방법 논문

세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

DOI:

10.3791/56560

2018년 3월 26일

이 논문에서

요약

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이 연구는 유틸리티 양적 세포 막 확장 측정 및 셀의 접착 능력의 상관 관계의 용이성을 보여 줍니다. 대표적인 예로 우리 보여 여기 그 Dickkopf 관련 단백질 3 (DKK3) 증가 lobopodia 형성을 촉진 하 고 adrenocortical 암 접착 력 셀 세포 생체 외에서.

초록

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세포 막의 확장 레 퍼 토리 그들의 접착제와 철새 잠재력을 포함 하 여 암 세포의 다양 한 악성 동작을 조절 한다. 정확 하 게 분류 셀 확장을 계량 하 고 세포의 접착 능력에 미치는 영향을 측정 하는 능력은 어떻게 셀 신호 이벤트 영향 암 세포 행동 및 공격 성을 결정 하는 중요 한. 여기, 우리가 시험관에서 설계 및 방법의 사용은 셀 확장 정량화 함께에서 설립 체 외에 모델에 접착 용량 분석 결과와 adrenocortical 암 (ACC)에 대 한 설명. 특히, 우리는 효과 DKK3의 putative 종양 억제기와 프로 차별화 요소, ACC 셀 라인, 소프트웨어-13의 막 확장 표현 형에 테스트합니다. 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 제공 하기 위해 이러한 분석을 제안 하 고 쉽게 해석할 통계를 다양 한 실험 조건에서 이러한 특성을 측정 합니다.

서론

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Dysregulated WNT 신호 adrenocortical 악성1에 중요 한 역할을 한다. 이 연구에 사용 하는 방법 조사 여부 DKK3의 입을, WNT 신호의 부정적인 레 귤 레이 터 부 신 피 질에서 dedifferentiation 이벤트 나타내고 셀 확장 레 퍼 토리 변화의 맥락에서 종양의 형성을 촉진 한다. DKK3 38 kDa 분 비는 N 맨끝 신호 펩 티 드와 당단백질 이며 그 적용된 식 세포 주기 검거 귀착되 공격적인 악성 행동을 저해 및 엽 상피 반전 이전 학문은 설명 했다 전환2.

Adrenocortical 암 (ACC) 및 다른 암 악성 동작, 부분에서 주변 표면으로 인터페이스 하는 종양 세포의 기능에 의해 영향을 포함 하 여 기질에 종양 세포 내 습을 촉진 하 고 마이그레이션3. 암 진행에 특정 세포 막 확장의 역할은 filopodia 형성을 통해 주로 다양 한 문맥에서 점점 시연 되 고. 예를 들어 L-타입 칼슘 채널의 overexpression filopodia 형성을 유도 하 여 종양 세포 침공4홍보 발견 되었습니다. 마찬가지로, Fascin, 최소한 단백질 바인딩 하는 걸 정상 조직에서 표현 이기도 overexpressed filopodia 형성5와 협회에서 암 세포에 합니다. 그러나 Lobopodia 대형 엑스트라 세포 매트릭스를 통해 효과적으로 마이그레이션할 비 악성 섬유 아 세포,, 그것은 보였다 fibrosarcoma 셀 셀 마이그레이션을 촉진 하기 위하여 lobopodia 대신 metalloproteinase 활동에 의존 하 고 침략6. 우리는 종양으로 나타났습니다 진압, Ras 연결 도메인 가족 1 isoform (RASSF1A)를 포함 하 여 및 DKK3, 함수 cytoskeletal 요소를 변경 하 고 lamellipodia 형성 증진과 침략 속성7,8방해 구를 두 다 수 있습니다.

이와 같이, 그것은 발암 및 세포 막 확장 변경, 특히 filopodia, lobopodia, 및 lamellipodia 테스트 조건 하에서 형성 평가의 관계에 관련 된 유전자의 영향을 특성에 중요 한. 현재 상태-최첨단 기술을 데이터 수집 및 해석에 대 한 점점 더 정교한 현미경 방법, 형광 라벨, 복잡 한 컴퓨터 알고리즘의 사용을 포함 합니다. 이러한 방법은 새롭고 강력한 분석 도구를 제공 하는 동안 그들의 광범위 한 사용과 세포 생물학 실험에 그들의 복잡도 제한 합니다. 또한, 정확한 정량화 및 셀 확장 형태에 변화의 관찰 아니다 일반적으로 측정된9,10. 반면, 여기 셀 확장 변경 표준 현미경 기술과 쉽게 적응할 수 있는 생체 외에서 메서드를 사용 하 여 정확 하 게 단정 하는 기술을 소개 합니다. 이러한 메서드는 또한 동시에 분석 하는 각 셀에 대 한 각 셀 확장 종류 계량 하 고 세포 막 확장 레 퍼 토리에 전반적인 변화를 결정 합니다. 우리는 또한 어떻게 이러한 변화 세포 접착 속성에 관련 된 수 보여줍니다.

