방법 논문

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

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DOI:

10.3791/56615

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2017년 12월 8일

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1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

이 논문에서

요약

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

초록

중앙 신경 조직, 수많은 급성 부상 및 신경 장애, 뿐만 아니라 이식 장치 또는 생체 같은 결과에서 함수 결과 향상 시키기 위해 설계: gliosis, 세포 독성, 이끌어 과잉 염증 또는 집합적으로 부상 악화 또는 건강 회복을 방해 glial 흉터 대형. 우리가 3 차원 셀 비 계 기본 교양된 glial 세포 수 있는 모델 glial 흉터 대형 그리고 연구 염증 성 프로세스에 시스템을 만드는의 도와 함께 생성: microglia 이물질 응답을 통제 하 고 시작 하는 염증 성 이벤트, 이다 섬유질 흉터 형성에 응답 하는 및 oligodendrocytes 일반적으로 염증 성 손상에 취약. 현재 작업 방법을 제공 한다는 상세한 단계별 제작, 문화, 및 캡슐화 된 쥐와 히 알루 론 산 기반 3D 히드로 발판의 현미경 특성 두뇌 파생 glial 세포를. 또한, 세포 캡슐화 및 confocal 면역 형광 및 전자 현미경을 스캐닝 하 여 하이드로 겔 비의 특성에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다와 생리 활성 기판으로 비 계를 수정 하는 능력 뿐만 아니라 향상 된 셀 통합 상업 기저 lamina 혼합물 설립

서론

중앙 신경 조직 (CNS)의 염증이 오래 고려 되었습니다 급성의 특징 (예:허 혈 성 뇌졸중, 외상 성 뇌, 척수 손상) 및 만성 (예: 알츠하이머병, 파 킨 슨 병의, 그리고 Huntington의 질병) CNS 상해, 하지만 점점 신경 정신병 무질서 하 인과 기여자로 인식 됩니다. 지속 또는 부적 절 한 수 있습니다 신경 상해의 원인과 demyelination (예: 다 발성 경화 증), 염증과 부정적인 영향 (예를 들어, 정신 분열 증, 자폐증) 두뇌 개발 및 기분 상태 (예, 우울증, 불안 양극성 질환). 또한, 새로운 치료 전략을 이식할 수 있는 장치를 사용 하 여 (예., 뇌-컴퓨터 인터페이스1,2,3, 깊은 두뇌 자극4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,,910) 장치 및 CNS에서 결과 사이의 인터페이스에서 예측 가능한 선 동적인 응답을 생성 한 11임 플 란 트 수명에 걸쳐 효능 또는 장치 실패의 손실을 일으킬 수 있는 보호 조직 응답. CNS에 염증은 일반적으로 CNS 조직 감시 및 이물질 응답 (검토12) 장착에 대 한 책임의 거주 면역 세포 기능 microglia에 의해 시작 됩니다. 모욕의 심각도에 따라, microglia 신호 및 모집 추가 부상 사이트 종류 세포. 특히,는 microglia 활성화에 보조 염증 세포 및 양식 부상 사이트13,14를 포함 하는 밀도 보호벽 역할 이다. Microglia 또한 (참조15검토) 면역 침투를 허용 하도록 BBB의 붕괴 귀 착될 수 있다 주변 면역계의 세포에 활동 캐스케이드를 시작할 수 있습니다.

CNS에 이식 하는 장치의 경우 조직을 피해 외국 장치의 지속적인된 존재로 서 장치 삽입 glial 흉터 라고 하는 프로세스를 시작할 수 있습니다. 이 과정에서는 microglia 마이그레이션을 하 고 상해의 사이트에 확산. 그들은 또한 잠재적인 위협을 중화 하 고 모집 추가 glial 세포를 염증 인자의 방출을 시작 합니다. 그 후, 활성화 이다 hypertrophic 되 고 연속 섬유 장벽16이식된 장치를 캡슐화 시작. 염증 신호는 임 플 란 트의 주변에서 신경 프로세스의 철수를 촉진 하는 역할도 하 고 결국 개발 glial 흉터17강화 섬유 아 세포를 신병. Oligodendrocytes, 전도성, 강화 하기 위하여 myelin 신경 세포를 넣는 담당 할 하지이 과정 생존과 먼 셀 플에서 흉터18으로 분할 된다. Glial 흉터 크게 기능과 기록 전극, 특히 이식된 소자의 수명 감소 하 고 궁극적으로 신경 인터페이스19의 기능을 제한 하는 역할.

