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방법 논문

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

9.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56528

⸱

2018년 1월 28일

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

이 논문에서

요약

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

초록

DNA 얼룩 메서드는 생물 의학 연구에 매우 중요 하다. 우리 설계 색된 침전의 형성에 의해 육안으로 DNA 시각화를 허용 하는 간단한 방법. 아크릴 아 미드를 몸을 담글 하 여 작동 또는 agarose DNA SYBR 녹색 1 x (2.0 µ M에 해당)의 해결책에 있는 젤 나 (SG 나) 보라색을 생성 하는 0.20 m m 블루 니트로 tetrazolium formazan 햇빛에 드러낼 때의 침전 또는 특별히 라이트 블루. 또한, DNA 복구 테스트가 우리의 방법으로 얼룩진 agarose 젤에는 암 피 실린 내성 플라스 미드를 사용 하 여 수행 되었습니다. 식민지의 많은 수와 함께 전통적인 보다 우리의 방법으로 얻은 SG를 사용 하 여 얼룩이 나 자외선 조명. 설명된 방법, 특정, 및 비-독성 DNA 검색, 시각화는 transilluminator 없이 "육안" 생체의 수 이며 저렴 하 고 필드 사용에 대 한 적절 한입니다. 이러한 이유로, 우리의 새로운 DNA 방법 얼룩이 지는 연구와 산업에 잠재적인 이점이 있습니다.

서론

생화학과 분자 생물학의 발전, DNA와 관련 된 연구는 DNA 분석을 더 나은 기술을 요구 했다. DNA 얼룩에 대 한 첫 번째 방법은 실버 얼룩, 매우 민감한 하지만 부족 선택 이었고 샘플 복구를 허용 하지 않습니다. 나중에, 형광 DNA 얼룩의 개발 샘플 복구의 가능성과 함께 DNA의 선택적 정량화를 허용. 첫 번째 형광 염료 DNA 정량화 사용 중 하나는 돌연변이2ethidium 평범한 사람1, 이었다.입니다. 그러나, 이제는 안전 하 고 더 민감한, GelRed, SYBR 녹색 등 향상 된 형광 염료 나 (SG 나)3; 그러나 모두 이러한 형광 염료의 자외선 (UV) transilluminator 또는 fluorimeter의 사용을 요구 한다.

가시 메 틸 렌 블루4 등 크리스탈 바이올렛5,6,7,,89, DNA, 얼룩에 대 한 다른 기술이 있다 하지만 이러한 모든 감소 된 감도에서 고통 및 선택도입니다. Tetrazolium 소금은 유기 화합물 감소, 취약 하 고이 경우 그들은 형성 된 불용 성 색된 formazan 침전10,11. 최근, 일부가 tetrazolium 소금 그들의 긍정적인 tetrazolium 반지12때문에 DNA에 바인딩할 표시 되었습니다.

최근 게시13, 얼룩 polyacrylamide 젤에서 DNA를 계량 하는 새로운 표시 기술 제안 했다, 니트로 블루 tetrazolium (NBT) 불리고 ethidium 평범한 사람, GelRed, 같은 형광 염료가 tetrazolium 소금의 감소를 사용 하 여 SYBR 녹색 어 SYBR 골드. 푸른 빛 또는 햇빛 있을 때 일을 하 고 향상 된 품질로 샘플 복구 허용이 반응에 비해 SG 사용 하 여 나 UV transilluminator와 함께. 이 문서의 목적은 tetrazolium를 사용 하 여 착 색 기술의 상세한 프로토콜 제공 하 염입니다.

