분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

요약

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

초록

축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 하는 정확한 신경 회로 설정 하기 위한 중요 한 프로세스입니다. 개발 하는 동안 감각 thalamocortical (TC) 축 삭 대뇌 피 질의 특정 레이어에 지점과 시 냅 스 형성합니다. 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이 명백한 공간 상관 관계에도 불구 하 고 그들 사이의 인과 관계가 제대로 이해 된다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 최근 organotypic cocultures에서 개별 TC 축 삭의 분기 및 시 냅 스 대형의 동시 이미징 방법을 개발.

이 프로토콜 organotypic coculture 및 electroporation의 조합으로 구성 되는 방법을 설명 합니다. 시상과 대뇌 피 질의 Organotypic cocultures 유전자 조작 및 axonal 프로세스, 박판 모양 구성 등 독특한 구조를 보존의 관측을 촉진 한다. 두 가지 플라스 미드 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 인코딩 했다 electroporation 기술에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 이 메서드를 사용 하 여 TC 뉴런의 개별 axonal 형태학 및 연 접 사이트를 동시에 시각화 수 있었습니다. 메서드는 또한 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 밝혀 장기 관찰을 사용할 수 있습니다.

서론

포유류 두뇌에 있는 thalamocortical (TC) 투영 축 삭 지도 메커니즘을 대상으로 조사에 적합 한 시스템입니다. 개발 하는 동안 감각 TC axons 외피 격판덮개 및 양식 지점과 시 냅 스에 우선적으로 레이어 IV의 대뇌 피 질^1,2차 감각 영역에서 성장 한다. 근본적인 연결의 설립 후에 axonal 아 버와 시 냅 스 터미널은 환경 변화^3,4에 따라 리 모델링. 그러나, 어떻게 TC 축 삭 형태학 동적으로 변경 되는 제대로 이해. 주된 이유 중 하나는 단일 세포 수준에서 구조적인 변화를 관찰 하는 적절 한 기법의 부족 이다. 전반적인 TC 궤적^5, 을 캡처에 대 한 여전히 기술적인 제한이 있다 현미경 검사 법, 2 광자 현미경 등 최근 개발 허용 생활 대뇌 피 질의 뉴런에 vivo에서의 직접 관찰, 비록 ⁶. 따라서, TC 축 삭의 라이브 이미징 방법 체 외에서 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 구조 분석을 위한 강력한 도구를 제공 것.

처음으로 우리 그룹 설립 투과성 막⁷정적 슬라이스 문화 방법. 이 방법을 사용 하 여, 쥐 대뇌 피 질의 조각 했다 감각 thalamic 블록, cocultured 그리고 lamina 특정 TC 연결 했다이 organotypic cocultures^7,8지. 형광 단백질으로 스파스 라벨 추가 수 있었습니다 TC 축 삭 성장 및 지점 형성^9,,1011관찰. 최근에, 분기의 동시 이미징에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다 그리고는 organotypic에서 개별 TC 축 삭 시 냅 스 형성 cocultures¹². TC 축 삭과 연 접 사이트를 동시에 시각화할 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 했다 organotypic coculture의 electroporation에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 현재 메서드는 TC axons의 형태소 분석을 용이 하 게 하 고 장기 관찰, 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 표시 하는 데 사용할 수 있습니다 허용 합니다.

프로토콜

모든 실험은 오사카 대학 및 일본 신경 과학 학회의 동물 복지 위원회에 의해 설립 하는 지침에 따라 수행 했다.

1. Organotypic cocultures의 시상과 대뇌 피 질

참고: 자세한 절차를 참조 원래 간행물^7,8,13. 모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. Sprague-Dawley (SD) 쥐 신경 문화 사용 됩니다.

