방법 논문

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

DOI:

10.3791/56616

⸱

2018년 3월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Translationszentrum Würzburg 'Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankung', Institutsteil Würzburg, 2Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Universitätsklinikum Würzburg, 3Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg, 4Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg

이 논문에서

요약

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생체 재료 뼈 Morphogenetic 단백질 2 (BMP2) 실수로 비-연합 뼈 골절을 치유 하 새로운 치료 전략으로 사용 되었습니다. 요인의 통제 자료에서 발생 하는 부작용을 극복 하기 위해 제안 하는 사이트를 새로운 전략-직접 따라서 향상 된 osteogenic 기능으로 자료를 만드는 요소를 고정.

초록

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긴 뼈 결함 치료 비의 치료에 대 한 다른 치료 전략 집중적으로 조사 했습니다. 현재 치료 현재 뼈 morphogenetic 단백질 (BMPs) 같은 osteogenic 성장 인자와 함께에서 생체 재료의 사용에 지도 하는 몇 가지 제한이 사용 됩니다. 일반적으로 사용 되는 흡수 또는 캡슐화 방법 위에 생리 양의 BMP2, 소위 초기 버스트 출시 효과 몇 가지 심각한 부작용을 불러 일으키에 결과 일반적으로 필요 합니다. 이러한 문제를 극복 하는 전략 covalently 발판 단백질을 결합 하는 것입니다. 또한, 커플링 재현할 수 제품 결과 보장 하기 위해 특정 방식으로 수행 되어야 한다. 따라서, 우리는 인공 아미노산 (propargyl-L-리 신) codon 사용법 확장 (BMP2-K3Plk)에 의해 BMP2 단백질의 성숙한 부분에 도입 되었다 BMP2 변종을 만들었습니다. BMP2 K3Plk 기능성된 비즈 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition (CuAAC)을 통해 결합 했다. 결합 된 BMP2 K3Plk의 생물 학적 활동 생체 외에서 입증 되었다 고 BMP2-K3Plk-기능성된 구슬의 osteogenic 활동 세포 기반 분석 실험에서 입증 되었다. C2C12 셀 접촉 기능성된 비즈 구슬의 로컬 제한에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 식을 유도 할 수 있었다. 따라서,이 기술에 의해 공업화 건설 기계 생산 될 수 있는 osteogenic 혈통으로 세포 분화를 일으킬 수 있다. 또한, 더 낮은 BMP2 복용량 결합된 BMP2 사이트 감독의 제어 방향 때문에 충분 한 있습니다. 이 방법으로, Bmp는 항상 사실이 아닌 사이트 감독 비 커플링 기술을 통해 요소를 결합 하는 경우 적절 한 방향으로 세포 표면에 그들의 수용 체에 노출 됩니다. 제품 결과 매우 제어 하 고, 따라서, 중요 한 크기의 복구에 대 한 그들의 적응성 향상 균질 속성 자료에 결과 뼈 결함.

서론

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뼈 조직 공학 및 뼈 재생의 궁극적인 목표는 단점 및 비-연합 골절의 일반적인 치료 중 발생 하는 한계를 극복 하는. 비록 그들은 둘 다 몇 가지 단점이 자동 또는 알 로스 간이식 주로 현재 치료 전략으로 사용 됩니다. 이상적인 골 이식 한다 osteoinduction 뼈에는 이식의 osteointegration에 지도 하는 osteoconduction에 의해 골을 유도 하 고 있다. 요즘만 자동 이식 이후 이상적인 뼈 이식의 모든 특성을 제공 하는 그것은 "금 표준"으로 간주 됩니다. 불행히도, 그것은 또한 긴 수술 시간, 그리고 일반적으로 더 많은 합병증 (예를 들어, 만성 통증, 혈 종 형성, 감염, 화장품 결함, 등)을 수반 하는 두 번째 외상 사이트 같은 중요 한 부정적인 측면을 선물 한다. Allogenic 이식, 다른 한편으로 모든 일반적인 측면1차선 특성 있다. 대체 뼈 이식 기술은 지난 몇 년 동안, osteoinductive, osteoconductive, 생체, 그리고 bioresorbable는 건설 기계를 생산 하는 목적으로 개선 되었습니다. 때문에 많은 바이오 이러한 osteogenic 특성 모두 표시 되지 않습니다, 다른 성장 인자, 주로 BMP2, BMP7, 특정 비 계2의 osteogenic 잠재력을 향상 시키기 위해 통합 되었습니다.