몇 가지 방법은 생체 적합성 및 CNS20,21,,2223에서 이식 장치 인터페이스 활동 증가 악용 되어 있다. 이러한 신경 인터페이스24의 생체 디자인에 광범위 한 검토를 이용하실 수 있습니다. 가장 눈에 띄는 전략 polyelthyleneglycol (PEG), 공동 glycolic polylactic 산 (PLGA)25, 같은 호환 코팅 전극 주변 또는 강화 폴 리 (에틸렌 등 전도성 폴리머와 전극 포함 dioxythiophene) (PEDOT), polypyrrole (PPy)26,,2728,29,30,31. 생리 활성 코팅 collagens, 히 알루 론 산32,33,34, fibronectins, 등 세포 외 매트릭스에서 파생 하는 ligands를 사용 하 여 신경 조직의 성장에 대 한 단서를 제공 하기 위해 고용 또한 있다 ,35,,3637. 성장 인자 릴리스 시스템을 흉내 낸 자연 세포 분 비 물30,38,39,,4041 이 코팅의 bioactivity 더 탐험 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. 동시에, 일부 연구 그룹 전극 형상, 유연성, 및 구성 장치 및 조직51,52,53 사이 기계적인 불일치 감소을 개장 하기로 ,,5455,,5657. 그러나 이러한 전략 있는 많은 유망 개선 이어질 다음-세대 신경 계면 장치, 장기 호환성에 문제 이며 진행 복잡 하 고 시간이 걸리는 시내 vivo 모델에 의해 방해 받을 수 있습니다. .

동물 모델 기반 접근 실험 처리량을 제한 하 고 전극 생체 적합성 테스트의 비용을 증가 시킬 수 있습니다. 생체 외에서 기존의 세포 배양 기술을 더 비용 효율적인 대안을 제공 하지만 많은 장치 및 조직58사이 상호 작용의 복잡성을 정리 하지를 사용 하 여 접근 한다. 특히, 전극 형상의 모델링 및 기계적 불일치 및 micromotion 장치 오류59 기여 호스트 응답 생성을 생각 영향 문화 제한, 2D 셀을 사용 하 여 표면 코팅의 테스트 , 60.

2 차원 세포 배양과 관련 된 문제를 해결 하려면 신경 세포의 하이드로 겔 문화 개발 되었으며, 다양 한 응용 프로그램, 약리 연구61, 신경 세포 분화62, 질병을 이해 하는 것을 직접 경로63,64또는 다른 세포 유형 모델 셀 마이그레이션, neuroprotection, 또는 모델 조직 microenvironments61층된에 공동 문화. Hydrogels 쉽게 다른 크기로 형성 되 고 형상 기본 또는 불멸 하 게 한 세포 배양의 수많은 종류를 통합할 수 있습니다 매우 공초점 형광 현미경 등 일반적으로 사용 되 기술에 의해 분석을 받을. Glial 흉터 프로세스의 모델을 만들려면, 우리는 최근 개발과 이식된 전극 (그림 1)65glial 응답의 높은 처리량 테스트를 위해 히 알루 론 산 기반된 3 차원 하이드로 겔 시스템 특징. 이 시스템은 여러 가지 이점이 있다: 1) 3 차원 매트릭스 고분자 히 알루 론 산, 생 세포 외 매트릭스 구성;의 구성에서 기본 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes) 캡슐화 2)는 매트릭스 강성 조정 될 수 있다 '' 두뇌 또는 척수 조직;의 기계적 특성을 재현 하 그리고 3) 세포는 빠른 벤치탑 접근 제한 독성 캡슐화 중 녹색 빛으로 photopolymerization를 사용 하 여 매트릭스에 캡슐화 될 수 있습니다. 이 시스템은 생체 내에서 생체 적합성의 주요 기능 수 있습니다: 장치는 하이드로 겔 조직으로, 유사한 방식으로 삽입 되 고 이식된 장치에 세포질 응답은 다양 한 매개 변수65에 대 한 모니터링. 다양 한 구조와 전기 자극 펄스의 하이드로 겔 코팅, 기계 불일치나 장치 포함 됩니다. 이 시스템은 또한 oligodendrocyte 및 자주 존재 하 고 glial 흉터에 채용 관련된 선구자 포함 됩니다. 그들의 손상, 죽음, 그리고 microglia에 의해 식 균 작용은 매우 선 동적인 상해의 지표 그리고 모델 감소 흉터 또는 복구, 그들은 능력을 다시-myelination 뉴런66의 설명.

