기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

Summary

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

Abstract

Mechanobiology의 한 중앙 목표 단백질 및 세포에 기계적 스트레스의 상호 효과 이해 하는 것입니다. 그 중요성에도 불구 하 고 세포질 기능에 기계적 스트레스의 영향이 아직도 제대로 이해 된다. 몇 가지 도구를 사용 하면 조직과 세포의 동시 변형, 생체, 세포 활동의 이미지와 달리 매우 모바일 모형 유기 체, 선 충 류 등 운동 성의 효율적 제한 때문에이 기술 격차 존재 하는 부분에서 꼬마 선 충. C. 선 충 의 작은 크기에 게 그들 훌륭한 일치 하는 마이크로-기반 연구 장치, 그리고 동원 정지에 대 한 솔루션 제시 된 미세 장치를 사용 하 여. 이 장치 고해상도 이미징에 대 한 허용, 동물 완전히입니다 (PDMS) 및 기계적 힘 또는 electrophysiological 녹음의 배달에 대 한 물리적 액세스를 제한 하는 유리에 쌌 다. 최근, 우리 고해상도 형광 현미경과 호환 되는 트래핑 디자인 공 압 액츄에이터를 통합 하는 장치를 만들었습니다. 작동 채널 벌레 트랩 채널에서 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 이 다이어 프이 램은 외부 소스에서 압력을 적용 하 여 벌레의 측으로 편향. 장치는 개별 mechanosensitive 신경을 대상 수 있습니다. 이러한 뉴런의 활성화에 몇 군데 유전자 인코딩 칼슘 지표와 고해상도. 이 문서는 그들의 터치 수용 체 신경 (TRNs)에 있는 칼슘-민감한 작동 표시등 (GCaMP6s)를 표현 하는 C. 선 충 종자를 사용 하 여 일반적인 메서드를 제공 합니다. 메서드를 조사로 TRNs도 칼슘 센서에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 기계적으로 민감한 세포 또는 센서에 확장 될 수 있다.

Introduction

터치의 감각 동물을 그들의 환경에 대 한 중요 한 정보를 제공합니다. 적용 된 힘에 따라 터치 인식으로 무해 한, 즐거운, 또는 고통 스러운. 터치 하는 동안 조직 변형 전문된 mechanoreceptor 세포는 피부에 포함 된 가장 일반적으로 이온 채널, 수용 체 단백질을 표현 하 여 감지 됩니다. 터치와 고통 중에 이온 채널 활성화를 연결 하는 힘 인식 단계는 완전히 이해 되지 않는다. 심지어 어떻게 피부 조직을 기계적 변형 및 몸의 긴장에 있는 변화를 탐지 여부 필터 또는^1,2,3스트레스에 대 한 알려져 있다. 이해에이 간격, 부분적으로, 세포 수준에서 응답을 관찰 하는 동안 정확한 기계적 stimulations 살아있는 동물의 피부 표면에 적용할 적당 한 도구의 부족에서 발생 합니다. 원자 힘 현미경 검사 법 사용 되었습니다 광범위 하 게 적용 하 고 격리 된 셀^4,5 에 힘을 측정 하 고 또한 생활에 있는 Piezo1 수용 체를 활성화 하는 반면 세포⁶을 비슷한 실험 특히....

Protocol

1. 장치 제조

1. 연결 된 마스크 파일 (추가 파일 1)를 다운로드 하 고는 상용 서비스 또는 사내 시설을 사용 하 여 크롬 마스크를 생성. 장치에 가장 작은 크기는 10 µ m (액추에이터 막 두께), 마스크는 ± 0.25 µ m 내에서 충분히 높은 해상도 사용 하 여 기능을 안정적으로 생산을 확인 해야 합니다.
2. 표준 수-8 포토 리소 그래피 방법에 따라 (예를 들어,²⁴참조^,25,26) PDMS 장치;의 후속 생산을 위한 금형을 제작 하 단계 요약 아래에 나열 됩니다.
   참고: 수-8은 감광 재료, 자외선에 노출 되 면 어떤 crosslinks (최대 흡수 ~ 365 nm). 시작 지점으로 제조업체 지침을 사용 하 여 소프트 빵, 노출 (UV)에 대 한 처리 매개 변수를 확인 하 여 후 구워.
   1. 수-8 2002 스핀 코트를 실리콘 웨이퍼에 예금 그것의 작은 구조 더 나은 접착을 위해 2 µ m의 대략적인 두께. 소프트-95 ° C에 1 ....

