DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

요약

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

초록

DNA 얼룩 메서드는 생물 의학 연구에 매우 중요 하다. 우리 설계 색된 침전의 형성에 의해 육안으로 DNA 시각화를 허용 하는 간단한 방법. 아크릴 아 미드를 몸을 담글 하 여 작동 또는 agarose DNA SYBR 녹색 1 x (2.0 µ M에 해당)의 해결책에 있는 젤 나 (SG 나) 보라색을 생성 하는 0.20 m m 블루 니트로 tetrazolium formazan 햇빛에 드러낼 때의 침전 또는 특별히 라이트 블루. 또한, DNA 복구 테스트가 우리의 방법으로 얼룩진 agarose 젤에는 암 피 실린 내성 플라스 미드를 사용 하 여 수행 되었습니다. 식민지의 많은 수와 함께 전통적인 보다 우리의 방법으로 얻은 SG를 사용 하 여 얼룩이 나 자외선 조명. 설명된 방법, 특정, 및 비-독성 DNA 검색, 시각화는 transilluminator 없이 "육안" 생체의 수 이며 저렴 하 고 필드 사용에 대 한 적절 한입니다. 이러한 이유로, 우리의 새로운 DNA 방법 얼룩이 지는 연구와 산업에 잠재적인 이점이 있습니다.

서론

생화학과 분자 생물학의 발전, DNA와 관련 된 연구는 DNA 분석을 더 나은 기술을 요구 했다. DNA 얼룩에 대 한 첫 번째 방법은 실버 얼룩, 매우 민감한 하지만 부족 선택 이었고 샘플 복구를 허용 하지 않습니다. 나중에, 형광 DNA 얼룩의 개발 샘플 복구의 가능성과 함께 DNA의 선택적 정량화를 허용. 첫 번째 형광 염료 DNA 정량화 사용 중 하나는 돌연변이²ethidium 평범한 사람¹, 이었다.입니다. 그러나, 이제는 안전 하 고 더 민감한, GelRed, SYBR 녹색 등 향상 된 형광 염료 나 (SG 나)³; 그러나 모두 이러한 형광 염료의 자외선 (UV) transilluminator 또는 fluorimeter의 사용을 요구 한다.

가시 메 틸 렌 블루⁴ 등 크리스탈 바이올렛^5,6,7,,89, DNA, 얼룩에 대 한 다른 기술이 있다 하지만 이러한 모든 감소 된 감도에서 고통 및 선택도입니다. Tetrazolium 소금은 유기 화합물 감소, 취약 하 고이 경우 그들은 형성 된 불용 성 색된 formazan 침전^10,11. 최근, 일부가 tetrazolium 소금 그들의 긍정적인 tetrazolium 반지¹²때문에 DNA에 바인딩할 표시 되었습니다.

최근 게시¹³, 얼룩 polyacrylamide 젤에서 DNA를 계량 하는 새로운 표시 기술 제안 했다, 니트로 블루 tetrazolium (NBT) 불리고 ethidium 평범한 사람, GelRed, 같은 형광 염료가 tetrazolium 소금의 감소를 사용 하 여 SYBR 녹색 어 SYBR 골드. 푸른 빛 또는 햇빛 있을 때 일을 하 고 향상 된 품질로 샘플 복구 허용이 반응에 비해 SG 사용 하 여 나 UV transilluminator와 함께. 이 문서의 목적은 tetrazolium를 사용 하 여 착 색 기술의 상세한 프로토콜 제공 하 염입니다.

프로토콜

1. 준비 하 고 실행 하는 젤

1. 비 변성 시키기 12 %polyacrylamide 젤 젤 Sambrook와 러셀¹⁴ 에 찾았지만 SDS 대신 물을 사용 하 여 나트륨 라우릴 황산 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제조 법을 사용 하 여 준비 합니다.
   1. 젤을 해결의 5 mL를 준비 하려면 1.7 mL 증류수, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 2 개 mL, 1.5 M Tris pH 8.8의 1.3 mL, 10% 염화 persulfate의 0.05 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다.
   2. 준비의 겹쳐 쌓이는 젤 2 mL 물 1.5 mL, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 0.33 mL, 1 M Tris pH 6.8의 0.25 mL, 10% 염화 persulfate, 0.02 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다. 젤의 크기는 7.3 c m x 8.2 c m 0.075 x cm (l x w x d).
      참고: 0.75 m m 두께의 15 잘 빗을 사용 하 여 최고의 감도 대 한.
2. 버퍼 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (6 x 로딩 버퍼 DNA 샘플의 5 µ L의예: 사용 1 µ L)에 DNA 샘플 로드 x 6의 적절 한 금액을 추가 합니다.
3. 수직 전기 영동 챔버에 젤을 놓습니다.
   1. 2 젤을 실행 1 x TAE 버퍼의 750 mL 챔버를 채우십시오. 50의 1 리터를 준비 하기 x TAE, 트리 스 기지의 442 g, 빙 초 산의 57.1 mL 및 100 mL의 0.5 M EDTA pH 8 사용 하 여. 증류수 1 l.의 최종 볼륨을 추가
   2. 젤에서 샘플을 로드 합니다. 100 V 2 h에 젤을 실행 합니다.
4. 또는, Sambrook¹⁴에서 제조 법을 사용 하 여 1 x TAE agarose 젤 준비.
   1. 1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 V에서 45 분 젤을 실행 합니다.