여기는 합성 및 하이브리드 히 알루 론 산 hydrogels 셀 병합을 개선 하기 위해 상용 지하실 멤브레인 공법으로 결합의 형성 하는 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 기본 교양된 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes)의 설립 및 문화 성장 immunocytochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석을 시연할 예정 이다.

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프로토콜

주 1 Sprague Dawley 쥐 새끼, 잘린에 의해 안락사에서 뇌 조직 추출 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 앨버타의 대학에 의해 승인 되었다.

1. Microglia 및 사이토 격리67,68

참고: 격리 및 세포 배양에 대 한 모든 미디어는 물 욕조에 37 ° c으로 미리 데워 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)는 1% 페니실린-스 (PS). 모든 Dulbecco의 햄의 F12 영양소 혼합 (DMEM/F12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 (PS) 보충은 글의 미디어를 수정 합니다. 트립 신으로 유일한 혼합물 FBS 부족합니다. 이 프로토콜에서 모든 물질이 살 균 (필터, 알코올, 산, 고 압력가) 고 단계 번호 1.8 이후 모든 단계 biosafety 무 균 기법으로 캐비닛에서 수행 됩니다.

  1. 뇌, 당 전 15 mL HBSS의 그리고 12.5 mL 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 37 ° C에 DMEM/F12 약 2 mL 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 0.25 %trypsin 열. DMEM/F12의 추가 25 mL가 열. 효소 활동의 손실을 방지 하기 위해 사용 하 여 따뜻한 트립 신 약 10 분 전에.
  2. 살 균, 6 충분 한 따뜻한 HBSS 붓고와 표면 하 10 cm 문화 요리. 한 10 cm 접시 마다 2 개의 두뇌에 대 한 더하기 추가로 6 cm 접시를 준비 합니다.
  3. 각 10 cm2 접시 (그림 2A)에 최대 2 두뇌를 놓습니다.
  4. 해 부 현미경 아래 곡선 및 직선 겸 자 사용 하 여 뇌 줄기 따라 중간, 그리고 소 뇌 외피가 구분. 이 뇌 (그림 2B) 당 조직의 3 개의 섹션을 생성합니다.
  5. 혈관 조직 및 삭제, 별도 문화 그릇에 남은 조직 전송의 각 섹션에서 포함 된 조직의 얇은, 반투명, 레이어 (meninges) 껍질. 집게와 조직의 상처에 의해 노출 되는 얇은 층을 파악 하 고 주요 부분은 '걸려' 뇌 조직 때까지 조심 스럽게 빼냅니다. 마지막으로 부드럽게 잡아 당 겼 여이 부분을 제거 합니다. 그림 2C참조-2E 전에, 동안, 그리고이 단계 후의 대표 이미지.
  6. Biosafety 내각에서 나머지 HBSS 신중 하 게 유지 하는 조직 문화 접시에서 제거 합니다. 메스와 조직 macerate 하 고 조직을 트립 신으로 미리 데워 15 mL 튜브에 전송.
  7. 조직을 효소 소화 37 ° C 목욕에서 25 분이 튜브를 품 어.
  8. 실 온에서 2 분 동안 500 x g에서 다운 튜브를 원심과 상쾌한 밖으로 붓는 다.
  9. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 조직 헤어 따뜻한 DMEM/F12 비활성화는 트립 신을 triturate 솔루션 5 번의 10 mL를 추가 합니다.
  10. 실 온에서 2 분 동안 500 x g에서 다운 튜브를 원심과 상쾌한 밖으로 붓는 다.
  11. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 다시 따뜻한 DMEM/F12의 10 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 전송.
  12. 18 게이지 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여, triturate 솔루션 3 번.
  13. 따뜻한 DMEM/F12 뇌 당 12.5 mL 씩으로이 솔루션을 배포 합니다.
  14. 12에 triturated 솔루션의 피 펫 1 mL 씩 잘 (뇌 당 1) 접시.
  15. 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 3 일 후, 미디어를 교체 하 고 모든 후속 3 일 미디어를 새로 고침. 2 주 후, 실험에 대 한 셀을 수집할 수 있습니다.

