분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

요약

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

초록

Amperometry 셀 exocytosis 활동 및 단일 exocytosis 이벤트에 소포에서 발표 하는 신경 전달 물질의 양을 줄여이 물리적 스트레스에 응답 하는 분 비 세포는 삼투성 충격 쇼 대상의 기록. 그것은 추방 하는 신경 전달 물질의 감소 그 셀 축소 삼투성 스트레스에 대응에서 하 고 그 가정으로 분 비 소포 세포 세포질에 영향을 받지 않습니다 막 생물 속성에 변경 예정 이다 제안 되었습니다. 의해 세포 외 삼투성 긴장. Amperometry 녹음 exocytosis의 어떤 순간을 소포 플라즈마 막으로 퓨즈 하지만 소포 융해 트리거되기 전에 기 내용에 정보를 제공 하지 않습니다 세포에서 출시 모니터링 합니다. 따라서, amperometry를 결합 하 여 세포 exocytosis 트리거되기 전에 분 비 소포를 특성화 할 수 있다 다른 보완 분석 방법으로 녹음 어떻게 분 비 소포 검사에 대 한 광범위 한 개요를 제공 하 고는 exocytosis 프로세스 삼투성 충격에 의해 영향을 받습니다. 우리는 여기 amperometry 세포내 전기 cytometry 및 전송 전자 현미경 (TEM) 영상 기록 보완 사용 하는 방법을에 분 비 소포 크기와 신경 전달 물질 콘텐츠 변경 하 설명 삼투성 스트레스에 노출 전후 exocytosis 활동에 관하여 chromaffin 세포. 모든 세 가지 분석 방법을 사용 하 여 실험에서 얻은 정량적 인 정보를 연결 하 여 결론 이전에 수행 된 분 비 소포 크기에서 긴축 하 고 소포 quantal 크기를 감소 하 여 세포 외 삼투성 긴장에 응답 일정 한 소포 신경 전달 물질 농도 유지 합니다. 따라서,이 왜 삼투성 스트레스에 대 한 응답에 소포 exocytosis 릴리스 동안 발표 금액 신경 전달 물질 감소에 관한 몇 가지 설명을 제공 합니다. Amperometric 녹음 여기 이것은 가역 과정과 그 기 후 배치 셀 isotonic 환경으로 되돌려 때 삼투성 충격 신경 전달 물질과 리필 됩니다 나타냅니다.

서론

아드레날린에 있는 chromaffin 세포는 혈 류로 신경 전달 물질 분자를 풀어 신경 내 분 비 세포. 이 도킹을 포함 하는 세포질 프로세스 및 신경 전달 물질 채워진 소포, exocytosis를 불리는 과정에서 세포 외 공간에 콘텐츠 자료 소포에서 결과의 융합을 통해 발생 합니다. 신경 전달 물질 (아드레날린과 더욱) chromaffin 세포에서 적극적으로 큰 밀도 코어 소포 (LDCVs)으로 막 단백질에 의해 수송 하 고 높은 농도 (~0.5-1 M)^1,2에 저장. LDCVs 내의 신경 전달 물질의 축적은 chromogranin 단백질 (~ 169 mg/mL)^{3,4,5의 구성 intravesicular 밀도 핵심 단백질을 카 테 콜 아민 분자에의 선호도 의해 수행 ,6}, 그리고 ATP (125-300 m m)⁷, 캘리포니아^{2 +} 등 기도 카 테 콜 아민 로드 및 저장을 위한 주요 구성 요소를 포함 하는 intravesicular 칵테일 솔루션 (솔루션 ~ 40 mM에서 50-100 µ M에 바인딩된는 단백질 매트릭스)⁸, Mg^{2 +} (5mm)⁹, 하는데 (10-30 m m)¹⁰, 그리고 ~5.5^11,12의 pH. 비록 이론적인 용 질 농도 소포 안에 이상의 750 m m까지 합계는 LDCVs 세포 세포질 (310 mOsm/kg)¹³, iso 삼투성 조건을 유지 합니다. Intravesicular 부품의 구성만 로드 하 고 저장 용액의 집계 뿐만 아니라 catecholamines의 밀도 핵심 단백질 매트릭스에 필수적입니다. 이 현저히 감소 하는 소포의 osmolarity은 크게 감소 되 고 금액 카 테 콜 아민 exocytosis^5,6중 출시에 영향을 미칠 수 있습니다.

