세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

요약

이 연구는 유틸리티 양적 세포 막 확장 측정 및 셀의 접착 능력의 상관 관계의 용이성을 보여 줍니다. 대표적인 예로 우리 보여 여기 그 Dickkopf 관련 단백질 3 (DKK3) 증가 lobopodia 형성을 촉진 하 고 adrenocortical 암 접착 력 셀 세포 생체 외에서.

초록

세포 막의 확장 레 퍼 토리 그들의 접착제와 철새 잠재력을 포함 하 여 암 세포의 다양 한 악성 동작을 조절 한다. 정확 하 게 분류 셀 확장을 계량 하 고 세포의 접착 능력에 미치는 영향을 측정 하는 능력은 어떻게 셀 신호 이벤트 영향 암 세포 행동 및 공격 성을 결정 하는 중요 한. 여기, 우리가 시험관에서 설계 및 방법의 사용은 셀 확장 정량화 함께에서 설립 체 외에 모델에 접착 용량 분석 결과와 adrenocortical 암 (ACC)에 대 한 설명. 특히, 우리는 효과 DKK3의 putative 종양 억제기와 프로 차별화 요소, ACC 셀 라인, 소프트웨어-13의 막 확장 표현 형에 테스트합니다. 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 제공 하기 위해 이러한 분석을 제안 하 고 쉽게 해석할 통계를 다양 한 실험 조건에서 이러한 특성을 측정 합니다.

서론

Dysregulated WNT 신호 adrenocortical 악성¹에 중요 한 역할을 한다. 이 연구에 사용 하는 방법 조사 여부 DKK3의 입을, WNT 신호의 부정적인 레 귤 레이 터 부 신 피 질에서 dedifferentiation 이벤트 나타내고 셀 확장 레 퍼 토리 변화의 맥락에서 종양의 형성을 촉진 한다. DKK3 38 kDa 분 비는 N 맨끝 신호 펩 티 드와 당단백질 이며 그 적용된 식 세포 주기 검거 귀착되 공격적인 악성 행동을 저해 및 엽 상피 반전 이전 학문은 설명 했다 전환².

Adrenocortical 암 (ACC) 및 다른 암 악성 동작, 부분에서 주변 표면으로 인터페이스 하는 종양 세포의 기능에 의해 영향을 포함 하 여 기질에 종양 세포 내 습을 촉진 하 고 마이그레이션³. 암 진행에 특정 세포 막 확장의 역할은 filopodia 형성을 통해 주로 다양 한 문맥에서 점점 시연 되 고. 예를 들어 L-타입 칼슘 채널의 overexpression filopodia 형성을 유도 하 여 종양 세포 침공⁴홍보 발견 되었습니다. 마찬가지로, Fascin, 최소한 단백질 바인딩 하는 걸 정상 조직에서 표현 이기도 overexpressed filopodia 형성⁵와 협회에서 암 세포에 합니다. 그러나 Lobopodia 대형 엑스트라 세포 매트릭스를 통해 효과적으로 마이그레이션할 비 악성 섬유 아 세포,, 그것은 보였다 fibrosarcoma 셀 셀 마이그레이션을 촉진 하기 위하여 lobopodia 대신 metalloproteinase 활동에 의존 하 고 침략⁶. 우리는 종양으로 나타났습니다 진압, Ras 연결 도메인 가족 1 isoform (RASSF1A)를 포함 하 여 및 DKK3, 함수 cytoskeletal 요소를 변경 하 고 lamellipodia 형성 증진과 침략 속성^7,8방해 구를 두 다 수 있습니다.

이와 같이, 그것은 발암 및 세포 막 확장 변경, 특히 filopodia, lobopodia, 및 lamellipodia 테스트 조건 하에서 형성 평가의 관계에 관련 된 유전자의 영향을 특성에 중요 한. 현재 상태-최첨단 기술을 데이터 수집 및 해석에 대 한 점점 더 정교한 현미경 방법, 형광 라벨, 복잡 한 컴퓨터 알고리즘의 사용을 포함 합니다. 이러한 방법은 새롭고 강력한 분석 도구를 제공 하는 동안 그들의 광범위 한 사용과 세포 생물학 실험에 그들의 복잡도 제한 합니다. 또한, 정확한 정량화 및 셀 확장 형태에 변화의 관찰 아니다 일반적으로 측정된^9,10. 반면, 여기 셀 확장 변경 표준 현미경 기술과 쉽게 적응할 수 있는 생체 외에서 메서드를 사용 하 여 정확 하 게 단정 하는 기술을 소개 합니다. 이러한 메서드는 또한 동시에 분석 하는 각 셀에 대 한 각 셀 확장 종류 계량 하 고 세포 막 확장 레 퍼 토리에 전반적인 변화를 결정 합니다. 우리는 또한 어떻게 이러한 변화 세포 접착 속성에 관련 된 수 보여줍니다.

