내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

Summary

이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

Abstract

포유류에서 청각 부족을 재생성 하는 기능을 촉진 하는 mechanosensory 세포는 청력 손실에 대 한 치료를 제한 했다. 현재 재생 의학 전략 이식 줄기 세포 또는 주변 청각 상실을 해결 하기 위해 손상 된 줄기 세포의 교체를 장려 하는 내가 지원 세포의 유전자 조작에 집중 했다. 그러나, 기질 (ECM) 유도 하 고 세포의 기능 유지에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 잘 조사 하지. 인공 와우를 사용 하 여 성체 줄기 세포를 성장 하는 발판으로 ECM 어떻게 구성 및 extracellular 환경 아키텍처 셀에 에이즈 청력 기능을 유지 하는 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 우리는 분리 하 고 건설 기계 성인 줄기 세포 끼얹는다 수락으로 사용 하는 마우스에서 cochleae를 decellularizing 하는 방법을 제시. 현재 프로토콜에서 cochleae 안락사 쥐, decellularized, 그리고 석 으로부터 격리 됩니다. 그 후, 탯 줄에서 고립 된 인간의 튼 젤리 셀 (hWJCs) 각 달팽이 관에 끼얹는다 신중 하 게 했다. cochleae 생물 반응 기, 사용 하 고 셀 분석에 대 한 처리를 진행 하기 전에 30 일 동안 배양 되었다. Decellularized cochleae 식별 extracellular 구조를 유지 하지만 DNA의 현저한 조각 또는 셀의 존재를 공개 하지 않았다. 셀 달팽이 관에 끼얹는다 인테리어와 달팽이 관의 외관의 대부분을 침공 하 고 30 일의 기간 동안 사고 없이 성장 했다. 따라서, 현재 방법 어떻게 인공 ECM에 영향을 미치는 세포 발달 및 행동 연구를 사용할 수 있습니다.

Introduction

달팽이 관은 측 뼈에서 발견 하는 복잡 한 나선형 구조. 그것은 외부 뼈 미로 동심, 내부 membranous 미로¹로 구성. Membranous 미로 3 유체 공간 구성: 스칼라 vestibuli, 스칼라 언론과 Scala tympani¹. 스칼라 미디어 하우스 수많은 종류의 세포로 구성 되어, 감각 상피, 하지만 감각 머리 세포 (HC), 신경 충 동²음파 기계적 에너지 transduce는 특정 관심의. 음향 외상^3,,45, 약⁶, 질병^7,8, 및 노화⁹ 노출 모두 HC 죽음 통해 장애인된 청각 기능 발생할 수 있습니다. 포유류에서 머리 세포 손실 부상¹⁰후 재생성 수 조류 HCs 달리 영구적 이다.

다양 한 현대 연구 노력 하고자 했다 손실된 HCs 복원 특정 실험적인 접근 다르지만. 감각 상피에 유전자 발현의 조작 및 몸 밖에 서 분화 하는 줄기 세포의 주입은 필드에서 지배적인 접근 인공 organoids로 줄기 세포를 분화 하는 유도 방법 있다 지만 시도^11,,1213. 이 방법의 각각은 줄기 세포 나 줄기 세포; 사용 발달 큐에 직접 의존 그러나, 두 번째 공유 하 고 잠재적으로 중요 한 요소는 달팽이 관 자체의 ECM^14,15.

ECM 뿐만 아니라 세포와 조직, 세포 접착, 확산, 생존, 및 마이그레이션에 대 한 서피스를 포함 하지만 또한 HCs와 나선형 ganglion^{15,16의 개발에 중요 한 역할에 대 한 물리적 지원 제공 ,17}. 자연스럽 게 발생 ECM는 세포 표현 형 결정 및 세포 접착, 확산, 그리고 생존¹⁸가이드 수 유도 신호를 제공 합니다. 따라서, 교양된 hWJCs와 함께에서 decellularized 달팽이 관의 사용 ECM HC 재생의 역할을 탐구 하는 독특한 기회를 제공 합니다. HWJCs는 중간 엽 줄기 세포¹⁹처럼 인간의 탯에서 고립 된 쉽게 사용할 수, 비 논란이 셀 유형입니다. HWJCs는 neurosensory 세포 계보^20,21아래로 차별 하는 능력을 보여주었다. 따라서, 현재 프로토콜 절연, decellularization, 및 cochleae 내가 조직 공학에 대 한 hWJCs와 C57BL 마우스 시체에서의 관류 자세히 설명합니다.