그 높은 extracellular 삼투성 압력 exocytosis 활동을 억제 하 고 단일에서 분 비 하는 신경 전달 물질의 수를 감소 amperometric 기록에 의해 exocytosis 프로세스에 extracellular 삼투성 압력의 효과 대 한 연구 보고 기 구획^{4,14,15,,1617,18,19}. 이 관측의 설명 셀 세포질의 억제 기 퓨전 이벤트에 막 생물 속성의 수에 영향을 미치는 변경 고분자 군집의 가능한 향상에 사색 신경 전달 물질 exocytosis 동안 발표입니다. 이러한 생각 생각 높은 extracellular 삼투성 스트레스 트리거된 exocytosis^14, 의 이전 단계에서 소포에 저장 하는 신경 전달 물질 분자의 수를 정의 하는 소포 quantal 크기에는 영향을 미치지 않습니다. ^{15 , 17 , 19 , 20 , 21}. 단일 셀에 exocytosis 릴리스의 amperometric 측정, 탄소 섬유 디스크 microelectrode 긴밀 한 접촉 냅 구성을 흉내 낸를 실험 세트를 만드는 세포 표면에에서 배치 됩니다 어디에 amperometric 전극 postsynaptic 검출기 (그림 1)^22,23역할을 합니다. Exocytosis 세포를 자극 하 여 하나의 신경 전달 물질 채워진 소포 세포 원형질 막으로 융합 및 세포 외 공간으로 일부 또는 전체 소포 콘텐츠 릴리스를 유도할 수 있다. 경우는 신경 전달 물질 (예, catecholamines) electroactive Ag/AgCl 기준 전극의 700 mV 대 산화 환 원 잠재력을 적용 하 여 이러한 신경 전달 물질 분자는 전극의 표면에 화학적 검출 될 수 있다 . 따라서, 현재 스파이크의 일련 표시 개별 exocytosis 이벤트의 검출. Amperometric 녹음에서 시간 추적 대 전류에서 각 단일 amperometric 스파이크 밑 지역 충전 exocytosis 이벤트 당 감지 나타내고 발표, 패러데이 방정식을 사용 하 여 신경 전달 물질의 몰에 변환할 수 있습니다. 따라서, amperometric 녹음 단일 exocytosis 이벤트에서 추방 금액 신경 전달 물질에 정량적 인 정보를 제공 및 exocytosis 이벤트의 빈도에 보고 하지만 분 비 소포에 정량적 인 정보를 선물 하지 않는다 소포 융해 및 신경 전달 물질 방출 하기 전에 콘텐츠 시작 되었습니다.

따라서, 셀에 어떻게 분 비 소포의 더 나은 이해를 얻으려면 세포질 응답 extracellular 삼투성 긴장에 셀 exocytosis, 받아야 트리거되기 전에 다른 상호 보완적인 분석 방법을이 정보를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 조사 하기 위하여 삼투성 스트레스 소포 볼륨을 변경 하는 경우, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 분석 화학 고정 후 세포의 소포 크기를 측정 하 사용할 수 있습니다. 에 분 비 소포에서 소포 신경 전달 물질 콘텐츠의 정량화 삼투성 스트레스에 영향을 미치는 기 quantal 크기 검사, 세포내 전기 cytometry 이라는 최근에 개발 된 amperometric 기법을 적용할 수 있습니다 그들의 아직²⁶라이브 세포 세포질에 거주 하는 경우 기본 상태입니다. 세포내 전기 cytometry 기술에서 nanotip 원통형 탄소 섬유 전극 부드럽게 삽입이 전극에 700 mV 잠재력을 적용 하 여, 그리고 라이브 세포의 세포질 (vs Ag/AgCl 전극 참조)는 소포에서 카 테 콜 아민 콘텐츠 단일 소포 충돌, adsorbing, 그리고 전극 표면에 파열 이후 확률론 및 그로 인하여 그들의 내용에 대 한 발표에서 산화 환 원 현재 스파이크의 탐지에 의해 정해질 수는 전극 표면²⁶. 따라서, 시간 추적 대 현재 amperometric에 각 단일 소포 rupturing 이벤트 현재 과도 귀 착될 수 있다 하 고, 각 현재 스파이크의 영역을 통합 하 여 소포 quantal 크기 산출 될 수 있다 Faraday´s 법을 사용 하 여.

