포 분석밀도 구배 원심분리세포 배양 유지표현형 결정세포 증식 모니터링동결 보존 기술
NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.