Protocol

동물 안락사를 포함 하 여 모든 절차는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 프로토콜 (ACUP #2014-2234) 캔자스의 대학 의료 센터 (KUMC)에 따라 실시 했다.

참고: HWJCs 동의 제공 하는 환자에 의해 기증 된 인간 탯 으로부터 격리 되었고 표본 캔자스의 대학 인간 주제 위원회 (구 IRB #15402)에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 사용 했다.

1. 측 뼈 수확과 달팽이 관 절연

1. 수술가 위, 날카로운 쌍 두개골과 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 적절 하 게 안락사, 15 주 된 마우스를 목을 벨 다음 스프레이로 소독 (그림 1A) 70% 에탄올과 머리.
2. (그림 1B-C, 파선) 수술가 위 같은 날카로운 쌍을 사용 하 여 중간에 화살 평면에서 두개골 이등분
3. (그림 1D, 화살촉) 집게의 쌍을 사용 하 여 두개골에서 뇌 조직을 제거 합니다.
4. 청각의 존재 및 두개골 및 외관 (1 층 그림, 화살표)에서 외가도의 내부에 vestibular 신경 뿌리 (그림 1E-F, 화살촉) 통해 측 뼈를 식별 합니다. 측 뼈 두개골 (그림 1G)의 나머지에서 분리 두개골을 통해 조심 스럽게 잘라.
   참고: 어떤 경우에, 그것 가능 할지도 모른다 섬세 하 게 절단 하지 않고도 측 뼈에서 두개골의 주변 뼈를.
5. 그래서 팁 달팽이 puncturing 위험 하지 않습니다 약 5 m m (그림 1 H), 외가도의 개통으로 미세 집게를 삽입 합니다. 부드럽게 깨 물집 (그림 1 H, 상단 빨간색 음영 처리 된 영역)의 뼈 그래서 그것 골절 (1I 그림, 빨간 점선 라인).
   참고: 필요한 경우, 해 부 현미경 수 있습니다 원조이 과정에서 정확 하 게 배치 하 고 악기의 조작.
6. 미세 집게를 사용 하 여, 놀 리 려 멀리 측 뼈, 뼈 미로 달팽이 관 (그림 1J, 빨간 괄호)의 노출에서 물집의 나머지.
7. 페 트리 접시 측 뼈를 충분히 큰 장소 (예를 들어, 30 m m 이상)는 해 부 아래 시야 범위와 함께 충분 한 인산 염 버퍼링 염 분 (PBS) 측 뼈 (예를 들어, 0.5 ~ 1 mL)를 작성.
8. 향하도록 하는 달팽이 관의 타원형과 둥근 창문이 PBS에 제거 물집과 측 뼈를 잠수함.
   참고: 달팽이 관에서 vestibular 시스템의 제거 필요는 없습니다,로 vestibular 시스템 역할 잘 조작 하 고 방향을 (1I 그림 및 그림 2B) 달팽이 관의 기능에 대 한 핸들.
9. 집게의 초 미세 쌍을 사용 하는 등골을 통과 stapedial 동맥을 제거 합니다.
10. 어디 동맥을 통과 하는 등골의 아치를 통해 초 미세 집게의 한 끝을 삽입 하 고 섬세 하 게 위쪽으로 등골을 리프트. Disarticulated 등골 타원형 창에서 리프트 해야 합니다.
11. 초 미세 집게의 한 팁을 사용 하 여 타원형 펑크 및 windows를 둥근.
12. 튜빙 28.5 게이지 주사기 가득 1 x PBS를 사용 하 여 (내부 직경 0.28 m m, 외경 0.61 m m) 타원형 창 튜브를 놓고, (그림 2A -B).
    참고: 튜브의 오프닝 조작할 수 있습니다 정확 하 게 배치 되도록 돕는 초 미세 집게를 사용 하 여.
    1. 신선한 주사기와 튜브를 사용 하 여 각 달팽이 관에 대 한.
13. 10% 항생제 antimycotic (방지) 및 10% 페니실린-스 (펜-strep) PBS에 5 분 이상 달팽이 관을 통해 제거 하는 perilymph의 2 개 mL perfuse 너무 빨리 너무 많은 압력으로 perfusing는 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 것입니다.
    참고: 수동으로 perfuse 달팽이 관을 통해 액체를 손으로 주사기 운전은 효과적 이다, 관류 펌프 대신으로 사용 될 수 있지만.
    1. 수동으로 perfusing, 자동 폐쇄 달팽이 관 (그림 2A) 안정 집게 관류 동안 측 뼈의 vestibular 부분을 파악,의 쌍을 사용 합니다.
       참고: 필요 하지 않지만 이것은 두 손을 자유롭게 처리 계기; 다른 튜브를 배치할 수 있습니다 하는 동안 한 손으로 주사기 (그림 2A)를 구동할 수 있다 적절 하 게 (그림 2B).
    2. 이 단계에서 앞으로, 공기에 불필요 하 게 달팽이 관을 노출 하지 않도록 주의. 유체 순환 차단 유체 공간으로 기포를 도입 하 고 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 더 밖으로 건조.
14. 제거 하 고 미세 집게를 사용 하 여 하 모든 나머지 근육 조직과 뼈 파편을 삭제.
15. 필요한 경우, 최대 7 일간 항생제 솔루션 모든 48 h의 일정 변경에 대 한 10% 방지와 PBS에서 10% 펜 strep 솔루션에 4 ° C에서 고립 된 cochleae를 저장 합니다.