따라서 세포내 전기 cytometry 기준으로 기록 소포 quantal 크기 분석, 함께 가장 이미지를 사용 하 여 소포 크기 측정에서 얻은 정량적 인 정보를 연결 하 여 소포 신경 전달 물질 농도 또한 할 수 있다 결정 될. 이 셀은 다른 삼투성 조건에 노출 되 면 소포 특성을 허용 하 고 어떻게 소포는 응답할 exocytosis 이전 단계에서 세포 외 삼투성 스트레스에 더 나은 보기를 제공 합니다. 이러한 방법 결합에서 결과 나타났습니다 그 높은 삼투성 압력 extracellular 존재 소포 축소 하 고 그들의 quantal 크기 조정 보여줍니다 이러한 측정에서 상대적 변화에 정량적 인 정보를 비교 축소 하는 동안 소포 그들의 내용 및 크기는 일정 한 신경 전달 물질 농도²⁴유지를 조정 합니다. 따라서,이 이해는 삼투성 스트레스에 노출 된 세포에서 신경 전달 물질 방출에는 관측에 연결에 유용 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 extracellular osmolality 그들의 네이티브 환경 대응에 어떻게 분 비 소포의 특성화 고는 exocytosis에이 응답의 효과 수 있는이 세 가지 보완 방법론의 사용 프로세스입니다. 우리의 이전 관측 효과 관한 exocytosis²⁴에 높은 삼투성 압력의, 뿐만 아니라 삼투성 충격 및 chromaffin에 여러 바 륨 stimulations의 효과 후 세포 복구를 설명 하는 추가 실험 소개 셀입니다.

프로토콜

1. 아드레날린에서 효소 소화에 의해 격리 소 Chromaffin 세포 세포 배양

1. 소 아드레날린에서 수집 chromaffin 세포를 격리 하려면 셀 70% 에탄올 용액으로 소독. 멀리 지방과 결합 조직 메스를 사용 하 여 정돈 하십시오. 씻어 37 ° c.에 thermostated 되었습니다 로크의 솔루션 (NaCl 154 m m, KCl 5.6 m m, NaHCO3 3.6 m m, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.4에 5.6 m m)를 사용 하 여 부 신 정 맥 혈액을 제거 하려면
2. 조직, 소화 약 2.5 mL 따뜻한 살 균 필터링 0.2% 콜라 P 솔루션의 주사기를 사용 하 여 부 신 정 맥을 통해 주입 하 여 각 동맥을 팽창 시키고 37 ° c.에 20 분에 대 한 조직을 품 어 모 수의 소화 과정을 완료 수 있도록 동맥을 검사 합니다. 조직이 부드럽고 강렬 하지 느껴야 합니다.
3. 소화 모 snipping 경도 방향에 있는 땀 샘에 의해 수집 합니다. 메스를 사용 하 여 골 수 조직을 말하다. 강 체에 조직 정지를 필터링 하 고 로크의 솔루션 콜라 피 활동을 줄이기 위해 볼륨 약 50ml로 희석
4. 실 온에서 10 분 원심 분리기에서 300 x g에서 셀 펠 렛을 50 mL의 멸 균 시험관에 수집 합니다. 다시 20 mL 로크의 솔루션에서 얻은 펠 릿을 일시 중단 하 고 튜브로 살 균 100 µ m 나일론 메쉬를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
5. 살 균 Percoll (1:1)와 chromaffin 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 실 온에서 20 분 18600 x g에서 셀 솔루션 원심. 밀도 기울기의 상위 레이어를 수집 하 고 튜브로 100 µ m 나일론 메쉬를 통해 솔루션을 필터링.
6. Percoll을 제외 하려면 다시 로크의 솔루션에는 펠 릿을 중단 하기 전에 로크의 솔루션 및 실 온에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액을 희석. 격리 된 세포 현 탁 액의 예상된 셀 밀도 약 4 백만 셀/mL입니다.
7. Exocytosis 및 세포내 cytometry 측정의 amperometric 기록에 대 한 콜라겐 4 접시 chromaffin 세포 약 17.5 × 10³ 셀/c m² 의 조밀도에 60 m m 플라스틱 접시를 코팅 하 고 37 ° c 5% CO₂ 에서 셀을 품 어 환경입니다. 세포 배양의 1-3 일 이내에 전기 화학 실험을 수행 합니다.
8. 가장에 대 한 실험, 75 cm² 셀 문화 플라스 크 당 7-8 백만 셀의 밀도에 플라스 크에서 접시 chromaffin 세포 이미징 하 고 1 일 5% CO₂ 환경에서 37 ° C에서 품 어.