1. 시 약의 준비
   참고: 다음 시 약의 한 쥐 두뇌에 대 한 있습니다.
   1. 수정 된 n 2 보충 x 10 준비 ¹³: 인슐린 (50 μ g/mL), 황 체 호르몬 (200 nM), 하이드로 코 티 손 (200 nM), 나트륨 selenite (300 nM), 올려진다 (1 mg/mL), putrescine (1mm), 포도 (60 mg/mL)
   2. 준비 포함 하는 혈 청 문화 매체 (10 mL): 85 %DMEM / F12, 10% 수정 10 x n 2 보충, 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)
   3. 준비 혈 청 무료 문화 매체 (20 mL): 90 %DMEM / F12, 10% 수정 10 x n 2 보충
   4. 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션 (0.5 mL)을 준비 합니다. 간단히, 무 균 조건 하에서 쥐 꼬리에서 부드러운 섬유를 초 산 솔루션에서 밤새 품 어. 원심, 후 상쾌한 (몇 mg/mL)를 수집 하 고 냉장고¹³에 저장 합니다.
2. 문화 요리 준비
   1. 35 mm 페 트리 접시에 막 삽입을 놓습니다.
   2. 막에 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션의 40-50 μ를 추가 하 고 중심 콜라겐 솔루션을 확산.
   3. 공기 깨끗 한 벤치에 완전히 막 건조.
   4. 막이는 매체와 젖, 접시에 포함 하는 혈 청 문화 매체의 1.5-2 mL를 넣어.
   5. 인큐베이터에서 (37 ° C, 습도 95%, 공기와 5% CO₂) 도금 하기 전에 문화 접시를 놓습니다.
3. 대뇌 피 질의 조각 준비
   1. 모든 수술 기구 70% 에탄올과 10 분 이상 소독.
   2. 출생 후 하루 (P) 2에서 신속 하 게 뇌를 해 부 (몇 분 동안 얼음 조각에 몰두) 하는 차가운 취 쥐.
   3. 장소 100 mm 페 트리 접시 찬 행 크 스의 100 mL를 포함으로 뇌 균형 소금 솔루션.
   4. 좋은 겸으로 두뇌에서 피아 문제를 제거 하 고 microsurgical가 위 시각과 somatosensory 피 질에서 대뇌 피 질의 조각 (300-400 μ m 두께)를 잘라 (세부 사항, 그림 1참조).
      참고: 대뇌 피 질의 조각의 두께 쌍 안 현미경 격자의 규모에 의해 대략 추정 된다.
      참고: 또는, 대뇌 피 질의 조각 무 균 조건 하에서 vibratome로 할 수 있다.
   5. 일회용 플라스틱 피 펫으로 막 삽입에 몇 대뇌 피 질의 조각 전송 합니다.
   6. (자세한 내용은 참조^8,13) 화재 광택 파스퇴르 피펫으로와 문화 삽입의 중앙 조각의 위치를 조정 하 고 삽입에서 초과 매체를 제거 합니다.
      참고: 슬라이스 가스 매체의 충분 한 공급 받을 수 있도록 조각의 표면 보다 약간 중간의 레벨을 조정 합니다. 이것은 세포 생존 능력에 대 한 중요 합니다.
   7. 혼자 하루 전에 thalamic 블록을 촬영 하 고 그것을 옆에 배치 되어 습도 95% 공기와 5% CO₂, 그리고 문화의 환경에서 37 ° C에서 포함 하는 혈 청 문화 매체에서 분할 영역을 유지 합니다.
4. Thalamic 블록의 준비
   1. 모든 수술 기구 70% 에탄올과 10 분 이상 소독.
   2. 임신한 쥐 (배아 하루 15) 복 주사 pentobarbital (50 mg/kg) 마 취를 포함 하 여 anesthetize.
   3. 자 궁 뿔에서 각 태아를 해 부 고 배아 100 mm 페 트리 접시 찬 행 크 스 균형된 소금 솔루션의 100 mL를 포함 합니다.
   4. 쌍 안 현미경 각 배아에서 뇌를 제거 하 고 주로 microsurgical가 위 ( 그림 1참조)를 사용 하 여 ventrobasal 복잡 하 고 측면 geniculate 핵 (약 0.5 m m x 3)⁷ 을 포함 하는 thalamic 블록을 잘라.
5. 문화 및 organotypic cocultures를 유지
   1. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 멤브레인 필터에 배치 되어 있는 대뇌 피 질의 조각의 심 실 표면 옆 thalamic 블록을 배치 합니다.
   2. 습도 95% 공기와 5% CO₂의 환경에서 37 ° C에서 포함 하는 혈 청 문화 매체에서 cocultures을 유지 관리 합니다.
   3. 문화에 있는 2 일 후 혈 청 무료 문화 매체와 매체의 절반을 교환 합니다. 그 후, 매체 2-3 일 마다 교환 합니다.
      참고: 매체의 수준으로 세포 생존에 대 한 중요 한 중간 교환 후 확인 되어야 한다.

