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방법 논문

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

8.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56535

⸱

2017년 10월 31일

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

이 논문에서

요약

우리는 murine 기본 세포 골 수 세포에서 파생 하는 스트레이트-앞으로 방법을 설명 하 고 BSA 지방산을 준비 하는 간단한 방법 변화. 포화 지방산은 대 식 세포 세포 죽음을 일으킬 수 있다 그리고 이러한 세포의 죽음은 확실히 세 라마 이드 레벨의 세포 축적와 관련 다음 설명 합니다.

초록

대 식 세포는 매우 상피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질을 표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산, 면역 기능 조절에 중요 한 역할을 수 있습니다. 수많은 연구 다양 한 지방산, 포화 또는 불포화, 세포 성장 및 기능에 다른 영향을 보유. 그러나, 지방산 준비를 위해 사용 하는 방법 다는 비 생리 적인 결과 이어질 수 있습니다. 혈 청 알 부 민, 자연 캐리어 포유류 주변 혈액에서 지방산은 지방산 비누의 독성을 최소화 포유류 세포에서 지방산의 기능을 공부 하 공액 지방산의 나트륨 소금 복잡 한 성형에 대 한 것이 좋습니다. 따라서, 간단 하 고, 상대적으로 빠른 난방 및 메서드 sonicating 개발 이며 BSA 지방 산 성 어원이 형성에 대 한 여기에 제시. 우리는 포화 지방산, 특히 스 테아 르 산 마우스 골 수 유래 세포에 심각한 세포 죽음을 유도 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 더 포화 지방산 유도 된 세포 죽음은 긍정적으로 축적 된 세포 세 라마 이드 수준 연관 보여 줍니다. 이 메서드는 다른 포유류 세포에서 지방산의 영향 연구에 대 한 확장할 수 있습니다.

서론

지방산이 에너지 대사에서와 다른 종류의 세포 막 인지질 합성에 중요 한 역할. 지방산은 낮은 수성 가용성이 있다. 지방산의 적절 한 준비는 포유류 세포에서 지방산의 생물 학적 기능을 공부를 위한 중요 한 중요성 이다. 지방산 에탄올 준비가 때 많은 지방산1상대적으로 낮은 농도 에서도 세포 막에 그들의 독성 비누 (세제) 효과 보여줄 수 있습니다. 무료 지방산은 혈 청에 대 한 자연, 주요 전송으로 혈 청 알 부 민 지방산 배달에서 생체 외에서 지방산 기능 분석 실험2,,34에 대 한 좋은 통신사를 간주 됩니다. 그러나, 지방산 및 혈 청 알 부 민 켤레의 준비의 세부 대개 하지 사용할 수 있습니다 지방산을 사용 하 여 많은 연구 논문 출판 되었습니다 비록.

대 식 세포는 매우 표 피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질5,6,,78표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산이 면역 기능을 조절 수 있습니다. 대 식 세포와 다른 세포에 지방산의 영향 연구, 지방산 준비의 다른 방법이 적용된1,,79했다. 지방산은 대 식 세포 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 적절 하 게 준비 된 지방산/혈 청 알 부 민 어원이 같은 말을 사용 하 여 생물학적으로 의미 있는 데이터를 얻기에 중요 한 중요성 이다. 대 식 세포 기능에 지방산의 영향에 대 한 연구는 기본적인 지식 및 대 식 세포 관련 질병에 지방 산 성 대사에 관련 된 잠재적인 치료 표적 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 루이스 빌 대학에 의해 승인 되었다.

1. 마우스 골 수 유래 세포 (BMDMs)