2. 단일 셀 Exocytosis Amperometry 실험²⁴

1. 이 실험에 대 한 탄소 섬유 microelectrodes 조작 걸릴 유리 전극 홀더에 적합 한 외부 직경 모 세관이 실험에 사용 될 것입니다 머리 단계에서. 붕 규 산 유리 모 세관을 사용 하 여 1.2 m m의 외부 직경 및 0.69 m m 내부 직경.
   1. 물 흡입 관에 모 세관 끝 중 하나를 연결 합니다. 시각화를 향상 시키기 위해 흰 종이의 한 조각 같은 뭔가에 5 µ m 직경 탄소 섬유를 배치 합니다.
   2. 단일 탄소 섬유 식별 고 섬유 탄소 섬유 탄소 섬유의 자유로운 끝에 근접에 있는 열린 모 세관 끝을 위치 하는 동안 유지 하는 손가락으로 한쪽 끝에. 탄소 섬유는 모 세관의 양쪽 끝을 통해 밖으로 찌르는 되도록 부드럽게 유리 모 세관에 탄소 섬유 발음. 포부 강제로 이동 합니다.
2. 탄소 섬유와 모 세관 micropipette 끌어당기는 사람에 배치 하 고 두 개의 별도 유리 피 펫 팁으로 유리 모 세관을 당겨. 탄소 섬유 두 유리 끝 사이 연결을 끊으려면가 위를 사용 하 여 탄소 섬유를 잘라내어 두 탄소 섬유 microelectrodes를 얻을.
3. 현미경, 탄소 섬유는 섬유 유리 모 세관 코팅 메스를 사용 하 여에서 확장은의 가장자리에 탄소 섬유의 수동 절단을 허용 하는 두꺼운 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.
4. 탄소 섬유, 유리 코팅된 탄소 섬유 팁을 두고 절단 후 에폭시를 올려 고 탄소 섬유와 주변 유리 사이 어떤 가능한 열린 공간 인감 10 분 에폭시 솔루션으로 전극 팁의 몇 mm를 삽입 합니다. 전극 부피 접착제 방울 전극의 끝에 형성에서 방지 하기 위해 에폭시 솔루션에서 천천히 들어올립니다.
5. 전극 홀더 (예를들면, 나무 편평한 막대기) 2-사이드 스티커 내열성 테이프 전극 장착할 수를 놓습니다. 에폭시 처리 전극 하룻밤 100 ° c.에 오븐에 구워 전극 팁 쉽게 그들이 표면 접촉 중단 되도록 전극 항상 안전 하 게 저장 전극에에서 고정 및 팁에 감동 되 고 위험 하지 않습니다 홀더를 사용 하 여.
6. 평면 디스크 전극 표면을 얻으려면 전극은 microgrinder의 소유자에서 놓고 경사 45 °의 천사에서 각 탄소 섬유 전극. 베벨, 후 나중 exocytosis 측정에 대 한 셀 근처 전극 배치 때 디스크 전극 표면에서 45 ° 각도 찾을 방법을 알고 영구 마커를 사용 하 여 그것의 윗면에 모 세관을 표시 합니다.
   참고:이 단계는이 실험에서 중요 한, 타원형 디스크 전극 배양 접시의 표면에는 표면 병렬 셀 위에 평면 배치 될 필요가. 또한, 경사지 전극 실험 한 신선 하 고 깨끗 한 전극 표면을을 같은 날 할 수 있습니다.
7. 사용 하기 전에 주기적 voltammetry를 사용 하 여 현재 안정 된 상태를 모니터링 하려면 각 탄소 섬유 microelectrode를 테스트 솔루션 (예를 들어, 버퍼 PBS (pH 7.4)에 0.1 m m 도파민)에 놓습니다. 순환 voltammetry 스캔에 대 한 적용 삼각형 잠재적인 파형에서 0.8 V-V 0.2 대 Ag/AgCl 기준 전극에서 좋은 반응 속도 론 데이터를 보장 하기 위해 100 mV/s을 얻을 수 있습니다 5 µ m 직경 디스크에 대 한 이론적으로 계산 된 값과 일치 하 여는 탄소 섬유 microelectrode²⁵.