2입니다. Electroporation

모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.

참고: Electroporation 블록의 분리를 방지 하기 위해 thalamic 블록의 준비 후에 1 일을 수행 합니다.

1. 플라스 미드
   1. 플라스 미드의 혼합물을 다음과 같이 확인: pCAGGS-DsRed 2 μ g/μ; pCAG SYP EGFP 3.5 μ g/μ.
      참고: 내 무료 Maxiprep 키트를 사용 하 여 두 플라스 미드 정화 하 고 행 크 스 균형된 소금물에 용 해.
2. Electroporation 장비 설치
   자극과는 아이 솔 레이 터 등 전기 악기는 그림 2와 같이 연결 되어야 합니다.
   1. 복 형 아이 솔 레이 터에는 자극을 연결 합니다.
   2. 전극 (실버 와이어 0.2 m m 직경)는 아이 솔 레이 터의 부정적인 터미널에 연결 합니다.
   3. 전극 (실버 와이어 1 m m 직경) 시리즈는 100 Ω 저항 하는 아이 솔 레이 터의 긍정 맨끝에 연결 합니다.
   4. 전기 전류 저항는 증폭기와 전압을 측정 하 여 전달 여부를 모니터링 하는 오실로스코프에 앰프를 연결 합니다.
3. 유리 펫의 준비
   참고: 두 가지 유형의 유리 펫 플라스 미드 솔루션의 방출 및 전기 펄스의 응용 프로그램에 대 한 사용 됩니다.
   1. 전극 끌어당기는 사람와 유리 모 세관에서 펫을 확인 합니다.
   2. 휴식 방출 피 펫에 대 한 팁 (팁 직경 20-50 μ m 이어야 한다).
   3. 갈기 고 화재 연마 (내부 직경 50-200 μ m 이어야 한다) 다음 샌드 페이퍼와 전극 피 펫의 끝을 폴란드어.
      참고: 전극 팁은 직접 조직 접촉으로 평평 하 고 부드러운, 이어야 한다.
4. Electroporation 절차
   1. 배출 및 전극 펫은 컨트롤러에 연결 합니다.
   2. 전극 피 펫에 실버 와이어 (0.2 m m 직경)를 삽입 합니다.
   3. 플라스틱 튜브 1 mL 주사기를 방출 피 펫을 연결 합니다.
   4. 차지 > 주사기 흡입에 의해 방출 피 펫에 플라스 미드 솔루션의 5 μ.
   5. Electroporation 단계에 coculture를 넣어 하 고 문화 매체에 1mm 직경 전극 삽입.
   6. Thalamic explant에 방출 피 펫을 놓습니다.
   7. 팁 thalamic 블록의 표면 접촉 후 주사기를 수동으로 밀어.
      참고: 플라스 미드의 0.5 μ에 대 한 솔루션으로 하나의 thalamic 블록 당 사용 됩니다.
   8. 즉시 방출 피 펫의 철회 후 전극 피 펫을 thalamic 블록에 놓습니다.
   9. 전기 펄스 (50-400 µ A, 200 Hz에서 1 ms 기간 200 평방 펄스의 3 ~ 5 열차)를 제공 합니다. 진폭 및 오실로스코프에 열차의 수를 모니터링 합니다.
      참고: 전기 전류 진폭 전극 피 펫¹³의 내부 직경에 따라 다릅니다.
   10. 전극 피 펫을 철회 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
5. 현미경 관찰
   1. 문화 요리 EGFP에 대 한 두 개의 필터 집합을 갖춘 올바른 confocal 현미경의 현미경 단계에 넣어 (여기, 488 nm; 방출, 515 nm) 및 DsRed (여기, 514 nm, 방출, 565 nm).
   2. 1-7 µ m 단계 크기는 20 X 긴 작동 거리 대물 렌즈에서 10-25 광 섹션의 이미지를 가져가 라. DsRed와 SYP EGFP 표현 하는 개별적으로 구별할 수 레이블이 축 삭을 선택 합니다.
      참고: 관찰된 지역 (1024 x 1024 픽셀, 즉 해당, 0.68 μ m/픽셀) 약 0.7 x 0.7 m m 이다.
   3. 캡처 이미지 매일 이미징에 대 한 모든 24 h. 실 온에서 10 분 이내 완료 하 고 문화 인큐베이터에 반환. 짧은 간격 시간 경과 영상에 대 한의 환경 습도 95% 공기와 5% CO₂ 37 ° c.에 유지 문화 실에서 문화 유지