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프로토콜

1. 준비 하 고 실행 하는 젤

  1. 비 변성 시키기 12 %polyacrylamide 젤 젤 Sambrook와 러셀14 에 찾았지만 SDS 대신 물을 사용 하 여 나트륨 라우릴 황산 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제조 법을 사용 하 여 준비 합니다.
    1. 젤을 해결의 5 mL를 준비 하려면 1.7 mL 증류수, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 2 개 mL, 1.5 M Tris pH 8.8의 1.3 mL, 10% 염화 persulfate의 0.05 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다.
    2. 준비의 겹쳐 쌓이는 젤 2 mL 물 1.5 mL, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 0.33 mL, 1 M Tris pH 6.8의 0.25 mL, 10% 염화 persulfate, 0.02 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다. 젤의 크기는 7.3 c m x 8.2 c m 0.075 x cm (l x w x d).
      참고: 0.75 m m 두께의 15 잘 빗을 사용 하 여 최고의 감도 대 한.
  2. 버퍼 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (6 x 로딩 버퍼 DNA 샘플의 5 µ L의예: 사용 1 µ L)에 DNA 샘플 로드 x 6의 적절 한 금액을 추가 합니다.
  3. 수직 전기 영동 챔버에 젤을 놓습니다.
    1. 2 젤을 실행 1 x TAE 버퍼의 750 mL 챔버를 채우십시오. 50의 1 리터를 준비 하기 x TAE, 트리 스 기지의 442 g, 빙 초 산의 57.1 mL 및 100 mL의 0.5 M EDTA pH 8 사용 하 여. 증류수 1 l.의 최종 볼륨을 추가
    2. 젤에서 샘플을 로드 합니다. 100 V 2 h에 젤을 실행 합니다.
  4. 또는, Sambrook14에서 제조 법을 사용 하 여 1 x TAE agarose 젤 준비.
    1. 1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 V에서 45 분 젤을 실행 합니다.

2. NBT SG 나 얼룩 (그림 1).

  1. 아크릴 아 미드 젤 얼룩입니다.
    1. 솔루션을 준비: 0.1 %w / v NBT 및 1.2 SG x 나.
      참고: 그것은 ethidium 평범한 사람, GelRed 그리고 SYBR 골드 SG 대신 사용할 수, 하지만 SG 최상의 성능을 했다.
    2. 1.2의 16.75 mL를 붓고 x SYBR 그린 나 적절 한 크기의 용기에 솔루션.
      참고: 우리는 컨테이너, 피 펫 팁 상자 뚜껑을 사용 하 고 이러한 볼륨 커버 젤;이 컨테이너를 사용 하 여 계산 됩니다. 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l).
    3. 솔루션에는 젤을 놓습니다. 0.2 m m NBT 주고 0.1 %w / v NBT 솔루션의 3.25 mL을 추가 및 1 x (2.0 µ M에 해당) SG 나 최종 농도.
    4. 플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.
      참고: 플라스틱 필름 튀는 방지 하 고 얼룩 솔루션으로 알루미늄 호 일의 반응을 방지 하는 데 사용 됩니다.
    5. 25 분 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.
    6. 알루미늄과 플라스틱 커버를 제거 합니다. 최대 90 분 동안 햇빛에 노출. 관심의 밴드 표시 될 때까지 5 분 마다 확인 합니다.
    7. 푸른 빛을 사용 하려면 3 발광 다이오드 (LED)와 protoboard를 준비 하 고 젤 표면 (표, 시간으로 얼룩 LED 광원의 강도에 따라 달라 집니다 필요)에서 약 5 m m Led를 배치 합니다.
  2. Agarose 젤 얼룩입니다.
    1. 준비 하 고 실행 하는 1 %agarose 젤 1.4 섹션에 설명 된 대로 후 (크기는 1 cm x 6.2 cm x 7 cm; l x w x d), 이러한 수정 2.1에서 동일한 단계를 수행:
    2. 1.2의 41.9 mL를 붓고 SG x 나 피 펫 팁 상자;의 뚜껑으로 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l). 0.1 %NBT 솔루션의 8.1 mL를 추가 합니다.
    3. 플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.
    4. 1 h 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.

3. 데이터 분석입니다.

  1. NBT SG 나 보정 곡선.
    1. 1200 dpi에서 스캔 하 여 젤 이미지를 얻을.
    2. 이미지 분석을 위한 오픈 소프트웨어입니다. 이미지 편집기를 사용 하 여 이미지 직선 화. 이미지 densitometry를 실행 합니다.
    3. 곡선 아래 면적을 계산 합니다. DNA 농도 대 신호/신호최대 의 그래프를 준비 합니다.