8. Exocytosis의 amperometry 녹음, 거꾸로 현미경에 교양 chromaffin 세포 배양 접시를 놓습니다. 그것은 기록, 측정 되는 아주 작은 전류로 인해 amperometry 동안 전자 노이즈를 제거 하는 패러데이 케이지 설정 현미경을 보호 하는 것이 중요. 난방 단계 현미경을 사용 하 여 셀 실험 동안 37 ° C의 온도 유지.
9. 저 잡음 패치 클램프 장비를 사용 하 여 700의 끊임 없는 잠재력을 적용 또한 작업 전극에서 페 트리 접시에 배치 된 Ag/AgCl 기준 전극 대 작업 전극에 mV. Chromaffin 세포의 녹음 exocytosis, 10 kHz에서 신호를 디지털화 및 내부 낮은 패스 기록 된 신호를 필터링 하려면 2 kHz에서 베셀 필터 적용.
10. Amperometric 단일 셀에서 녹음을 수행 하려면 갓 beveled 및 시험 된 탄소 섬유 디스크 microelectrode에는 potentiostat와 함께 사용 되는 머리 무대의 전극 홀더 탑재 합니다.
    1. 부드럽게 전극은 평평한 타원형 디스크 모양 전극 표면 아래로 향하게 셀의 꼭대기 표면으로와 놓고는 micromanipulator를 사용 하 여 세포 막에 접촉 전극 배치 합니다.
    2. 세포 막 위에 배치 시 전극으로 인 한 세포 변형 모니터링 하 여 셀 전극에서 거리를 조정 하 고 신중 하 게 취소 어디 셀을 원래 셀 모양에 가까운 모양 차릴 거리에 전극 . 운동 하 고 양적 기록 위한 이상적인은 시 냅 스에서 화학 방출의 postsynaptic 검출을 위한 유사한 조건이 전극 및 세포 표면, 분리 하는 백 나노미터의 액체 박막을 만드는 것입니다.
11. 팁 크기 영향을 피 펫 팁에서 유출 하는 어떤 해결책 든 지 방지 하기 위해 셀에서 20 µ m의 거리에서 5mm BaCl₂ 솔루션으로 가득 2-3 µ m 직경의 유리 제 micropipette 위치 exocytosis 세포를 자극 하는 실험 하 고 5mm exocytosis 셀을 자극 하는 세포 표면에서 BaCl₂ 솔루션의 5 s 분사 펄스를 적용 합니다.
12. Exocytosis 프로세스에 삼투성 압력의 가역 효과 연구, 310 mOsm/kg iso 삼투성 압력와 조정 하 여 만든 고 버퍼 isotonic 버퍼 솔루션 (150 m m NaCl, KCl, 1.2 m m MgCl2, 포도 당 5 mM, 10 mM HEPES, 5mm pH 7.4) 준비는 730 mOsm/kg에 해당 하는 osmolality isotonic 버퍼 솔루션의 NaCl 농도.
13. Isotonic 버퍼에 셀을 놓고 약 3 분 동안 시작된 exocytosis 활동 중 amperometric 전류 과도 특성을 기록 하는 동안 바 륨 주입 펄스를 적용 하 여 exocytosis 셀을 자극 합니다.
    1. 마 조건 isotonic 조건에서 exocytosis 응답을 비교 하 고 버퍼 솔루션에 10 분에 대 한 셀을 품 어 하 고 그 후 exocytosis를 자극 하 고 수행 하는 amperometric 기록의 3 분을 바 륨 주입 펄스를 적용 합니다.
    2. 셀의 가역 반응, 다시 10 분 isotonic 버퍼 솔루션에 대 한 셀을 품 어와 5s를 적용 하 여 세포를 자극 바 륨 주입 맥 박 및 셀 로부터 exocytosis 응답 기록의 3 분을 수행.
14. 여러 바 륨 stimulations 여 exocytosis 활동에 미치는 영향을 결정 하는 제어 실험 수행 3 연속 exocytosis 릴리스의 amperometric 녹음 BaCl₂ stimulations 동일한 셀에 배치 isotonic 버퍼와 다른 osmolarity와 연속 세포 배양 실험에 대 한 동일한 시간 프로토콜을 사용 하 여.