실험 예를 들어, 우리는 소프트웨어-13, SW-DDK3, pCMV6-항목/DKK3 플라스 미드 벡터와 안정적으로 페 되었습니다 하 고 constitutively DKK3, 아드레날린 선에 차별화 요소를 overexpresses 지정의 이전에 만든된 셀 라인을 사용 합니다. 비 페 SW-13 셀과 남서-13 셀 안정적으로 빈 벡터 (pCMV6-항목), 소프트웨어-네오, 지정 된 페 실험 컨트롤 될 것입니다.

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프로토콜

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1. 셀 확장 특성

  1. SW-13, SW-신, 그리고 남서 DKK3 세포는 표준 습도 인큐베이터 37.0 ° c, 5% CO2 Dulbecco의 수정이 글 중간에 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 10000 U/mL 페니실린과 스 ('성장 매체'로 지정)에 유지 합니다.
    1. Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 별도 6 잘 플레이트에 SW, SW-신, 그리고 남서 DKK3 라인에 대 한 잘 당 5000 셀 접시 하룻밤 불 임 유리 coverslips에 성장 매체에 성장.
  2. 각 잘 하룻밤 성장 성장 매체 발음, 후 따뜻한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 세포 세척 하 고 10 분 동안 3.7% 포름알데히드의 1 mL와 함께 셀을 수정.
  3. 30 분 세척 초과 대 한 0.05% 크리스탈 바이올렛의 1 mL와 함께 각 잘에서 aspirate 포름알데히드와 얼룩 셀 멀리 1 mL 이온된 물 3 세척을 사용 하 여 염료.
    참고: 염료의 통풍 관의 수준에 따라 몇 가지 추가 세척 배경 셀 시각화 홍보 얼룩을 제거 하려면 필요할 수 있습니다.
    1. 잘 밀고 집게를 사용 하 여 coverslips를 검색 하 고 그들에 게 아래로 얼굴을 배치 분명 장착 시 약의 방울으로 레이블이 지정 된 유리 슬라이드에.
  4. 가벼운 현미경 임의로 셀 확장 분석 결과 대 한 각 coverslip에서 겹치지 않는 셀의 20 조회를 선택 합니다.
    1. 보기의 각 필드의 400 배 확대에서 photomicrographs를 받아. 직접 각 20 대표 셀의 확장의 각 종류의 수를 계산.
      참고: 이와 같이, 20 고립된 세포 시험 되어야 한다 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 각 시험된 조건에 대 한. Filopodia 5 미크론 이하의 기지와 단일 정점 세포 확장에 의해 정의 되었다. Lobopodia는 여러 개의 apices로 길이 포함 된 확장의 5 ~ 20 미크론의 기지와 세포 확장에 의해 정의 되었다. Lamellipodia는 길이 및 또는 없이 apices 20 미크론 보다 큰 셀 확장에 의해 정의 되었다. 테스트 셀 유형에 따라 셀 확장의 크기는 다를 수 있습니다와 조정 매개 변수를 식별 해야 할 수 있습니다.
  5. 검사 6 우물에 걸쳐 각 셀 형식 (, 소프트웨어-13, 남서-네오, 남서 DDK)에서 각 셀 확장의 평균 수를 확인 합니다.
  6. 단방향 분산 분석 (ANOVA) 통계 테스트를 사용 하 여 다른 테스트 세포 유형 사이 세포 막 확장의 평균 비율에 차이 비교 합니다.