2. 인공 처리

1. Decellularization
   1. 각 달팽이 관에 대 한 채우기 20 mL 유리 섬광 유리병으로 1% 나트륨 라우릴 황산 드 이온된 (DI) 수, 달팽이 관을 decellularize 하는 데 사용 되는에 (SDS) 솔루션.
   2. 개통은 달팽이 관 통과를 위해 충분히 큰 되도록 면도날을 사용 하 여 플라스틱 7 mL 전송 피 펫의 끝을 잘라.
   3. 전송 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 그릴 달팽이 관 피펫으로에 그래서 그것은 단지 몇 밀리미터에 의해 잘라 가장자리를 전달.
   4. 1 %SDS 솔루션 가득 섬광 유리병에 달팽이 관을 추방.
   5. 전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 드 이온된 (DI) 수에서 1 %SDS 2 개 mL를 순환.
   6. 회전으로 섬광 유리병을 놓고 실내 온도에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다.
      1. 1 %SDS 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 결코 공기에 달팽이 관을 노출 하는 SDS를 변경할 때 주의 합니다.
   7. 디 물으로 30 분 각각에 대 한 세 번 달팽이 관을 세척.

SDS 요금; 사용 같은 섬광 유리병에는 세척을 수행 이 단계에서 달팽이 관은 decellularized입니다.

Decalcification

1. 충분히 빠져들 달팽이 관을 계속 떠나 섬광 유리병에서 나머지 디 물을 제거 합니다.
2. Decalcification를 하려면, 달팽이 관을 포함 하는 섬광 유리병에 디 물에 10 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.02 M)의 5 mL을 추가 합니다.
3. 전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 디 물에 10 %EDTA 2 개 mL를 순환.
4. 회전에 다시 섬광 유리병을 놓고 실 온에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다. 10 %EDTA 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 달팽이 관은 공기에 노출 되지 않습니다 있도록 솔루션을 변경할 때 주의 합니다.
5. 2 h 각 1 x PBS;에 대 한 3 번 달팽이 린스 이 단계에서 달팽이 관은 석.

스토리지

1. 10% 방지, 10% 펜 strep 솔루션에 PBS에서 4 ° c.에 최대 72 h에 대 한 cochleae를 저장
   참고: 긴 저장 기간 항생제 솔루션;의 일정 변경 가능 있을 수 있습니다. 그러나, 처리 된 cochleae의 확장된 저장이이 프로토콜에서 검증 되지 않았습니다.