3. 세포내 전기 Cytometry^24,26

1. 조작 기 quantal 크기 측정을 위한 전극, 같은 재료를 사용 하 고 직경 2.1과 2.2 amperometric exocytosis 위한 microelectrode 제조의 단원의 설명에 따라 탄소 섬유 전극에 5 µ m를 준비 시작 측량입니다.
2. 현미경, 메스를 사용 하 여 30에서 100 µ m에 이르는 길이와 탄소 섬유 유리 팁에서 튀어나와 남아 있도록 유리 팁에서 탄소 섬유 확장을.
3. 탄소 섬유 전극의 불꽃 에칭된 팁을 준비 하려면 부탄 화 염을 사용 합니다. 균등 하 게 에칭 달성, 원통 모양된 전극 팁, 원통형 모양의 탄소 섬유 전극 그것을 회전 하는 동안 누른는 탄소 섬유 확장 유리에서 부탄 불꽃의 파란 가장자리에 탄소 끝 개발 빨간색까지 배치 색. 이 종종 2 미만 소요 s. 성공 하면 (이러한 팁의 SEM 이미지를 그림 5B표시) 직경에서 50-100 nm의 에칭된 전극 팁 크기 결과. 불꽃 에칭, 후 전극 팁을 평가 하는 현미경 전극을 배치 합니다.
4. 3 분 뒤에 15 s 찍기 전극 팁의 아세톤 솔루션으로 에폭시 솔루션에 원통형 nanotip microelectrode를 삽입 합니다. 아세톤 에폭시 에칭된 탄소 섬유 전극 표면에서 삭제 하는 동안 탄소 섬유와 단 열 유리 모 세관 벽 사이 잠재적인 갭 공간을 밀봉 하기 위하여 에폭시 수 있습니다. 에폭시 치료, 전극 하룻밤 100 ° c.에 오븐에 구워
5. 2.7 섹션에 설명 된 대로 테스트 각 탄소 섬유 microelectrode의 정상 상태 전류를 사용 하기 전에 주기적 voltammetry를 사용 하 여. 실험, 고원 주위 현재 표시 전극 사용 1.5-2.5 나²⁷.
6. 세포 amperometry 측정을 위해 셀 현미경에서 2.8에 설명 된 대로 놓고 2.9에 설명 된 대로 potentiostat의 동일한 실험 설정을 사용 합니다.
7. 세포내 amperometric 측정을 수행 하 고 셀에 상당한 물리적 손상을 방지 하기 위해 삽입 nanotip 원통형 microelectrode 셀 추가 하 여 부드러운 기계를 강제로, 충분히 밀어 셀 플라즈마를 통해 전극 막 한 micromanipulator를 사용 하 여 세포 세포질에.
8. 삽입 후 봉인 원통형 전극 주위 세포 막으로 라이브 셀에서 원래의 장소에 amperometric 녹음을 시작 합니다. 산화 전극에 적용 되는 잠재적인, 소포 전극 표면에 흡착 하 고 확률론 파열.  따라서,이 과정을 시작 하는 자극의 어떤 종류에 대 한 필요가 있다.
9. 기 quantal 크기에 삼 투 효과 확인 하려면 섹션 2.13에에서 설명 된 대로 실험 상태를 사용 하 고 버퍼와 isotonic에서 incubated 되었습니다 셀의 그룹에서 세포내 cytometry 측정을 수집 합니다.