  1. Euthanize CO 2를 사용 하 여 6에 8-주 오래, 건강 한 야생 타입 마우스. 폼 보드로 고정 하 고 그것이 젖 었 때까지 70% 에탄올 스프레이. 집게와가 위 경골/대 퇴 골 뼈를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 5 mL 1와 페 트리 접시에 넣어. 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
  2. 오픈는 시저와 경골/대 퇴 골 뼈의 양쪽 끝에서에서 잘라 무 균 조직 문화 후드. 15 mL 튜브에 PBS + 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 25g 바늘 뼈를 플러시.
  3. 500 x g, 4 ° C 5 분 대에 골 수 세포를 원심
  4. 미만 1 분 9 mL 1 x PBS 가진 즉시 Dilute 위해 lyse 적혈구 (RBC)를 1 mL 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend. 1.3 단계에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.
  5. 셀 펠 릿 10 mL 1 x PBS에 resuspend, 세포 파편/덩어리를 제거 하려면 다른 15 mL 튜브에 불 임 40 μ m 나일론 메쉬를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 1.3에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.
  6. 15 mL 로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 5 %FBS 10 μ g/mL gentamicin, 37 o C 인큐베이터에서 100 m m 조직 문화 접시에 셀 60 분 부드럽게 요리, 소용돌이 대 한 부동 꺼내 접시에 셀 펠 릿 resuspend 세포, 그리고 그들을 계산.
  7. 10 ng/mL 재조합 마우스 대 식 세포와 미디어 (5 %FBS 30 %L929 바른된 미디어 10 혼합 10 μ g/mL gentamicin RPMI 1640) 차별화 12 mL macrophage 6 x 10 6 셀 100 mm 접시에 접시 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 2 일.
  8. 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 2 일간 배양 후 각 접시 6 mL 신선한 macrophage 차별화 10 ng/mL M-CSF와 미디어 피드.
  9. 5 일에 밖으로 오래 된 미디어의 8 mL 셀을 방해 하지 않고 고 추가 10 mL 신선한 macrophage 미디어 10 ng/mL M-CSF와 차별화.
  10. 셀 기중 장치를 사용 하 여 골 수 유래 세포 (BMDMs) 수확 7 일에.
    참고: 연결 된 대 식 세포 수 또한 될 해리 했다 5 mL 1 m m 5 ~ 10 분의 1 x PBS에 EDTA와 float 세포를 제거 하 고 두 번 5 mL 1 x PBS 가진 접시를 세척 후. 1.3 단계에서 세포를 원심., 미디어, 차별 하는 신선한 macrophage에 그들을 resuspend 및는 hemocytometer로 그들을 계산.
  11. 확인은 BMDMs
      ' 표현 형으로 cytometry에 의해 설명 5. 다음과 같은 연구에 대 한 특정 농도에 세포 파생된 마우스 준비.

2. BSA-지방산 산 켤레 준비

  1. 준비 2mm BSA 살 균 PBS에. 예를 들어 추가 30 mL 1 x PBS를 해산, 6.65 g BSA, 무게 추가 더 많은 PBS 50 mL까지 1 x PBS에 2mm BSA를 만들기 위해 구성 요소를 확장.
  2. 2mm BSA에에서 지방산의 준비 5mm 개별 나트륨 소금. 필요한 경우, 37 ° C 이상가 열 하 고 명확한 해결책을 얻을 때까지 2mm BSA의 혼합물 및 지방산의 나트륨 염을 sonicate.
    참고: 불포화 지방산에 비해, 포화 지방산 필요 더 높은 온도 및 더 많은 쥡니다 시간 해산.
  3. 필터는 0.22 통해 지방-산 성-BSA 솔루션 μ m 필터, 약 수 1.5 mL 메 마른 microcentrifuge에 그것은 튜브, 단기 사용을 위한 4 ° C에 또는 긴 기간 저장을 위해-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 아니 강 수는 냉장고에서 4 ° C에서 저장 후 관찰 해야 합니다.

3. 포화 지방산 유도 세포 죽음의 마우스 골 수 파생 된 세포

  1. 미디어를 차별화 하는 대 식 세포에 10 6 /mL x 0.4 BMDMs 24-잘 조직 문화 접시에 접시.
  2. 0.4 m m 팔 미 틴 산 및 스 테아 르 산 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 16 ~ 24 h에 대 한 세포 치료. BSA를 사용 하 여 부정적인 컨트롤로.
  3. 셀 치료 후 셀 기중을 수확 하 고 500 x g, 5 분에 4 ° C에서 셀 아래로 회전
  4. Annexin V-알 렉 사 488와 100에서 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 세포를 얼룩이 μ annexin V 바인딩 버퍼 실 온에서 15 분.
  5. Annexin 바인딩 버퍼의 200 µ L로 샘플을 희석, 부드럽게, 혼합 후 잠복기 후 얼음 샘플을 유지.
  6. 흐름 cytometry 5 스테인드 셀을 최대한 빨리 분석. FITC 채널에 감지 annexin V-알 렉 사 488와 7 AAD PerCP/PerCP-Cy5.5 채널에서 발견 되.