4. DNA 복구입니다.

  1. 1에 1 %agarose 젤 준비 제조 법을 사용 하 여 x TAE Sambrook14에서 발견.
  2. 1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 ng / µ L pDJ10015 플라스 미드 DNA 사다리 구조 그림 2에 다음의 4 µ L을 로드 합니다. 100 V에 1 시간을 위한 젤을 실행 합니다.
  3. 표시와 두 2 mL microcentrifuge 튜브 무게.
  4. 젤을 두 개의 동일한 반쪽 위해서는 중간에 삭감. 각은 사다리 및 다른 얼룩 기법 비교 샘플 플라스 미드를 포함 해야 합니다. 그림 2에 도식 적인 표현이입니다.
  5. 얼룩 하나 절반 NBT SG 나 2 단계에서.
    1. 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드를 잘라. 젤 조각 한 튜브에 저장 하 고 무게.
  6. SG와 젤의 다른 부분에 얼룩이 나 1의 50 mL와 함께 SG x 나 솔루션 천천히 어둠 속에서 (60 rpm) 1 시간을 위한 젤을 흔들어.
    1. transilluminator에 젤을 놓고 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드 2 분 컷에 대 한 노출 합니다.
    2. 다른 튜브에 젤 조각을 저장 하 고 무게.
      참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기-20 ° c.에 튜브를 유지 하면서
  7. 플라스 미드 추출 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 수행 합니다.

5. 플라스 미드 정규화입니다.

  1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출 된 플라스 미드의 10 µ L와 내가 물 형식의 60 µ L를 추가 합니다. 믹스 60 µ L 석 영 cuvette에 전송 하거나는 Nanodrop에서 직접 2 µ L를 사용 하 여.
  2. 230 320 사이 흡수 스펙트럼을 측정 nm. 다음 수식을 사용 하 여 샘플의 플라스 미드 농도 계산.
    figure-protocol-1
    여기서 D 는 적용 희석 요소 (이 경우에 그것은 70/10), Ax 는 x nm에서 흡수 하 고 50 µ g/ml dsDNA에 대 한 변환 인수입니다.
  3. 9.1 ng / µ L를 희석 샘플입니다.
  4. 대장균 (대장균) 유능한 세포 (예: XL10 금) 변환 다음 희석 샘플의 5 µ L를 사용 하 여 이노우에 변환 절차16 .
  5. 배양 접시에 식민지의 수를 계산 하 고 희석 합니다. 다음 수식17:: 콜로 니 형성 단위 (CFU) 계산
    figure-protocol-2
    여기서 D 는 초기 문화에서 적용 되는 희석 비율입니다.
  6. 짝이 없는 t-검정을 수행 합니다.

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결과

자주색 formazan 침전 (질량 분석13확인) DNA는 나타납니다. 실험에서 DNA 사다리 보정 곡선 (그림 3)을 로드 했습니다. 아크릴 및 agarose 젤에 대 한 프로토콜 작동 하지만 낮은 강도 있으며 agarose에서 더 긴 시간이 걸립니다. 그러나, agarose 젤의 사용 수 상용 키트를 사용 하 여 샘플의 복구 하 고 추출을 방해 하지 않습니다. 블루 Led와 함께이 메서드를 사용 하 여 복구 샘플 SG에 비해 더 나은 품질을가지고 나는 transilluminator (그림 4)를 사용 하 여.

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토론

소설과 민감한 DNA 방법 얼룩 NBT의 감소 및이 문서에서 제시 했다 SG의 사용에 따라. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 NBT SG에 젤의 부 화 시간이 나 솔루션 및 NBT의 농도. Agarose 젤에 대 한 착 시간 agarose 젤 큰 두께 때문에 아크릴 아 미드 젤에 대 한 이상 이다. 이 메서드는 NBT 그것 접촉 침전으로 SDS 존재 잘 작동 하지 않습니다. 젤 보라색 배경 얻습니다, 경우 다른 젤 준비는 것이 좋습니다 및 빛의 노출 시간을 줄이기 위해. Agarose 젤은 스테인드 하는 경우 충분 한 감도 아니다 빛의 노출 시간을 증가 하는 것이 좋습니다. 감도의 부족 젖 침전은 젤에 존재 하는 경우이 SDS 오염의 결과 수 있습니다. 이 경우, 새로운 젤을 준비 하 고 착 색 시 약을 추가 하기 전에 그것을 씻어.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품, Fondo 나시오날 드 개발 Científico y Tecnológico (Fondecyt), 칠레, 프로젝트 11130263 (CW)에, NERC 프로젝트 CONICYT + 프로그램이 드에 의해 지원 되었다 (CW)에 Colaboración 국제 PCI-PII20150073 및 Vicerrectoría de에서 U-inicia Investigación 대학 데 칠레 (CW)입니다.