3. 조달 및 hWJCs의 확장

1. 이전에 게시 프로토콜²²에 따라 hWJCs를 격리 합니다. 간단히, 3 cm 섹션으로 탯 세그먼트.
2. 조심 스럽게 만들 메스로 절 개를 얕은 세로 각 탯 선분을 풀 튼의 젤리 탯의 노출에. 집게를 사용 하 여 혈관을 제거.
3. 조직 잠수함 탯 세그먼트 (예를 들어, 60 mm 페 트리 접시에에서 40 mL) 충분 한 PBS로 두 번 씻는 다. 가늘게 조직 세그먼트 메스를 말하다. 다이제스트 100 mm 페 트리 접시 소화 매체의 50 mL와 조직 (0.2 %2 형 콜라, 1% 페니실린-스, 낮은 혈당에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)).
4. 소화는 5% CO₂, 37 ° C 배양 기에서 1 박 50 rpm에서 궤도 통에 중간에 티슈를 놓습니다. 다음 날, 소화 매체 2% 항생제-PBS에서 antimycotic에 1시 16분의 비율로 희석 하 고 실 온에서 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 (~ 27 ° C) 10 분 삭제 상쾌한에 대 한.
5. Resuspend 펠 릿 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM)에서 하 고 세포를 재결합. 조직 문화에 7 x 10³ 셀/c m² 의 조밀도에 접시 셀 T-75 플라스 크 취급. MSCGM에서 HWJCs 문화 한 통로 5 실험을 확장 합니다.
   참고: HWJCs 수 수 하위 양식 큰 T-플라스 크로 (예를 들어, T-150, T-300) 실험에 대 한 hWJCs의 수확량 증가를 뿌리고 때.

4입니다. Decellularized Cochleae에 hWJCs의 주입

1. Decellularized cochleae을 준비
   1. 무 균 기술을 사용 하 여, 3 시간 30 분 대 한 1 x PBS에 저장된 cochleae 세척.
   2. Cochleae 24-잘 접시의 별도 우물으로 전송 하 고 37 ° C의 1 mL를 추가 MSCGM를 미리 예 열.
   3. Cochleae는 5% CO₂, 세포의 주입 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 품 어.
2. 해리 hWJCs 및 resuspend
   1. 37 ° c 워시 hWJCs 전 두 번 1 x PBS를 따뜻하게합니다.
   2. 37 ° c 충분 한 사전 예 열 셀 선박 표면에 0.5 %EDTA 트립 신.
   3. HWJCs는 5% CO₂, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 최대 5 분을 품 어.
      1. 세포의 90%는 거꾸로 현미경 세포를 확인 하 여 세포 문화 표면에서 분리 된 확인 합니다.
         참고: 때 문화 배 도청 부드럽게 이동 하는 셀 분리 했습니다. 셀 고정, 남아 있는 분리 하지 있다.
      2. 부드럽게 연결 된 셀을 더 꺼내 려 플라스 크의 측면을 누릅니다.
   4. 무 균 기술을 사용 하 여, 해당 볼륨 MSCGM의 Trypsin의 볼륨을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 문화 선박에서 전송 hWJCs는 세포 분열을 사용.
   5. 실 온에서 500 x g에서 centrifuging 여는 hWJCs 작은 (~ 27 ° C) 5 분.
   6. 상쾌한, 발음 하 고 500, 000 셀/mL의 농도에서 MSCGM에 hWJCs를 resuspend.
3. Cochleae perfuse
   1. Cochleae 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 24-잘 접시에 전송 합니다.
   2. 어떤 달팽이 관 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 각 달팽이 관에 MSCGM의 한 방울을 추가 합니다.
   3. 섬세 하 게 타원형과 둥근 창문을 향하도록 하 초 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관을 방향을 정하십시오.
      참고: 주의 극단적인 달팽이 관 손상 쉽게 각 달팽이 관을 직접 처리 하는 경우.
   4. 살 균 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 연결 된 튜빙, 0.2 mL resuspended hWJCs (100000 셀)를 그립니다.
   5. 멸 균된 미세 집게를 사용 하 여 케이블의 튜빙을 타원형 창에 놓으십시오.
   6. 섬세 하 게 그리고 천천히 perfuse 폴 리 에틸렌 튜브에 연결 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 resuspended hWJCs의 0.2 mL와 달팽이 관 (외경: 0.61 m m, 내경: 0.28 m m) 약 5 분 이상.
   7. 관류, 후 37 ° C의 0.8 mL를 추가할 필요는 잘 포함 하는 잘에서 1 mL 전체 볼륨을가지고 달팽이 관에 MSCGM를 미리 따뜻하게.
   8. 각 달팽이 관, 신선한 주사기를 사용 하 고 각 시간을 튜브에 대 한 4.3.3-4.3.7 단계를 반복 합니다.
   9. 5% CO₂, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터, 끼얹는다 cochleae를 놓고 미디어 주 당 3 시간을 변경 합니다.

5. 달팽이 수확 및 보존

참고: Cochleae 그리고 경작 수 있습니다 최대 30 일 후 관류 시간 언제 든 지 수확.