2. Macromer 종합69

  1. 히 알루 론 산 (HA) 소금의 375 mg 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 무게 고 37.5 mL의 증류수를 추가 합니다.
  2. 1 분 동안 vortexer와 함께 솔루션을 플러시 하 고 동질적인 나타납니다의 젤 같은 점도 잃는 때까지 혼합물을 sonicate. 이 프로세스는 6 h를 걸릴 수 있습니다.
  3. 자기와 함께 100 mL 비 커에 전송 솔루션 (38mm), 바 저 어 하 고 실 온에서 적극적으로 저 어.
  4. 8과 12 사이 pH 안정화 될 때까지 신중 하 게 혼합 하 고 pH 종이 측정으로 5.0 M NaOH 적정.
  5. 보관 시 질소 blanketed 신선한 酸 무수 물 (MA, 94%)의 3 mL를 수집 합니다.
    참고: MA 긴 기간에 대 한 분위기에 노출은 (일), 그것은 그것의 반응성을 잃을 것 이다.
    주의: 엄마의 모든 사용 증기 두건에서 이루어져야 합니다.
  6. 혼합 HA 솔루션으로 엄마의 200 µ L를 추가 합니다. 반응 8 아래 솔루션의 pH를 낮춘 다.
  7. 2.4 2.6 단계를 반복 하 여 엄마의 3 mL 솔루션에 추가 되었습니다. 이 과정은 1-2 h까지 걸릴 수 있습니다.
  8. 반응 혼합 하지 않고 4 ° C에서 밤새 계속 허용 합니다.
  9. 400 ml 500 mL 비 커에 찬 에탄올 (EtOH)의 솔루션을 전송 및 4 ° c.에 24-72 h에 대 한 강 수를 허용 56
  10. 신중 하 게 처리, 별도 비 커에는 솔루션의 주요 부분을 가만히 따르다을 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 침전을 수집 합니다. 이 필요한 경우 2-4 튜브에 배포할 수 있습니다.
  11. 실내 온도 상쾌한의 dispose에서 2 분 동안 원심 분리기에서 200 x g에서 튜브 원심
  12. 차가운 EtOH와 튜브 top 가기 하 고 1 분 동안 vortexer 솔루션 혼합 단계 2.10 2.11 반복.
  13. 살 균 이온된 물 25 mL를 추가, 1 분 동안 vortexer 솔루션 혼합, sonicate (> 20 kHz) 1 시간, 및 4 ° C에서 밤새 품 어.
  14. 15 분 또는 때까지 동결-80 ° C 냉동 고에서 솔루션 배치 또는 플래시 동결에 액체 질소.
    주의: 액체 질소를 사용할 경우 사용 하 여 보호 장갑, 얼굴 방패, 및 앞치마.
  15. 동결 건조 24-48 시간 (아래 0.1 mBar-30 ° C) 튜브 눈 모양의 분말 생산 될 때까지.
  16. 이 시점에서 1H 핵 자기 공명, HA 등뼈에 메타 크 릴 산 양성자 (6.1 및 5.6 ppm에서 봉우리) 메 틸 양성자 (1.9 p p m), 기준의 금액을 확인할 수 있습니다 통해 순도 대 한 샘플 테스트. 95% 메타 크 릴 산 메 틸 양성자에의 최소 비율 허용 됩니다. 69