Results

수-8 리소 그래피와 칩 본딩
리소 그래피 프로토콜 및 PDMS 성형 표준 절차를 따릅니다. 자세한 내용은 다른^23,,2425,26찾을 수 있습니다. PDMS는 경화 후 문제 없이 웨이퍼를 벗기다 한다. 수-8 기능 PDMS 필 링 하는 동안 벗어 버리고, 경우 SU-8 접착 레이어 또는 silanization는 충분 하지 않았다. 경우 유리 coverslips 및 PDMS 칩의 플라즈마-활성화 약한 결합 트래핑 채널 또는 성능이 저하 되 고 자극의 부재에서 발생 하는 공 압 액추에이터 누설 될 수 있습니다 충분 하지 않습니다. 유체 누설은 분명, 칩 사용 되지 않습니다.

Discussion

이 프로토콜에서는 미세 칩에 갇혀 거 위 피부에 정확한 기계적 자극을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. 그것은 생물학 질문에 응답 하기 위한 물리적 자극의 통합을 촉진 하기 위한 것입니다 그리고 생물학 실험실에서 mechanobiology 연구를 합리화 하는 것을 목표로. 이 메서드는 C. 선 충에 mechanosensory 신경의 기능을 평가 하기 위해 이전 분석을 확장 합니다. 이전 양적 및 반 정량적 기법 힘^1,34 및 동작³⁵, 측정 하지만 신경 활동의 고해상도 이미지와 통합 하기 어려웠다. 우리는 따라서이 칩의 사용은 현재 응용 프로그램을 확장 하 고 부드러운 터치에 필요한 신경의 자극에 대 한 성능을 최적화 믿습니다. 우리는 거의 최대한 신경 응답에 도달 하는 충분히 강한 자극에 도달 5 µ m, 액추에이터의 편향 최적화. 약간의 변화, 우리는이 디자인 몸 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
크롬 마스크	Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)		5'', AutoCAD(Autodesk, Inc.)로 설계
크롬 마스크	Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)		5 '', AutoCAD에서 설계 (Autodesk, Inc.)
크롬 마스크	Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/		5 "', AutoCAD에서 설계 (Autodesk, Inc.)
4 "실리콘 웨이퍼 (B-test)	스탠포드 나노 가공 시설
SU-8 2002	MicroChem
SU-8 2050	MicroChem
스핀 코터	Laurell Technologies	WS-400BZ-6NPP/LITE
노출 타이머	Optical Associates, Inc	OAI 150
조명 컨트롤러	Optical Associates, Inc	2105C2
SU-8 개발자	MicroChem
2-Propanol	Fisher Scientific	A426F-1GAL
	Acetone Fisher Scientific	A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS)	Sigma-Aldrich	92361-500ML	주의: TCMS는 독성이 있으며 물에 반응합니다
Sylgard 184 엘라스토머 키트	Dow 코닝		PDMS 프리폴리머
생검 펀치, 1mm	VWR	95039-090
산소 플라즈마 Asher	Branson/IPC
소형 금속 튜브(0.635mm OD, 0.4318mm ID, 12.7mm 길이);게이지 크기 23TW	New England Small Tube Corporation	NE-1300-01
Nalgene 주사기 필터, 0.22 μ m	Thermo Scientific	725-2520	모든 용액을 걸러내려면 작은 입자가 칩 폴리에틸렌 튜브를 막을 수 있습니다
. 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID	Solomon Scientific	BPE-T50
주사기,	웜 포획 및 방출 주사기를 위한	BD Scientific	309628
중력 기반 흐름을 위한	20 ml	BD Scientific	309661
Gilson Minipuls 3, 연동	에서 해결책 그리고 벌레를 빨기 위하여	Gilson
; 800kPa 압력 채널	Elveflow	OB1 MK3	압력 전달
방수 투명 폴리우레탄 튜빙, 4mm ID 및 6mm OD	McMaster-Carr	5195 T52	집 공기에서 압력 펌프로 연결
방수 투명 폴리우레탄 튜빙, 2.6mm ID 및 4mm OD	McMaster-Carr	5195 T51	압력 펌프를 작은 튜브에 연결
공기	용 Push-to-Connect 튜브 피팅McMaster-Carr	5111K468	메트릭 - 임페리얼 컨버터
6 mm × 1/4&Prime용 직선 커넥터; 튜브 OD	McMaster-Carr	5779 K258
Leica DMI 4000 B 현미경 시스템	Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO 오일 대물	Leica	506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT 디지털 CMOS 카메라	Hamamatsu	C11440-42U
Lumencor Spectra X 광 엔진	Lumencor		청록색 및 녹색/노란색 광원 포함
여기 빔 스플리터	Chroma	59022bs	현미경
Hamamatsu W-view Gemini 이미지 분할 광학 장치	Hamamatsu	A12801-01	은 녹색과 적색 방출을 분할하고 카메라 칩의 다른 영역에 투사
이미지 스플리터의	방출 빔 스플리터	Chroma	T570lpxr
방출 필터 GCamp6s	Chroma	ET525/50m	이미지 스플리터에서
방출 필터 mCherry	Chroma	ET632/60m	이미지 스플리터에서