실험 예를 들어, 우리는 소프트웨어-13, SW-DDK3, pCMV6-항목/DKK3 플라스 미드 벡터와 안정적으로 페 되었습니다 하 고 constitutively DKK3, 아드레날린 선에 차별화 요소를 overexpresses 지정의 이전에 만든된 셀 라인을 사용 합니다. 비 페 SW-13 셀과 남서-13 셀 안정적으로 빈 벡터 (pCMV6-항목), 소프트웨어-네오, 지정 된 페 실험 컨트롤 될 것입니다.

프로토콜

1. 셀 확장 특성

1. SW-13, SW-신, 그리고 남서 DKK3 세포는 표준 습도 인큐베이터 37.0 ° c, 5% CO₂ Dulbecco의 수정이 글 중간에 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 10000 U/mL 페니실린과 스 ('성장 매체'로 지정)에 유지 합니다.
   1. Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 별도 6 잘 플레이트에 SW, SW-신, 그리고 남서 DKK3 라인에 대 한 잘 당 5000 셀 접시 하룻밤 불 임 유리 coverslips에 성장 매체에 성장.
2. 각 잘 하룻밤 성장 성장 매체 발음, 후 따뜻한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 세포 세척 하 고 10 분 동안 3.7% 포름알데히드의 1 mL와 함께 셀을 수정.
3. 30 분 세척 초과 대 한 0.05% 크리스탈 바이올렛의 1 mL와 함께 각 잘에서 aspirate 포름알데히드와 얼룩 셀 멀리 1 mL 이온된 물 3 세척을 사용 하 여 염료.
   참고: 염료의 통풍 관의 수준에 따라 몇 가지 추가 세척 배경 셀 시각화 홍보 얼룩을 제거 하려면 필요할 수 있습니다.
   1. 잘 밀고 집게를 사용 하 여 coverslips를 검색 하 고 그들에 게 아래로 얼굴을 배치 분명 장착 시 약의 방울으로 레이블이 지정 된 유리 슬라이드에.
4. 가벼운 현미경 임의로 셀 확장 분석 결과 대 한 각 coverslip에서 겹치지 않는 셀의 20 조회를 선택 합니다.
   1. 보기의 각 필드의 400 배 확대에서 photomicrographs를 받아. 직접 각 20 대표 셀의 확장의 각 종류의 수를 계산.
      참고: 이와 같이, 20 고립된 세포 시험 되어야 한다 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 각 시험된 조건에 대 한. Filopodia 5 미크론 이하의 기지와 단일 정점 세포 확장에 의해 정의 되었다. Lobopodia는 여러 개의 apices로 길이 포함 된 확장의 5 ~ 20 미크론의 기지와 세포 확장에 의해 정의 되었다. Lamellipodia는 길이 및 또는 없이 apices 20 미크론 보다 큰 셀 확장에 의해 정의 되었다. 테스트 셀 유형에 따라 셀 확장의 크기는 다를 수 있습니다와 조정 매개 변수를 식별 해야 할 수 있습니다.
5. 검사 6 우물에 걸쳐 각 셀 형식 (즉, 소프트웨어-13, 남서-네오, 남서 DDK)에서 각 셀 확장의 평균 수를 확인 합니다.
6. 단방향 분산 분석 (ANOVA) 통계 테스트를 사용 하 여 다른 테스트 세포 유형 사이 세포 막 확장의 평균 비율에 차이 비교 합니다.