2. NBT SG 나 얼룩 (그림 1).

1. 아크릴 아 미드 젤 얼룩입니다.
   1. 솔루션을 준비: 0.1 %w / v NBT 및 1.2 SG x 나.
      참고: 그것은 ethidium 평범한 사람, GelRed 그리고 SYBR 골드 SG 대신 사용할 수, 하지만 SG 최상의 성능을 했다.
   2. 1.2의 16.75 mL를 붓고 x SYBR 그린 나 적절 한 크기의 용기에 솔루션.
      참고: 우리는 컨테이너, 피 펫 팁 상자 뚜껑을 사용 하 고 이러한 볼륨 커버 젤;이 컨테이너를 사용 하 여 계산 됩니다. 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l).
   3. 솔루션에는 젤을 놓습니다. 0.2 m m NBT 주고 0.1 %w / v NBT 솔루션의 3.25 mL을 추가 및 1 x (2.0 µ M에 해당) SG 나 최종 농도.
   4. 플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.
      참고: 플라스틱 필름 튀는 방지 하 고 얼룩 솔루션으로 알루미늄 호 일의 반응을 방지 하는 데 사용 됩니다.
   5. 25 분 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.
   6. 알루미늄과 플라스틱 커버를 제거 합니다. 최대 90 분 동안 햇빛에 노출. 관심의 밴드 표시 될 때까지 5 분 마다 확인 합니다.
   7. 푸른 빛을 사용 하려면 3 발광 다이오드 (LED)와 protoboard를 준비 하 고 젤 표면 (표, 시간으로 얼룩 LED 광원의 강도에 따라 달라 집니다 필요)에서 약 5 m m Led를 배치 합니다.
2. Agarose 젤 얼룩입니다.
   1. 준비 하 고 실행 하는 1 %agarose 젤 1.4 섹션에 설명 된 대로 후 (크기는 1 cm x 6.2 cm x 7 cm; l x w x d), 이러한 수정 2.1에서 동일한 단계를 수행:
   2. 1.2의 41.9 mL를 붓고 SG x 나 피 펫 팁 상자;의 뚜껑으로 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l). 0.1 %NBT 솔루션의 8.1 mL를 추가 합니다.
   3. 플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.
   4. 1 h 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.

3. 데이터 분석입니다.

1. NBT SG 나 보정 곡선.
   1. 1200 dpi에서 스캔 하 여 젤 이미지를 얻을.
   2. 이미지 분석을 위한 오픈 소프트웨어입니다. 이미지 편집기를 사용 하 여 이미지 직선 화. 이미지 densitometry를 실행 합니다.
   3. 곡선 아래 면적을 계산 합니다. DNA 농도 대 신호/신호_최대 의 그래프를 준비 합니다.

4. DNA 복구입니다.

1. 1에 1 %agarose 젤 준비 제조 법을 사용 하 여 x TAE Sambrook¹⁴에서 발견.
2. 1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 ng / µ L pDJ100¹⁵ 플라스 미드 DNA 사다리 구조 그림 2에 다음의 4 µ L을 로드 합니다. 100 V에 1 시간을 위한 젤을 실행 합니다.
3. 표시와 두 2 mL microcentrifuge 튜브 무게.
4. 젤을 두 개의 동일한 반쪽 위해서는 중간에 삭감. 각은 사다리 및 다른 얼룩 기법 비교 샘플 플라스 미드를 포함 해야 합니다. 그림 2에 도식 적인 표현이입니다.
5. 얼룩 하나 절반 NBT SG 나 2 단계에서.
   1. 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드를 잘라. 젤 조각 한 튜브에 저장 하 고 무게.
6. SG와 젤의 다른 부분에 얼룩이 나 1의 50 mL와 함께 SG x 나 솔루션 천천히 어둠 속에서 (60 rpm) 1 시간을 위한 젤을 흔들어.
   1. transilluminator에 젤을 놓고 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드 2 분 컷에 대 한 노출 합니다.
   2. 다른 튜브에 젤 조각을 저장 하 고 무게.
      참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기-20 ° c.에 튜브를 유지 하면서
7. 플라스 미드 추출 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 수행 합니다.

5. 플라스 미드 정규화입니다.

1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출 된 플라스 미드의 10 µ L와 내가 물 형식의 60 µ L를 추가 합니다. 믹스 60 µ L 석 영 cuvette에 전송 하거나는 Nanodrop에서 직접 2 µ L를 사용 하 여.
2. 230 320 사이 흡수 스펙트럼을 측정 nm. 다음 수식을 사용 하 여 샘플의 플라스 미드 농도 계산.
   