3. 젤 형성 및 3D 캡슐화65

  1. Coverslip 및 금형 준비
    1. 2%의 증류수 50 mL 물 솔루션 3-(Trimethoxysilyl) 틸 메타 크 릴 산 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서.
    2. 18 m m 유리 coverslips를 솔루션 및 실 온에서 1 h에 대 한 바위에 놓습니다. 50 coverslips까지 한 번에 추가할 수 있습니다.
    3. Coverslips 직렬 3 비 커 100ml 이온된 물에 각각 담거 서 린스.
    4. 40 ° C 하룻밤 desiccator와 오븐에서 진공 상태에서 coverslips를 건조.
    5. 신속 하 게 담가 70%에서 개별 coverslips EtOH 집게와.
    6. 건조 하지 않고 12 잘 접시의 우물에 각 coverslip 드롭.
    7. 세척 하 고 살 균 이온된 수 (우물 당 1 mL)으로 각 잘 발음.
    8. 각 잘을 1 mL의 멸 균 2 µ g /mL 폴 리-L-리 신 (PLL)를 추가 하 고 위해 품 어 > 2 h.
    9. PLL 솔루션을 발음 하 고 건조 공기를 coverslips 있습니다.
    10. Polydimethyl 실록 산 (PDMS) 형 ( 그림 1참조) 70 %EtOH, 및 각 coverslip의 센터에 장소 하나에 담가 건조 공기를 허용 하 고 형과 유리 사이 물개를 만들.
      1. 폴리스 티 렌 접시 바닥에 10:1 비율에서 PDMS 섞은 약을 캐스팅 하 여 PDMS 몰드를 준비 합니다. 준비 된 PDMS의 수량 약 1 m m 두꺼운 시트를 선택 합니다. 10의 내부 직경을 가진 원형 펀치와 함께 시트를 잘라 PDMS에의 모양 우물을
  2. 세포 준비
    참고: 프로토콜에서 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 무 균 기법으로 수행 됩니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)은 모든 단계에 대 한 pH 7.4에 조정 된다.
    1. 하 마에 셀 캡슐화 하기 전에 24 시간 12 잘 플레이트에 (에서 단계 1.15) 2 주 기본 문화권에 대 한 매체를 새로 고칩니다. DMEM/F12의 1 mL을 추가 (10 %FBS 1 %PS) 잘 당 중간.
    2. 셀의 각 12-잘 접시 준비의 희석 trypsin (0.25% trypsin EDTA 희석 30 %DMEM / F12 미디어), 12.5 mL 25 mL DMEM/F12 (10 %FBS 1 %PS)에 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에서.
    3. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫 (> 0.5 mL 잘 당)를 사용 하 여 격판덮개에서 조절된 매체를 수집, 철저 하 게 남은 액체, 발음 및까지 희석 트립 신 (0.075% 트립 신-EDTA) (37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에서 20-30 분의 당 1 mL를 바꿉니다 confluent 셀 레이어 접시에서 분리합니다.
    4. 1 mL 피 펫 (단일 부동 조각으로 표시)와 정지 셀 자료를 복구 하 고 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 수집 합니다. DMEM/f 12의 동등한 양으로 희석 (10 %FBS 1 %PS), 그리고 삭제는 상쾌한 실내 온도에 2 분 동안 200 x g에서 원심 분리기.
    5. Resuspend 셀 펠 릿 10 ml에서 따뜻한 DMEM/F12 (10 %FBS 1 %PS), triturate 셀 10 mL 피 펫을 5 번 하 고 2 분 200 x g에서 원심.
    6. 상쾌한 가만히 따르다, 다시 5 mL에 셀 중단 DMEM/F12, 따뜻하고 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포를 전송.
    7. 18 게이지 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여, triturate 셀 솔루션 3 번 하 고 새로운 원뿔 원심 분리기 튜브로 40 µ m 세포 체를 통해 정지를 필터링 합니다.
    8. 세포 현 탁 액의 10 µ L를 수집, 따뜻한 DMEM/F12, 및 자동화 된 셀 카운터 카운트 셀에서 1: 100 희석
    9. 캡슐화 단계까지 37 ° C 물 욕조에 품 어.
  3. 셀 캡슐화
    참고: 프로토콜에서 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 무 균 기법으로 수행 됩니다.
    1. 3D의 각 12-잘 접시 hydrogels DMEM/F12의 12.5 mL 및 셀 준비 하는 동안 수집 된 바른된 DMEM/F12 미디어의 12.5 mL 따뜻한.
    2. Methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 최종 농도 0.5 %wt / vol.의 분해 (2 %wt / vol);의 농도에서 살 균 필터링 된 PBS에이 마에 필요한 양의 무게 최종 농도 보다 4 배 높은 농도 세포 및 다른 시 약의 추가 수용 하기 위하여 이용 된다. 한 12 잘 접시 hydrogels 필요 7 mg 하 마와 ~ 350 µ L PBS.
    3. Sonicate (> 20 kHz) 솔루션 하 마 60 분 동안 완전히 해산 될 때까지.
    4. Triethanolamine (차) 및 1-비닐-2-pyrrolidinone (NVP), 개별 10% 솔루션 및 살 균 PBS pH 7.4의 1 mL aliquots에서 1 m m 솔루션 오신 Y (EY)의 준비.
    5. 한 12 음 접시에 대 한 확인 1 x 10의 최종 1.4 mL 혼합7 셀, 0.5 %wt / 집 하 마 (2 %wt / 집의 350 µ L), 0.1% 차 (10%의 14 µ L), 0.1 %NVP (10%의 14 µ L), 0.01 m m EY (1 m m의 14 µ L) 그리고 20% 기저 lamina 혼합물 (재고의 280 µ L). 나머지 볼륨은 PBS.
    6. 부드럽게 솔루션을 혼합 하 고 1 mL 팁 각 PDMS 몰드로 100 µ L를 플라스틱.
    7. 샘플 높은 강도 녹색 LED 빛에 노출 (~ 520 nm, 60 mW는 동봉 된 20 cm x 20 cm x 20 cm 상자에에서) 실 온에서 5 분.
    8. 12 잘 접시에 따뜻한 조건된 DMEM/F12의 당 1 mL를 추가 합니다.
    9. 각 coverslip 엄지와 검지로 잡고, 천천히 젤, 치환 하지 않도록 주의 되 고 곡선된 핀셋으로 PDMS 몰드를 벗기다 고 그것 조절된 매체와 잘 합니다.
    10. 추가 1 mL을 추가 각 잘 DMEM/F12 따뜻한.
    11. 2 주 동안, 각 우물에서 미디어의 pipetting 1 mL에 의해 매주 셀 미디어를 상쾌하 고 1 mL DMEM/F12 교체 5% CO2 와 37 ° C에서 접시를 품 어.