2. 접착 시험

1. SW-13, SW-신, 그리고 성장 매체에서 37.0 ° C, 5% CO₂ 표준 습도 인큐베이터에서 남서 DKK3 셀 유지 합니다.
   1. hemocytometer를 사용 하 여 계산 별도 6 잘 플레이트에 잘 당 SW, SW-신, 그리고 소프트웨어-DKK3의 100000 세포를 플레이트와 하룻밤 성장 매체에 성장.
   2. 아래 테스트 6 시간 포인트의 각 한 격판덮개를 사용 하 여 각 세포 유형에 씨앗 6 잘 플레이트 테스트.
      참고: 시간 포인트는 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다.
2. 야간 보육, 따뜻한 PBS 가진 셀을 한 번 씻어 후 각 우물에 비 효소 세포 분리 솔루션 x 1의 0.5 mL를 추가 합니다.
   1. 세포 분리 솔루션 확산 판을 소용돌이 친다. 정의 된 시간 점 (즉, 1, 2, 3, 5, 10 및 15 분)에 지정 된 접시를 발음 하 고 1 mL 따뜻한 PBS 솔루션 세 번 씻어.
   2. 세척, 사이 부드럽게 느슨하게 연결 된 셀을 분리할 접시를 누릅니다.
3. 모든 남아 있는 PBS와 3.7% 포름알데히드 10 분의 1 mL와 함께 접시에 남은 셀 첨부 수정 발음.
4. 30 분에 대 한 0.05% 크리스탈 바이올렛의 1 mL로 세포를 얼룩이 다음 과잉 염료 이온된 물 1 mL로 멀리 세척. 셀 시각화를 촉진 하는 세척 적정
   참고: 염료의 통풍 관의 수준에 따라 몇 가지 추가 세척 셀 시각화를 홍보 하기 위해 필요할 수 있습니다.
5. 100 x 확대 가벼운 현미경을 사용 하 여, 각 잘 각 접시에 나머지 연결 된 셀을 계산 합니다.
   참고: 투명 눈금자 또는 좋은 펜 접시의 하단 측면에 가이드 표시의 사용을 동일한 세포의 반복 계산을 피하기 위해 도움이 됩니다.
6. 각 접시에 잘 당 연결 된 셀의 평균 수를 확인 합니다.
7. 양방향 ANOVA 통계 테스트를 사용 하 여 주어진된 시간 동안 SW, SW-신, 그리고 남서 DDK3 셀 사이의 셀 분리의 속도 비교 합니다.

결과

위의 분석 실험을 사용 하 여 셀 확장 형태학 및 세포 접착 속성에 DKK3 overexpression의 효과 설립된 ACC 셀 라인 SW-13, 체 외에서테스트 되었습니다. 셀 DKK3 overexpressing는 안정적으로 남서 13 셀 Myc DDK 태그 pCMV6-항목/DKK3 플라스 미드 벡터 및 소프트웨어 DKK3로 지정 된 transfecting에 의해 생성 되었다. 마찬가지로, 안정적으로 빈 벡터 pCMV6 항목과 transfected 세포 transfection 고 뿌리고 컨트롤로 생성 되었고 SW-네오로 정의. SW-13 셀 추가 부모 셀 컨트롤로 사용 되었다. SW-DKK3에서 DKK3의 overexpression 양적 실시간 PCR에 의해 확인 되었다 그리고 서쪽 오 점 기술⁸.

간단...

토론

여기 우리는 생체 외에서 양적 방법 용이성, 몇 구 덩이-폭포, 그리고 다양 한 테스트 조건에 대 한 적용할 수 있는 안정적인 재현성 셀 확장의 특성을 설명 합니다. 또한, 간단 하 고, 정량 접착 및 운동 성 분석 실험 세포 막 확장에 관찰된 변경의 잠재적인 기능적 중요성을 상관 관계를 동시에 수행할 수 있습니다.

그러나, 이러한 방법을 몇 가지 잠재적인 제한이 발생할 수 있습니다. 첫째, 여기 셀 확장의 종류를 식별 하기 위해 지정 된 표준 adrenocortical 소프트웨어-13 셀 형태학에 기초 하 고 따라서 가능성이 필요한 분류 매개 변수 다른 세포 유형 및 실험 조건에 적용 될 때에 구체화. 또한, 연장된 시간 과정 실험, 세포 주기 세포 죽음에 세포 막 확장 변경의 잠재적인 영향 간주 해야 합니다.

둘째, 프로토콜 간 관찰자 유사 인해 분석 결과 재현성을 제한할 수 있는 심사 관에 의해 잠재적인 개별...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 수정된 독수리 매체 (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	태아 소 세럼과 페니클린 및 스트렙토마이신으로 보충
. Deulbeco의 인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	D8537	1X 용액, 직접
사용 3.7% 포름알데히드	Sigma-Aldrich	F8775	희석 주식 용액
0.05% 크리스탈 바이올렛	Harleco	192-12	희석 원료 용액
탈이온수	NA	NA
NA 현미경 400X 배율	NA	NA	NA
6웰 플레이트	Corning	353046
NA 세포 해리 용액 비효소 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X 솔루션, 직접 사용