필수 조건으로 같은 성장 인자 전달 시스템 셀 모집 및 첨부 파일, 셀 ingrowth와 신생 같은 필수 이벤트를 촉진 하기 위해 시간이 지남에 제어 복용량 릴리스를 제공 해야 합니다. 그러나, BMPs 뿐만 아니라 다른 osteogenic 성장 요인 되었습니다 일반적으로 움직일 수 비 covalently3. 함정 및 흡착 기술 위에 생리 양의 심각한 단점 vivo에서, 일반적으로 자라 난 뼈를 유도 하 여 주변 조직에 영향을 미치는에 이르게 한 초기 버스트 출시로 인해 단백질의 사용을 필요로 osteolysis와 염증, 붓기,4. 따라서, 오랜 시간에 대 한 배달 사이트에 성장 요인의 보존 화학식 동원 정지 방법으로 얻을 수 있습니다. 화학적 BMP2 수정 (succinylated5, acetylated6 또는 biotinylated7), heterodimers8, 설계 또는 BMP2 파생된 펩타이드9 설계 하 고 한계를 극복 하는 데 사용 된 관련 흡수입니다. 그러나, 배치는 잠재적으로 세포질 수용 체에 고정된 ligand의 바인딩 억제 때문에 이러한 구문 중 바이오 활동 예측 되지 않습니다. 와 같이 이전에, 모든 4 개의 수용 체 체인 수용 체 ligand-활성화 단지의 형성에 관련 된 모든 다운스트림 신호 폭포10를 완전히 활성화 하려면 고정된 BMP2 상호 작용 필수적 이다.

Bioactivity, 안정성, 및 고정된 요인의 bioavailability 한계와 휘도가 제품 결과의 문제를 극복 하기 위해 우리는 BMP 이체를 covalently 사이트 이동 방식으로 건설 기계를 바인딩 할 수 설계 되었습니다. BMP2-K3Plk, 불리는이 변형 유전자 codon 확장11에 의해 도입 된 인공 아미노산으로 구성 됩니다. 이 이체의 생물 활성을 유지 하면서 공유 결합 전략을 사용 하 여 건설 기계에 성공적으로 연결 되었습니다.