4. 데이터 분석 Amperometry 기록의

1. Exocytosis 및 세포내 소포 quantal 크기 분석에서 기록 된 amperometry 데이터를 분석 하려면 시간 추적 대 기록된 전류에서 그래서 그 운동 전류 과도 특성의 분석을 허용 하는 소프트웨어 프로그램을 사용 피크 매개 변수 및 개별 현재 피크에 대 한 통합된 총 요금을 확인할 수 있습니다. 데이터 분석을 위해 데이터 분석 프로그램 이고르²⁸작성 된 슐 실험실에서 개발 된 소프트웨어를 사용 했습니다.
2. 스파이크는 amperometric를 분석 하는 경우 세 번 루트-평균 제곱 (RMS)의 표준 편차 각 기록에 대 한 잡음의 봉우리에 대 한 임계값 제한을 선택 합니다.
3. Amperometric 스파이크 거짓 스파이크를 가우스 모양에 따라, 두 번 병합된 exocytosis 이벤트의 결과 고만 세 번의 임계값과 가우스 모양된 스파이크를 받아들일 수 있는 스파이크를 방지 하기 위해 수동으로 각 셀 녹음에서 수집 RMS 잡음 보다는 높이.
4. 단일 amperometric 당 총 비용에 대 한 데이터 수집에 피크 하 고 Faradays 법을 사용 하 여 (N = QnF) 카 테 콜 아민 신경 전달 물질 exocytosis 또는 세포내 단일 기 파열 이벤트, 여기서 N은의 두더지 당 감지의 어 금 니 금액을 계산 하 Q, 전극 표면에서 산화 환 원 반응을 통해 신경 전달 물질 각 스파이크, n에서 감지 하는 총 충전 = = 산화 환 원 반응에 전송 하는 전자의 수 (n = 2 catecholamines에 대 한), 및 Faraday´s 상수 F = 96485 C/mol.
5. 첫 번째 검색 각 셀에 대 한 이벤트 당 평균 요금을 계산 하 여 수집 된 데이터의 통계 분석을 수행 합니다. 다음 셀 사이의 차이 대 한 셀 사이의 평균 요금을 계산 하 고 불평등 분산 가정 셀 사이의 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 키를 누릅니다. 이 연구는 통계 분석을 위한 MATLAB 프로그램을 사용.

5. 가장 이미지 소포 크기 분석

1. 다른 삼 투 조건에서 셀의 TEM 이미지를 수행 하려면 먼저 셀 셀의 화학 정착 하기 전에 5% CO₂ 환경에서 37 ° C에서 10 분 동안 isotonic 또는 마 버퍼에 품 어.
2. 셀 고정²⁹Karnovsky 통 메서드 사용 하 여 수행 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 알을 품고 0.01% 나트륨 아 지 드, 1% 포름알데히드 및 1.25%도 샘플 4 ° c.에 저장 될 수 있는 포함 하는 솔루션
3. 고정, 후 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼와 셀을 씻어.
4. 셀 얼룩 샘플 고정, 게시 하 고 가장 이미징에 대 한 준비, 어둠 속에서 실 온에서 0.5 %uranyl 아세테이트 솔루션 부 화 1 h 뒤에 4 ° C에서 2 시간에 대 한 1% 오스뮴 tetroxide 솔루션 셀을 품 어.
5. 마지막 정착 단계에서 100% 에탄올에 셀을 rinsing 하 여 먼저 셀을 탈수 하 고 후 아세톤과 셀 린스.
6. Epoxyresin에 셀 샘플을 포함 그 후 30-40 분 4000 x g에서 원심 분리를 수행 하 고 15 h 48 h 60 ° c.에 외피 다음 40 ° C에서 유해를 셀 샘플 허용
7. 이미징에 대 한 준비, 섹션 셀 샘플에에서 포함 된 한 천 100 수 지 조각으로 두께가 60 nm는 ultramicrotome를 사용 하 여.
8. 4 분 뒤에 20 4% uranyl acetate/25% 에탄올 솔루션 셀 주제 물으로 rinsing의 s. 셀 3 분, 다음 20 레이놀즈 리드 시트르산을 씻고 물으로 헹 궈의 s.
9. 전송 전자 현미경 이미징의 셀 샘플을 수행 합니다. 우리의 실험에서 우리가 운영 하 고 있다 전송 전자 현미경에서 사용 120 kV.
10. 세포 세포질에는 소포의 인구를 표시 하는 세포 열 대권 외 먼저 셀 섹션 설명의 각 기록 된 이미지에서 픽셀 각 가장 이미지에 기록 된 눈금 막대와 연결 함으로써 이미지 픽셀 크기 보정. Isotonic 또는 마 조건에 노출 하는 셀의 각 이미지에 소포 크기를 확인 하려면 이미징 소프트웨어를 사용 합니다. 우리의 실험에서 우리는 이미지 분석을 위한 소프트웨어 ImageJ를 사용. 그것은 그 세포 열 대권 외의 TEM 이미지 셀의 이미지 분석, 크기 조정 셀 섹션의 두께에 따라 이러한 측정의 필요가 간주 하 고 이전에 Almers´s 실험실³⁰설명한 지적 가치가 있다.