Ciencias Químicas y를 박사 호르헤 Babul 그리고 디에고 Quiroga-로저 유용한 토론, 원고 및 주소 드 extensión 드 라 Facultad 드 수정에 대 한 로버트 Lesch에 대 한이 프로젝트의 초기 단계에 있는 도움에 대 한 타 호텔 팔 마에 감사 합니다. 칠레 대학에서에서 Farmacéuticas입니다. 마르셀 페 레 스는 비디오 편집을 제공 하는 음성-텍스트 및에 롤 왓슨 해결을 위한 닐 스티븐 스 너무 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염색에 사용되는니트로 블루 테트라졸륨Gold Biotechnology298-83-9
SYBR Green I 10000XThermo-FisherS7563시약 염색
젤 추출 키트QIAGEN28704에서 겔에서 플라스미드를 추출하는 데 사용됩니다
보정 곡선을 만들고 무결성 분석에서 절단 밴드를 참조하는 데 사용됩니다
Agar AgarMerck는 LB-ampicillin 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다 
염화나트륨Merck1064045000LB-ampicillin 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다 
효모 추출물Becton, Dickinson and Company212750LB-암피실린 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다 
펩톤Merck72161000LB-암피실린 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다 
TEMEDAMRESCO761폴리 아크릴아미드 겔 제조에 사용
과황산 암모늄Calbiochem2310폴리 아크릴아미드 겔 제조에 사용
아크릴아미드invitrogen15512-023폴리아크릴아미드 겔 제조에 사용
비스아크릴아미드SIGMA146072폴리아크릴아미드 젤
Tris-baseMerck1083821000제조에 사용TAE 완충액 및 비변성 폴리아크릴아미드 겔 트리스-HCl 완충액
EDTAJT Baker8993-01TAE 완충
아세트산Merck1,000,632,500TAE 완충액
아가로스Merck16802TAE 완충
분광 광도계Tecaninfinite 200 proDNA 플라스미드
를 정량화하는 데 사용물 purificatiom 단위MerckElix 100분광 광도법 및 DNA 희석에 사용되는 물 유형 1 (ASTM)을 만드는 데 사용
증류수-젤, 배양 매체, 염색 및 일반 용액에 사용되는
HClJ.T. Baker9535-03비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 tris-HCl 버퍼
6X DNA 로딩 염료Thermo-FisherR0610
5mm 블루 LEDJinyuan 전자SP-021광원은 무결성 분석
프로토보드KANDHKH102광원 지원 및 회로에 사용됩니다 
9 V 배터리Duracell-LED에 전원을 공급하는 데 사용됩니다
Biorad1704486EDU는 무결성 분석에서 아가로스 젤을 만들고 실행하는 데 사용됩니다.
수직 전기영동 키트Biorad1658002EDU는 보정 곡선에서 폴리아크릴아미드 젤을 실행하는 데 사용됩니다.
공급 장치Biorad1645050 전기영동에 전원을 공급하는 데 사용됩니다.
시약염색에 사용되는는 무결성 분석 DNA ladder Thermo-Fisher SM 1331.. 은 은 액 제작에 사용 액 를 만드는 데 사용 \ 을 만드는 데 사용의 수평 전기영동 챔버. 를 사용하는 데 사용됩니다. 전원

참고문헌

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  2. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
  3. Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
  6. Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
  7. Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40(1993).
  8. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
  9. Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
  10. Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
  11. Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
  12. Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
  13. Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  15. Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
  16. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  17. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).

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