2. 접착 시험

  1. SW-13, SW-신, 그리고 성장 매체에서 37.0 ° C, 5% CO2 표준 습도 인큐베이터에서 남서 DKK3 셀 유지 합니다.
    1. hemocytometer를 사용 하 여 계산 별도 6 잘 플레이트에 잘 당 SW, SW-신, 그리고 소프트웨어-DKK3의 100000 세포를 플레이트와 하룻밤 성장 매체에 성장.
    2. 아래 테스트 6 시간 포인트의 각 한 격판덮개를 사용 하 여 각 세포 유형에 씨앗 6 잘 플레이트 테스트.
      참고: 시간 포인트는 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다.
  2. 야간 보육, 따뜻한 PBS 가진 셀을 한 번 씻어 후 각 우물에 비 효소 세포 분리 솔루션 x 1의 0.5 mL를 추가 합니다.
    1. 세포 분리 솔루션 확산 판을 소용돌이 친다. 정의 된 시간 점 (즉, 1, 2, 3, 5, 10 및 15 분)에 지정 된 접시를 발음 하 고 1 mL 따뜻한 PBS 솔루션 세 번 씻어.
    2. 세척, 사이 부드럽게 느슨하게 연결 된 셀을 분리할 접시를 누릅니다.
  3. 모든 남아 있는 PBS와 3.7% 포름알데히드 10 분의 1 mL와 함께 접시에 남은 셀 첨부 수정 발음.
  4. 30 분에 대 한 0.05% 크리스탈 바이올렛의 1 mL로 세포를 얼룩이 다음 과잉 염료 이온된 물 1 mL로 멀리 세척. 셀 시각화를 촉진 하는 세척 적정
    참고: 염료의 통풍 관의 수준에 따라 몇 가지 추가 세척 셀 시각화를 홍보 하기 위해 필요할 수 있습니다.
  5. 100 x 확대 가벼운 현미경을 사용 하 여, 각 잘 각 접시에 나머지 연결 된 셀을 계산 합니다.
    참고: 투명 눈금자 또는 좋은 펜 접시의 하단 측면에 가이드 표시의 사용을 동일한 세포의 반복 계산을 피하기 위해 도움이 됩니다.
  6. 각 접시에 잘 당 연결 된 셀의 평균 수를 확인 합니다.
  7. 양방향 ANOVA 통계 테스트를 사용 하 여 주어진된 시간 동안 SW, SW-신, 그리고 남서 DDK3 셀 사이의 셀 분리의 속도 비교 합니다.

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결과

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위의 분석 실험을 사용 하 여 셀 확장 형태학 및 세포 접착 속성에 DKK3 overexpression의 효과 설립된 ACC 셀 라인 SW-13, 체 외에서테스트 되었습니다. 셀 DKK3 overexpressing는 안정적으로 남서 13 셀 Myc DDK 태그 pCMV6-항목/DKK3 플라스 미드 벡터 및 소프트웨어 DKK3로 지정 된 transfecting에 의해 생성 되었다. 마찬가지로, 안정적으로 빈 벡터 pCMV6 항목과 transfected 세포 transfection 고 뿌리고 컨트롤로 생성 되었고 SW-네오로 정의. SW-13 셀 추가 부모 셀 컨트롤로 사용 되었다. SW-DKK3에서 DKK3의 overexpression 양적 실시간 PCR에 의해 확인 되었다 그리고 서쪽 오 점 기술8.

간단...

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토론

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여기 우리는 생체 외에서 양적 방법 용이성, 몇 구 덩이-폭포, 그리고 다양 한 테스트 조건에 대 한 적용할 수 있는 안정적인 재현성 셀 확장의 특성을 설명 합니다. 또한, 간단 하 고, 정량 접착 및 운동 성 분석 실험 세포 막 확장에 관찰된 변경의 잠재적인 기능적 중요성을 상관 관계를 동시에 수행할 수 있습니다.

그러나, 이러한 방법을 몇 가지 잠재적인 제한이 발생할 수 있습니다. 첫째, 여기 셀 확장의 종류를 식별 하기 위해 지정 된 표준 adrenocortical 소프트웨어-13 셀 형태학에 기초 하 고 따라서 가능성이 필요한 분류 매개 변수 다른 세포 유형 및 실험 조건에 적용 될 때에 구체화. 또한, 연장된 시간 과정 실험, 세포 주기 세포 죽음에 세포 막 확장 변경의 잠재적인 영향 간주 해야 합니다.

둘째, 프로토콜 간 관찰자 유사 인해 분석 결과 재현성을 제한할 수 있는 심사 관에 의해 잠재적인 개별...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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타다 부여 재단 자금이 작품.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco의 수정된 독수리 매체 (DMEM)ThermoFisher11965-092태아 소 세럼과 페니클린 및 스트렙토마이신으로 보충
. Deulbeco의 인산염 완충 식염수Sigma-AldrichD85371X 용액, 직접
사용 3.7% 포름알데히드 Sigma-AldrichF8775희석 주식 용액
0.05% 크리스탈 바이올렛 Harleco192-12희석 원료 용액
탈이온수NANA
NA 현미경 400X 배율 NANANA
6웰 플레이트Corning353046
NA 세포 해리 용액 비효소 1XSigma-AldrichC5914 1X 솔루션, 직접 사용
는 되었습니다

참고문헌

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  1. Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
  2. Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297(2016).
  5. Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
  6. Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
  7. Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87(2013).
  8. Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164(2017).
  9. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
  10. Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905(2017).

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DKK3SW 13

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