결과

우리 여기 어떻게 상승의 효과에 암시는 광범위 한 보기는 정보를 제공할 수 두 전기 방법론, 탄소 섬유 amperometry와 세포내 전기 cytometry 함께 가장 영상 결합 프로토콜 설명 분 비 소포 및 exocytosis 프로세스에 extracellular 삼투성 압력. 비교 실험 설정 ( 그림1에서 참조)를 사용 하 여 단일 chromaffin 세포 exocytosis 릴리스의 대표 amperometric 녹음, exocytotic 활동에 있는 뜻깊은 감소 했다 표시 셀 삼투성에 노출 됐다 isotonic 조건 셀에 비해 스트레스 (그림 2A)²⁴. 이 녹음에서와 Faraday´s 법을 사용 하 여, 총에 의해 감지 각 개별 amperometric 현재 스파이크 셀에 서로 다른 노출에서 단일 기 exocytosis 이벤트에서 추방 하는 분자의 수를 계산 하는 데 사용 되었...

토론

우리는 여기 프로토콜과 결합 분 비 소포 및 삼투성 압력 등 물리적 힘 분 비 소포에 영향을 미칠 방법의 더 나은 이해를 얻기 위하여 exocytosis 프로세스 분석 3 보완 분석 방법의 장점을 제시합니다 그리고 분 비 세포에서 exocytosis 프로세스입니다. 이러한 방법은 exocytosis 활동, 세포내 전기 cytometry 소포 그들의 네이티브 환경에서의 quantal 크기를 결정 하는 데 사용 되는 기록에 대 한 설립 방법은 탄소 섬유 microelectrode amperometry를 포함 하 고 전송 전자 현미경 이미지 분석 분 비 소포 볼륨을 모니터링. 이 작품에는 isotonic 고 extracellular 환경에 노출 chromaffin 세포에서 단일 기 exocytosis 이벤트의 amperometry 녹음에서 양적 데이터를 수집 하 여 우리 확인 그 삼투성 충격을 현저히 감소 하는 금액 신경 전달 물질 exocytosis 동안 발표 하 고이 세포 수 역 복구 하 고 원래 수량 놓습니다 isotonic 환...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaCl	시그마 알드리치	S7653
KCl	시그마 알드리치	P9333
NaHCO3	시그마 알드리치	S5761
HEPES	시그마 알드리치	H3375
MgCl2	시그마 알드리치	M-2670
포도당	시그마 알드리치	G8270
Collagenase P	Roche, 스웨덴	11 213 857 001
100-&마이크로; M 나일론 메쉬	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
콜라겐 IV 코팅 60mm 플라스틱 접시	VWR	354416
원심 분리기	Avanti J-20XP
붕규산 유리 모세관	셔터 기기 Co., Novato, CA
마이크로 피펫 풀러	Narishing Inc., 일본	PE-21
에폭시 용액 (A 및 B)	에폭시 기술, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
도립 현미경	Olympus	IX81
패치 클램프 기기	분자 장치, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
부탄 화염	Multiflame AB, Hä sselholm, 스웨덴
투과 전자 현미경	Omega	Leo 912 AB