이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.
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방법 논문
모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
다중 대상, 짧은 시간, 그리고 단일 테스트 운영 하 게 쉬운에서 여러 핵 산의 검출에 대 한 리소스-저렴 한 방법론은 절실히 필요 질병 진단, 미생물 모니터링, 유전자 변형된 생명체 (GMO) 검출, 그리고 법정 분석입니다. 우리는 이전 진정 (Capillary Array 기반 Loop 중재 등온 증폭 핵 산의 Multiplex 비주얼 검색) 라는 플랫폼을 설명 했습니다. 여기, 우리는 향상 된 제조 및 성능 프로세스가이 플랫폼에 대 한 설명. 여기, 우리는 작은, 준비-사용 카세트 핵 산의 다중 영상 검출을 위한 모 세관 배열에 의해 조립 적용. 모 세관 배열 고정 루프 중재 등온 증폭 (램프) 뇌관 세트 모세 혈관에 전에 미리 소수 성 및 친수성 패턴으로 치료 이다. 로드 어댑터의 조립 후 램프 반응 혼합물은 로드 하 고 각 모 세관, 단일 pipetting 단계에 의해 모 세관 힘 때문에 고립. 램프 반응 모세 혈관에서 병렬로 수행 됩니다. 결과 휴대용 자외선 손전등 조명에 의해 밖으로 시각적으로 읽혀집니다. 이 플랫폼을 사용 하 여, 8 자주 높은 특이성 및 감도 요소와 GMO 샘플에서 유전자 표시의 모니터링 설명 합니다. 요약 하면, 여기에 설명 된 플랫폼 여러 핵 산의 탐지를 촉진 하기 위한 것입니다. 우리는 높은 처리량 핵 산 분석 필요 분야에 광범위 하 게 적용 될 것입니다 믿습니다.
서론
여러 핵 산의 동시 검출을 위한 저가, 빠르고 사용 하기 쉬운 시스템 분야, 임상 진단1,2,3, GMO 검출4, 넓은 범위에서 긴급 하 게 필요 5,6,7,,89, 정밀 분석10,11, 그리고 특히 포인트의 케어 테스트 (POCTs), 어디 모니터링 미생물 자원 일반적으로 제한12,,1314있습니다.
연쇄 반응 (PCR), 실시간 PCR 및 멀티플렉스 PCR 파생 메서드를 포....
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프로토콜
참고: 베어링 원하는 마이크로 채널 및 로딩 어댑터에 대 한 셰이프 스테인리스 형 되었습니다 이미이 프로토콜 가정 (3D 파일 추가 파일 1로 제공 됩니다과 2. ). 이 프로토콜은 또한 그 식물 DNA 분리 이미 실시 되었습니다 가정 합니다.
1. 모 세관 배열 기반 준비-사용 카세트의 제작
- 스테인리스 스틸 금형 청소.
- 잠재적인 오염 물질을 제거 하 세척 세제, 에탄올, 그리고 이온된 수 스테인리스 형
- . 질소에 의해 금형을 건조.
- 착용 안전 고글, 실험실, 균일 하 고 화학 보호 장갑.
- 비 커에 장소 모 세관입니다. 유기 물질을 제거 하 5 분 30 mL 아세톤으로 모세 혈관을 청소 하 고 다음 씻어 이온된 수와 모세 혈관.
주의: 증기 두건에서 아세톤 처리. - 는 H 2 O 2의 10 mL를 비이 커에 부 어 하 고 4와 H 2 O 2로 느린 과열을 방지 하기....
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결과
이 방법에서는, 그것은 샘플 로드 하는 동안 다른 모세 혈관 간의 교차 오염을 방지 하는 것이 중요입니다. 이 개별 모 세관에 뇌관을 유지 수 있는 키토 산 도입 되었다. 그것은 일 또는 하지 여부를 테스트 하려면 우리 미리 고정 ADH1 (옥수수의 유전자 생 참조) 뇌관 "T"와 "U"의 패턴으로 모 세관 카세트에 설정에서 볼 수 있듯이 그림 3a. 예상 대로 포함 된 모세 혈관 뇌관만 설정 보여주는 긍정적인 신호 (그림 3b).
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토론
진정 플랫폼 시연, 여기는 모 세관 배열 램프 기술을 결합, 단일, 매우 효과적이 고 테스트를 운영 하 게 쉬운에서 여러 유전자 GMO 관련 목표의 동시 탐지를 가능 하 게.
카세트에서 다중 램프 반응을 성공적으로 수행 하려면 세 가지 중요 한 포인트 주의 될 필요가 있다. 첫째, 모세 혈관의 상부 및 모 세관 배열의 친수성 및 소수 성 패턴에 대 한 동일한 높이 달성가 동시에 모든 모세 혈관에 시 약을 로드 합니다. 모 세관 로드 어댑터의 접시에 로드 반응 혼합물을 만질 수 있는 초기 PDMS 지원을 그들의 모든 삽입 후 접시에 의해 정렬 되어야 한다. 슈퍼 소수 코트와 모 세관 배열을 대우 할 때 모세 혈관의 안쪽 표면에 담가 외 투를 허용 하지 않습니다. 그냥 코트 PDMS 지원, 모 세관의 상단 부분의 외부 표면에 확산 코팅 수 탑의 위쪽 표면에 로드 하 여 모세 혈관의 외부 표면을 취급 합니다. 경우 그것은 때때로 모든 모세는 시 약으로 가득 차 있습니다, 그것은 특정 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 연구에서 새로운 세기 뛰어난 재능에 대 한 국가 자연 과학 재단의 중국 보조금 (31370813, 3147670, 31670831 및 31600672,), 국립 유전자 변형 식물 특별 기금 (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), 프로그램 부분에 투자 되었다 대학, 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 (2016YFA0500601) 중국과 중국 박사 후 과학 재단 (2016 M 591667).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| UltraEverDry (슈퍼 소수성 코트) | UltraTech | 4001 | 공급 업체:Exiron chemistry (CHINA) CO., LTD. |
| PDMS | 다우코닝 | 8332557 | |
| Bst 중합효소 | New England BioLabs | M0275L | |
| 베타인 | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| 칼세인 | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTP Shanghai | Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 소프트웨어 | Adobe Systems Inc., CA, USA | 이미지 분석 | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | 마이크로어레이 분석 소프트웨어 | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D 건설 소프트웨어 | |
| UV 필터 (ZWB2) | YX스트리밍 | 공급 업체 : taobao |
참고문헌
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton,....
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재인쇄 및 허가