1. Cochleae를 유지 하려면 1 x PBS 락 플랫폼에 4 ° C에서 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 수정 했다.
2. 고정, 후 5 분에 대 한 세 번 1 x PBS 가진 cochleae 세척.
3. 점차적으로 에탄올과 달팽이 관을 탈수 하 고 파라핀에 포함 하기 전에 지방 족 탄화수소 용 매로 취소 합니다.
4. 에 톰 및 마운트를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 섹션 샘플 현미경 슬라이드 유리.
   참고: 샘플 준비가 이제 조직학 immunohistochemical 처리 표준 프로토콜을 사용 하 여 또는.

Results

여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, cochleae의 성공적인 decellularization 4'를 통해 DNA의 유무를 검사 하 여 평가 했다 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩. Cochleae는 DNA 이었다 decellularized 달팽이 관 내에서 확인 되지 않는 경우 완전히 decellularized로 간주 됐다. Decellularization 또는 decalcification을 받을 하지 않았다 이전 실험에서 네이티브 달팽이 관 구조와 전통적으로 C57BL 마우스 달팽이 관에 있는 세포를 설명 하기 위해 긍정적인 제어로 사용 되었다. 어떤 hWJCs를 주입 하지 않은, decellularized-석된 달팽이 관, 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 아니 정량 DAPI 스테인드 세포 핵 조직 단면도 (그림 3)의 어떤 지역에서 관찰 되었다. 두 개의 cochleae de...

Discussion

우리는 성공적으로 복잡 한 3 차원 조직 발판으로 달팽이 관의 사용을 허용 하는 decellularization 과정을 통해 달팽이 관에서 네이티브 인공 세포를 제거할 수 있습니다 시연 했다. 산 티 외. ¹⁵ decellularizing cochleae에 대 한 초기 방법을 개발 하 고 정확 하 게 빛 시트 현미경²³의 도움으로 많은 인공 구조를 통해 볼륨 견적 했다. 이러한 초기 작업 조직 엔지니어링과 세포 문화 기술을 여기에 대 한 강력한 기반으로 재직 했습니다. Decellularized 달팽이 관 수 성공적으로 융합 세포, 그리고 그 시간의 연장된 기간에 대 한 교양. 다양 한 동물에서에서 cochleae 수 이론적으로 세포 유형의 다양 한 유사 하 게와 함께 활용할 수 있습니다. 이러한 조합을 허용 여기에 제시 된 수많은 가능한 실험적인 디자인, 감각 상피 개발¹⁴검사, 약물...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra X-14R 원심분리기	Beckman-Coulter	B08861
Intramedic Semi-Rigid Tubing	Becton Dickinson	427401
New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler	Eppendorf	M1190-0002
수술용 가위	정밀 과학 도구	14060-10
미세 집게	정밀 과학 도구	11370-40
초미세 집게	미세 과학 도구	18155-13
50mL 원뿔형 튜브	Fisher Scientific	12565271
페트리 접시	Fisher Scientific	FB087579B
U-100 인슐린 주사기	Fisher Scientific	14-829-1B
섬광 바이알	Fisher Scientific	03-341-73
	Rotator Fisher Scientific	88-861-049
트랜스퍼 피펫	Fisher Scientific	22-170-404
면도날	Fisher Scientific	12-640
항생제-항진균제	Fisher Scientific	15-240-062
페니실린-스트렙토마이신	Fisher Scientific	15-140-122
24웰 플레이트	Fisher Scientific	07-200-84
SuperFrost PLUS 유리 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-15
전사 피펫	Fisher Scientific	22-170-404
DAPI가 포함된 ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36935
Clear-Rite 3	Fisher Scientific	22-046341
Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 인큐베이터	Fisher Scientific	13-998-078
중간엽 줄기세포 성장 배지	Lonza	PT-3001
Trypsin-EDTA	Lonza	CC-3232
TPP T-75 배양 플라스크	MidSci	TP90076
TPP T-150 배양 플라스크	MidSci	TP90151
TPP T-300 배양 플라스크	MidSci	TP90301
해부 현미경	니콘 기기	SMZ800
니콘 이클립스 Ts2R-FL 도립 현미경	니콘 기기	MFA51010
NuAire 클래스 II, 유형 A2 생물 안전 캐비닛	NuAire	NU-425-600
1X PBS	시그마-알드리치	P5368-10PAK
1% SDS 솔루션	Sigma-Aldrich	436143-100G
10% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G