4. 세포내 세 라마 이드 얼룩

  1. 지방산 치료 후 수확 단계 3.3 에서처럼 셀. 다음 30 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 셀 수정
  2. 1 mL 1 x PBS와 샘플을 세척, 스핀 다운로 3.3에 고는 상쾌한 가만히 따르다.
  3. 30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 셀 안티-세 라마 이드 1 차적인 항 체 (1: 200 희석)을 얼룩
  4. 세척 및 스핀 아래로 단계 4.2에서 다시 셀.
  5. 반대로 마우스 IgM 이차 항 체 (1: 500 희석)와 세포 30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 얼룩
  6. 세척 및 스핀 다운 단계 4.2에서 다시 셀. 250 μ 1 x PBS를 추가 하 고 교류 cytometry 5 스테인드 세포 분석.
    : 참고 장비 및 시 약의 테이블의 자세한 시 약 목록.

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결과

비만에 혈 청 자유로운 지방산 농도 증가합니다. 전문 식 세포로 세포 적극적으로 차지 지방산 호스트 항상성 유지를 합니다. 이 프로세스 동안 오버 로드 된 지질 대 식 세포 세포 죽음을 유도 수 있습니다. 이 위해, 우리는 BMDMs에서 체 외에 식이 지방산 및 흐름 cytometric 얼룩을 사용 하 여 측정 된 대 식 세포 세포 죽음의 비만 수준으로 교양. BSA 제어, 포화 지방산에 비해 특히 스 테아 르 산, 유도 BMDMs. 죽은 세포 Annexin V와 7-AAD (그림 1a-b) 스테인드 이중 긍정적인 채우기로 표시 했다 중요 한 세포 죽음. 메모의 불포화 지방산은 상당한 대 식 세포 세포 죽음5을 유도 하지 않았다. 데이터는 vivo에서무료 포화 지방산의 증가 수준의 독성 효과 제안합니다.

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토론

지방 산 성 해결책의 적절 한 준비는 지방산의 생물학적 기능 연구에 중요 한 중요성의 이다. 지방산의 중립화 수성 해결책에 있는 그것의 가용성을 증가 시킵니다. 그러나, 특히 포화 지방산, 지방산의 나트륨 염 우리가 관찰 물 또는 PBS에서 낮은 용 해도의 여전히 있습니다. 한 가지 방법은 지방산1해산 있도록 95-100% 에탄올을 사용 하는. 이 메서드를 사용 하 여 셀에 높은 독성 적은 독성 불포화 지방산에 대 한 낮은 농도 에서도 관찰 될 수 있습니다. 지방 산 성 솔루션을 준비 하는 또 다른 방법은 지방산이 최적의 조건, 그들의 단위체 양식9,11솔루션에 남아 있는 메 틸-β-cyclodextrin 배달 시스템으로 활용 하는 것입니다. 같은 방법으로 준비 하는 지방산은 정상적인 기능, 나타나지만 메서드를 수행 하는 것은 복잡. 메 틸-β-cyclodextrin 세포 성장에 미...

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공개 사항

저자는 금융 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 글

이 작품 루이빌 대학 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 하 고 국립 암 연구소 (베 데스 다, 메릴랜드) R01CA177679, R01CA180986를 부여 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CPX 초음파 수조 Bransonic모델 2800
팔미틴산 나트륨 (PA)Nu-Chek Prep, Inc.S-1109MW 278
스테아린산 나트륨 (SA)Nu-Chek Prep, Inc.S-1111M.W. 306
소 혈청 알부민 (BSA), 무지방산Fisher Scientific9048-46-8
마우스 대식세포 콜로니 자극 인자 (mM-CSF) 세포 신호 기술,  Inc.5228
RPMI 1640VWR International71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugateFisher ScientificA13201
7-AADBD Biosciences559925
Monoclonal anti-ceramide 항체 (mouse IgM)SigmaC8104-50TSTClone: MID 15B4
Goat anti-mouse IgM 항체, µ chain, FITC conjugateSigmaAP128F
고정 버퍼Biolegend420801
Permeabilization 버퍼Ebioscience4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma11814389001
Annexin V 결합 완충액BD Biosciences556454
L929 세포ATCCCCL-1
Corning  셀 리프터 Fisher Scientific07-200-364
참고: MW는 분자량입니다.

참고문헌

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
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  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
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  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
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  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

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