   여기서 D 는 적용 희석 요소 (이 경우에 그것은 70/10), A_x 는 x nm에서 흡수 하 고 50 µ g/ml dsDNA에 대 한 변환 인수입니다.
3. 9.1 ng / µ L를 희석 샘플입니다.
4. 대장균 (대장균) 유능한 세포 (예: XL10 금) 변환 다음 희석 샘플의 5 µ L를 사용 하 여 이노우에 변환 절차¹⁶ .
5. 배양 접시에 식민지의 수를 계산 하 고 희석 합니다. 다음 수식¹⁷:: 콜로 니 형성 단위 (CFU) 계산
   
   여기서 D 는 초기 문화에서 적용 되는 희석 비율입니다.
6. 짝이 없는 t-검정을 수행 합니다.

결과

자주색 formazan 침전 (질량 분석¹³확인) DNA는 나타납니다. 실험에서 DNA 사다리 보정 곡선 (그림 3)을 로드 했습니다. 아크릴 및 agarose 젤에 대 한 프로토콜 작동 하지만 낮은 강도 있으며 agarose에서 더 긴 시간이 걸립니다. 그러나, agarose 젤의 사용 수 상용 키트를 사용 하 여 샘플의 복구 하 고 추출을 방해 하지 않습니다. 블루 Led와 함께이 메서드를 사용 하 여 복구 샘플 SG에 비해 더 나은 품질을가지고 나는 transilluminator (그림 4)를 사용 하 여.

토론

소설과 민감한 DNA 방법 얼룩 NBT의 감소 및이 문서에서 제시 했다 SG의 사용에 따라. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 NBT SG에 젤의 부 화 시간이 나 솔루션 및 NBT의 농도. Agarose 젤에 대 한 착 시간 agarose 젤 큰 두께 때문에 아크릴 아 미드 젤에 대 한 이상 이다. 이 메서드는 NBT 그것 접촉 침전으로 SDS 존재 잘 작동 하지 않습니다. 젤 보라색 배경 얻습니다, 경우 다른 젤 준비는 것이 좋습니다 및 빛의 노출 시간을 줄이기 위해. Agarose 젤은 스테인드 하는 경우 충분 한 감도 아니다 빛의 노출 시간을 증가 하는 것이 좋습니다. 감도의 부족 젖 침전은 젤에 존재 하는 경우이 SDS 오염의 결과 수 있습니다. 이 경우, 새로운 젤을 준비 하 고 착 색 시 약을 추가 하기 전에 그것을 씻어.

파란색 LED 또는 햇빛에서 자연적으로 블루 빛 현재의 빛에서 제공 하는 여부는 강수량 블루 빛 조명에 의해 발생 합니다. 이 때문에, 기술의 한계...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염색에 사용되는	니트로 블루 테트라졸륨	Gold Biotechnology	298-83-9
SYBR Green I 10000X	Thermo-Fisher	S7563	시약 염색
젤 추출 키트	QIAGEN	28704	에서 겔에서 플라스미드를 추출하는 데 사용됩니다
			보정 곡선을 만들고 무결성 분석에서 절단 밴드를 참조하는 데 사용됩니다
Agar Agar	Merck		는 LB-ampicillin 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다
염화나트륨	Merck	1064045000	LB-ampicillin 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다
효모 추출물	Becton, Dickinson and Company	212750	LB-암피실린 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다
펩톤	Merck	72161000	LB-암피실린 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다
TEMED	AMRESCO	761	폴리 아크릴아미드 겔 제조에 사용
과황산 암모늄	Calbiochem	2310	폴리 아크릴아미드 겔 제조에 사용
아크릴아미드	invitrogen	15512-023	폴리아크릴아미드 겔 제조에 사용
비스아크릴아미드	SIGMA	146072	폴리아크릴아미드 젤
Tris-base	Merck	1083821000	제조에 사용TAE 완충액 및 비변성 폴리아크릴아미드 겔 트리스-HCl 완충액
EDTA	JT Baker	8993-01	TAE 완충
아세트산	Merck	1,000,632,500	TAE 완충액
아가로스	Merck	16802	TAE 완충
분광 광도계	Tecan	infinite 200 pro	DNA 플라스미드
를 정량화하는 데 사용물 purificatiom 단위	Merck	Elix 100	분광 광도법 및 DNA 희석에 사용되는 물 유형 1 (ASTM)을 만드는 데 사용
증류수		-	젤, 배양 매체, 염색 및 일반 용액에 사용되는
HCl	J.T. Baker	9535-03	비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 tris-HCl 버퍼
6X DNA 로딩 염료	Thermo-Fisher	R0610
5mm 블루 LED	Jinyuan 전자	SP-021	광원은 무결성 분석
프로토보드	KANDH	KH102	광원 지원 및 회로에 사용됩니다
9 V 배터리	Duracell-LED		에 전원을 공급하는 데 사용됩니다
	Biorad	1704486EDU	는 무결성 분석에서 아가로스 젤을 만들고 실행하는 데 사용됩니다.
수직 전기영동 키트	Biorad	1658002EDU	는 보정 곡선에서 폴리아크릴아미드 젤을 실행하는 데 사용됩니다.
공급 장치	Biorad	1645050	전기영동에 전원을 공급하는 데 사용됩니다.