4입니다. 현미경

  1. Immunocytochemistry
    참고: 거꾸로 confocal 현미경이이 샘플 이미지를 사용 했다 고 ImageJ 처리 하 고 이미지를 표시 하는 데 사용 되었다. Microglia, 이다, oligodendrocytes, 및 핵, 3 주 후에 하 마 문화 표시 됩니다.
    1. 10 %PBS 버퍼링 포 르 말린 (pH 7.0) 37 ° C 욕조에 예 열.
      주의: 포 르 말린 증기 두건 밖에 서 사용할 수 있습니다, 하지만이 자료는 조직와 반응 이며 항상 관심과 장갑 처리 되어야 합니다. 그것은 별도로 삭제 해야 합니다.
    2. 신중 하 게 각 우물에 접시와 피 펫 10% 포 르 말린의 1 mL에서 미디어 발음.
    3. 5% CO2 20 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
    4. 각 접시에서 액체를 발음 하 고, 플라스틱 2 mL PBS (pH 7.4)의 각 음에 15 분 동안 품 어.
    5. 4.1.4 단계를 두 번 반복 합니다.
    6. 접시에서 액체를 발음, 10% 정상 말 혈 청 (NHS)와 0.5% 트라이 톤 X-100, PBS의 잘 당 1 mL을 추가 하 고 최소 속도로 부드럽게 바위) 1 시간에 대 한.
    7. 4.1.4 단계를 세 번 반복 합니다.
    8. 액체를 발음 하 고 PBS에 다음 혼합물의 당 1 mL을 추가: 토끼 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 (Iba1) 1:1, 000, 닭고기 glial fibrillary 단백질 (GFAP) 1:5, 000, 마우스 2', 3'-주기적-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% 보 건국 0.1% 세포 꿰 뚫는 계면 활성 제. 품 어 4 ° C에서 하룻밤, 접시를 최대한 부드럽게 락.
    9. 사이 세 번 1 h 외피와 4.1.4 단계를 반복 합니다.
    10. 액체를 발음 하 고 PBS에 다음 혼합물의 당 1 mL을 추가: 647 nm 흥분 당나귀 안티 토끼 항 체 1: 200, 546 nm 흥분 염소 안티 닭 항 체 1: 200, 488 nm 흥분 당나귀 반대로 마우스 항 체 1: 200, 1% 보 건국, 1:1,000 파란 핵 얼룩. 부드럽게 접시 락 1 시간 실 온에서 품 어.
    11. 사이 세 번 1 h 외피와 4 단계를 반복 합니다.
    12. 유지는 hydrogels, 버퍼, 발음 하 고 설치 중간에 밖으로 1 분 피 펫에 대 한 셀 장착 매체의 0.5 mL에 그들을 담가 부드럽게 유리 사이의 계층 젤 위에 coverslip 장소. 하이드로 겔의 건조를 방지 하기 위해 coverslips의 발견된 측에 장착 매체의 작은 금액을 추가 합니다.
      참고: 문제 해결을 위해, 젤 수 수 몇 군데 단계 4.1.11에. 더 처리 하기 전에 적절 한 라벨을 참조 하십시오.
  2. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)
    참고: 시각화는 히드로, 스캐닝 전자 현미경이이 샘플 이미지를 사용 되었다.
    1. 전 2.5%도 및 2% paraformaldehyde PBS (0.1 M)에서 37 ° C 물 목욕에서 통 혼합 열.
      주의:이 시 약 조직, 반응성이 매우 높은 이며 진료와 장갑 처리 합니다. 그들은 가능한 한 많이 연기 후드에 처리 한다 고 별도로 삭제.