결과

실험 여기 TC 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 관계를 공개 하는 것을 목표로 설명 합니다. 동시에 시각화 axonal 궤도 및 연 접 사이트, 단일의 위치 또는 몇 thalamic 셀 organotypic cocultures 인코딩 SYP EGFP 및 DsRed electroporation를 사용 하 여 두 개의 플라스 미드와 페 했다. 문화에서 두 번째 주 동안 개별적으로 구별할 수 TC axons 했다 DsRed (그림 3)에 의해 명확 하 게 표시 됩니다. DsRed 및 SYP EGFP 전시 axons만 관찰에 대 한 선정 됐다. 레이블이 지정 된 TC axons 대뇌 피 질의 조각 침공과 organotypic에서 thalamic axons vivo에서^7, 있는 층 류 특이성 닮은와 양식 지점 cocultures를 나타내는 상...

토론

현재 프로토콜은 또한 TC 프로젝션¹¹의 다른 축 삭 성장 발달 측면을 연구 하는 강력한 도구입니다. 예를 들어, 대뇌 피 질의 조각 문화와 electroporation 기술은의 조합을 대뇌 피 질의 신경 세포와 장기 관찰^9,18의 개별 axonal 형태를 시각화 수 있습니다.

현재 프로토콜을 사용 하 여 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성에 흥미 있는 유전자의 역할은 또한 형광 단백질 및 관심 유전자의 공동 식으로 분석할 수 있습니다. 일반적으로, 이상의 형광 단백질 표현 세포의 90%는 공동 페 두 번째 플라스 미드와 플라스 미드 솔루션의 어 금 니 비율 1:2^18,19로 조정. 그러나, 최적의 비율 공동 transfection ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
Hanks' 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)	Nissui	5905
Fetal 소 세럼 (FBS)	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyclone
인슐린	Sigma	I6634
프로게스테론		Sigma P8783
Hydrocortisone	Sigma& 주의;	H0888
나트륨 셀렌트	Wako Pure Chemical Industries	192-10843
트랜스퍼린	시그마	T1147
Putrescine	Sigma	P5780
포도	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
35mm 페트리 접시	Falcon	351008
Millicell-CM 인서트	Millipore	PICMORG50
100mm 페트리 접시	BIO-BIK	I-90-20	페트리 접시 sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen
일회용 멸균 플라스틱 피펫		202-IS	트랜스퍼 피펫 멸균
유리 모세관: OD 1.2 mm	Narishige	G-1.2	내경, 1.2 mm
실버 와이어: 0.2 및 1 mm	Nilaco	AG-401265 (직경, 0.2 mm), AG-401485 (직경, 1.0 mm)
1 mL 주사기	Terumo	SS-01T
Stimulator	A.M.P.I	Master 8
바이페이식 아이솔레이터	BAK ELECTRONICS	BSI-2
증폭기	A-M 시스템	모델 1800
오실로스코프	Hitachi	VC-6723
조작기	Narishige	SM-15
마이크로 조작기	Narishige	MO-10
실체현미경	Olympus	SZ40
범용 스탠드	Olympus	SZ-STU2
조명 시스템	Olympus	LG-PS2, LG-DI, HLL301
전극 풀러	Narishige	PC-10
컨포칼 현미경	Nikon	Digital eclipse C1 레이저
x20 대물	렌즈 Nikon	ELWD 20x/0.45
배양실	Tokai Hit	UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat	Japan SLC 및 Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors	Natsume	MB-54-1