    2. 세포 배양 배지에서 매체를 발음 하 고 미리가 열된 통 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 5% CO2 20 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
    4. 4 ° C (냉장고/쿨러)에 하룻밤 접시를 놓습니다.
    5. 우물에서 통 솔루션을 발음 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
    6. 각 접시에서 액체를 발음, 각 음에 PBS의 2 개 mL를 추가 하 고 15 분 동안 품 어.
    7. 단계 4.2.6 두 번 더 반복 합니다.
    8. PBS를 발음 하 고 1% 오스뮴 tetraoxide 각 우물에 PBS에 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
      참고: 샘플, 건조 될 때까지 모든 후속 단계 및이 단계에서에서 수행 됩니다 증기 두건.
    9. 액체에서 30 분 오스뮴 증기 같은 접시;에 다른 샘플을 수정할 수 있습니다에 대 한 발생 하는 고정 허용 따라서, 그에 따라 샘플을 분할 하기 전에이 단계.
      주의: 오스뮴 tetraoxide 높은 조직으로 반응 하 고 휘발성 이다. 그것은 위험 하며 장갑과 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 그것은 및 즉시 세척 되어야 disposed 별도로.
    10. 4.2.6 단계를 세 번 반복 합니다.
    11. 액체를 발음 탈수 혼합물 순서 대로 아래 목록에 추가 하 고 지정 된 시간에 대 한 (실내 온도)를 품 어. 에탄올 (EtOH) hexamethyldisilazane (HMDS) 다음 다음 점차적으로 추가 하 여 시작 합니다. 각 증분에 표 2 를 참조 하십시오.
      참고: HMDS를 추가 하는 경우는 coverslips 고 수 있습니다 강력 하 게 플라스틱을 제거 하기 매우 어려운 될. 이 후 HMDS의 첫 번째 응용 프로그램 유리 슬립 아래 작은 플라스틱 플랫폼을 배치 하 여 방지할 수 있습니다. 두 번째 EtOH 부 화 후 샘플 촬영 고 액체 질소 동결 골절 샘플 몇 초 동안 침묵 될 수 있습니다.
    12. 조심 스럽게 말린된 샘플을 제거 하 고 이중 양면된 전도성 테이프와 스캐닝 전자 현미경 명세서에 샘플을 탑재.
    13. 스퍼터 코트 최소한 골드의 샘플. 홀더 샘플 놓고 15 시 2 분에 대 한 기계 작동 mA.

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결과

신경 조직 호스트 응답 및 높은 처리량 glial 흉터를, 에서 시험관 시스템 생체, 원래의 장소에 형성 하는 동안 세포 독성 이벤트를 초래 하지 않습니다 이며 대 행렬 자료와 3D 셀 비 계 필요 로 자비로 운 응답 가이드 bioactive 구성 요소. 이 위해, 우리 히 알루 론 산에 따라 3D 셀 발판 시스템 하 고 캡슐화 기본 혼합된 glial 세포 인구 세포 세포 상호 작용 및 glial bioreactivity 공부 하. 세포와 발판의 간단한 시각적 연구 수행 되었다. Oligodendrocytes (CNPase 녹색에)를 포함 하 여 셀 부분 모집단의 형태 microglia 빨간색에서 (Iba1), 이다 (노란색에서 GFAP), confocal immunofluorescent 현미경 검사 법 (그림 3Ai-ii-Ci-ii)에 의해 표시 됩니다....

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토론

모델 glial bioreactivity 3 차원 문화 시스템 및 glial 흉터 프로세스 생성의 목표를 향해 우리 셀의 강력한 묘사를 가능 하 게 이다 및 oligodendrocytes 기본 교양된 microglia를 지원할 수 있는 시스템을 개발 했습니다. 형태학 및 세포 세포 상호 작용입니다. 표시 하는 현미경 사진에서 각 셀 형식의 형태학이 달랐다 분명히 2D, 3D-하 마, 그리고 3D 하 마 기저 lamina 혼합 플랫폼. 2D 시스템에서의 표면, 평면 형태 치우친 분명히 있었으나 3D 하 마에 비해 microglia 및 이다 oligodendrocyte 클러스터 제외한 매트릭스 안에 일반적으로 더 작은. 스캐닝 전자 현미경에서 세포 했다 일반적으로 더는 하 마에 둥근 모양. 이것은 크게 운동 및 자유로운 이동 및 프로세스의 성장에 대 한 행렬을 수정 하려면 제한 된 용량으로 캡슐화 되 고 셀 원인일 수 있습니다. 하 마에서 셀 파생물 이다와 oligodendrocytes에 대 한 일반적으로 레이디얼 이었다. 이러한 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 NSERC, CFI, AIHS, 알버타 헬스 서비스, 그리고 뇌 연구를 위한 비 기부금에서 재정 지원에 대 한 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>1. HAMA 합성 및 광중합을 위한 재료
히알루론산(HA)시그마-알드리치53747-10G스트렙토코커스 equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
메타크릴 무수물(MA)시그마-알드리치275585-100ML
수산화나트륨(NaOH)시그마-알드리치221465-25G
에탄올(EtOH)상업용 알코올 주식회사무수
인산염 완충 식염수(pH 7.4) 정제Fisher Scientific18912014
트리에탄올아민(TEA)시그마-알드리치90279-100ML
1-비닐-2피롤리디논(NVP)시그마-알드리치V3409-5G
EosinY(EY)시그마-알드리치E6003-25G
폴리디메틸실록산(PDMS) 실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트다우 코닝
3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필 메타 크릴 레이트시그마 - 알드리치440159-100ML
비커 (100mL)코닝1000-100
비커 (500mL)코닝1000-600
pH 종이 (Labstick)시그마 알드리치9580
< strong>Name< / strong>< strong>Company카탈로그 번호코멘트
2. 신경교세포 분리 및 세포 배양을 위한 재료
P1-2 Sprague Dawley 쥐 새끼Charles RiverCD Sprague Dawley 쥐 변형 코드 001
해부 가위 - 슬림 블레이드(소형)Fine Science Tools14081-09
수술용 가위 - Toughcut(대)Fine Science Tools14130-17
미세 집게(Dumont #5)Fine Science Tools11521-10
곡선형 미세집게(Dumont #7)Fine Science Tools11271-30
Hank's Balanced Salt solution (HBSS)Gibco14170-112
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Penicillin-streptomycin (PS)Gibco15140-122
소 태아 혈청(FBS)Gibco12483-020
0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Gibco25200-072
폴리-L-라이신(PLL)Sigma-AldrichP-6282
50mL 코니컬 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-539-13
15mL 코니컬 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-539-5
12웰 조직 배양 처리 플레이트(Cellstar)Greiner Bio-One665 108
10 mL 혈청학 피펫Fisher Scientific13-676-10F
25 mL 혈청학 피Fisher Scientific12-676-10K
페트리 접시 (60 mm X 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
페트리 접시 ( 100 mm X 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
현미경 커버슬립 (18 mm)Fisher Scientific12-545-100 18CIR
NameCompany카탈로그 번호Comments
3. 현미경 (공초점 및 주사 전자 현미경) 용 재료 < / strong>
Mouse monoclonal anti-CNPaseabcamab6319
Rabbit anti-Iba1Wako Laboratory Chemicals019-17741
Chicken anti-GFAPabcamab4674
Hoechst 33342Fisher Scientific62249
Fluoromount-GFisher Scientific00-4958-02
포르말린시그마 알드리치HT501128-4L완충 (10%)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
호스 세럼Gibco16050-122
파라포름알데히드Electon Microscopy Sciences157-8완충(8%)
구테알데히드Electon Microscopy Sciences16019버퍼링(8%)
사산화오스뮴Electon Microscopy Sciences19152버퍼(2%)
헥사메틸딜라잔(HMDS)Electon Microscopy Sciences16700
에탄올(EtOH)Electon Microscopy Sciences15055무수
현미경 슬라이드(25 X 75 X 1mm)VWR International48311-703
펫

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