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프로토콜

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1. 생산의 BMP2 변형 BMP2-K3Plk

  1. 복제의 BMP2-K3Plk 사이트 감독 mutagenesis PCR를 사용 하 여 12
    1. 인간의 성숙 BMP2 증폭 (hmBMP2) p25N hmBMP2 벡터에서 ( 재료의 표참조) 앞으로 뇌관 (5' 3' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC) 및 역방향 뇌관 (5' 3' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT) 황색 정지 codon (소개 태그) BMP2´s 성숙 부분의 첫 번째 신의 위치에. H2O, 10 µ L의 PCR 반응 혼합 33.5 µ L, 10 µ M dNTP 재고 솔루션의 1.5 µ L, 앞으로 뇌관 (10 pmol / µ L), 역방향 뇌관 (10 pmol / µ L), p25N-hmBMP2 (10 ng / µ L)의 1 µ L의 1.5 µ L의 1.5 µ L를 사용 하 여 PCR 반응을 수행합니다 그리고 DNA 중 합 효소의 1 µ L ( 재료의 표참조)에 열 cycler (변성 5 분 동안 95 ° C에서 1 분, 1 분, 1 분에 72 ° C에서 신장 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장에 대 한 60 ° C에서 어 닐 링 동안 95 ° C에서 변성의 30 주기).
    2. 제조 업체의 권장 사항에 따라 상용 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 ( 재료의 표참조).
    3. H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 45 분 동안 37 ° C에서 제한 효소 NdeI PCR 제품을 소화 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 열-비활성화 65 ° C에서 효소 5 분 다이제스트 1 h H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 37 ° C에서 제한 효소 BamHI로 PCR 제품을 위한 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 5 분 동안 80 ° C에서 열 비활성화 효소
    4. H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 2 h 45 분 동안 37 ° C에서 NdeI와 pET11a-pyrtRNA 벡터를 소화 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 열-비활성화 65 ° C에서 5 분 다이제스트 1 h H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 37 ° C에서 BamHI로 pET11a pyrtRNA 벡터에 대 한 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 5 분 동안 80 ° C에서 열 비활성화.
    5. 소화 되지 않은 벡터에서 소화 벡터를 분리 하 고 소화 잔재 여 agarose 젤 전기 이동 법 (0.8 %agarose, 100 V에서 60 분). 2 h 100을 사용 하 여 실 온 (RT)에서 소화 pET11a pyrtRNA 등뼈와 소화 BMP2 K3TAG 삽입을 위하여 pET11a pyrtRNA 백본 및 34.5의 ng ng의 BMP2 K3TAG 삽입 (어 금 니 비율 1:3). 반응 혼합물 DNA 등뼈 및 삽입, 리가 버퍼의 2 µ L, DNA 리가, 그리고 H2O 20 µ L의 총 볼륨의 1 µ L를 포함 한다.
    6. BL21(DE3) 박테리아에 pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 및 pSRF-듀엣-pyrtRNAsynth의 공동 변화를 수행:
      1. 50 추가 30 분 동안 얼음 50 42 ° C에서 열 충격에 혼합물을 배치 하는 각 플라스 미드는 박테리아의 ng s, 5 분 동안 얼음에, 혼합물, Lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L을 추가 하 고 60 분 동안 300 rpm에서 흔들어.
      2. 미리 데워 진된 대 (50 µ g/mL)에 세균성 혼합물의 100 µ L를 확산 / 암 피 실린 (100 µ g/mL) 접시, 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
  2. 표현과 BMP2 K3Plk의 정화 13 , 14
    1. 50 µ g/mL 대와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c.에 파운드 매체의 50 mL에서 하룻밤 단일 식민지를 전파
    2. 야간 문화 1시 20분 대의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린, 보완 하는 훌륭한 국물 (TB) 매체의 800 mL로 희석 하 고 0.7의600 세이 때까지 37 ° C에서 성장 한다. 10 m m의 최종 농도를 propargyl-L-리 신을 추가 합니다. 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도 전에 문화에서 100 µ L 샘플을 수집 합니다.
    3. 1 m m의 최종 농도에 IPTG의 추가 의해 유전자 발현을 유도. 180 rpm에서 궤도 통에 16 h 37 ° C에서 문화를 성장. 문화에서 100 µ L의 샘플을 수집 합니다.
    4. 원심에서 9000 x g 30 분 삭제에 대 한 전체 문화 상쾌한, 그리고 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (갓 추가)와: TBSE 버퍼 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA))의 30 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.
      주의: 연기 후드 2-mercaptoethanol을 처리 합니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 증기 나 미스 트의 흡입을 하지 마십시오. 2-mercaptoethanol 연기 후드를 포함 하는 버퍼와 물의 resuspension의 모든 단계를 수행 합니다.
    5. 무게는 빈 원심 분리기 비 커와 빈 비 커에 resuspended 펠 릿을 전송. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿으로 비 커를 무게. 펠 릿의 무게를 계산 하려면 빈 비 커의 무게를 뺍니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 짧은 기간에-20 ° C에 또는 긴 기간에서-80 ° C에서 펠 릿을 고정 합니다. 프로토콜을 다시 시작 시 실시간에 펠 릿을 녹여
    6. STE 버퍼 (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 375 mM 자당, 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (갓 추가))에 펠 릿을 resuspend. STE 버퍼의 200 mL를 사용 하 여 펠 릿의 모든 10 g에 대 한.
    7. 얼음 (10 분 40 s 펄스, 20 s 브레이크, 및 30% 진폭)에 정지 sonicate 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게. 4 번 쥡니다 및 원심 분리 단계를 반복 합니다.
    8. TBS 버퍼 (10 mM Tris, 150 mM NaCl) 100 mL에 펠 릿을 resuspend. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.
    9. 갓 추가 80 U/mL nuclease (예, Benzonase)와 nuclease 버퍼 (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 m m MgCl2) 펠 릿 resuspend 펠 릿의 10 mL/g를 사용 하 여. 교 반 접시 (30 rpm)에 실시간에 하룻밤 정지를 품 어.
    10. 트리톤 버퍼 추가 (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜) 정지에. 트리톤 버퍼 추가 현 탁 액의 0.5 볼륨 부분에 해당 합니다. RT (교 반)에서 10 분 동안 품 어. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.
    11. 펠 릿 테 버퍼 (100 mM Tris, 20 mM EDTA)에 resuspend 8 mL/g의 펠 릿을 사용 하 여. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.
    12. 4 mL/g 25 m m NaAc pH 5.0의 1 m m dithiothreitol (DTT) (갓 추가)와 6 M GuCl의의 5 mL/g을 추가 하 여 펠 릿을 resuspend. 교 반 접시 (30 rpm)에 4 ° C에서 하룻밤 정지를 품 어.
    13. 20 분 동안 75500 x g에서 원심. 상쾌한 펼친된 단위체 BMP2 단백질을 이제 포함 되어 있습니다. 상쾌한 고 집중 하는 집중에 3 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 멤브레인을 사용 하 여 20 세/mL에 추출이 물이 세포 ( 재료의 표참조)를 수집 합니다.
    14. (30 rpm)를 교 반 하면서 Renaturation 버퍼 (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25mm 균열, 5 mM EDTA, 1mm 티 아 황산 (GSSG) 2 m m 티 (GSH))를 단일 상품에 집중된 단위체 추가 합니다. 어둠 속에서 120 h RT에서 품 어.
      참고: 동안이 부 화 기간, refolding occours. 앞으로이 단계에서 솔루션에는 접힌된 dimeric BMP2-K3Plk 포함 되어 있습니다.
    15. 3.0 집중 셀에 10 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 멤브레인을 사용 하 여 dialyzed 솔루션 집중된 HCl. Dialyze 1 m HCl 집중 m에 대 한 솔루션을 사용 하 여 솔루션의 pH를 조정 합니다.
    16. 버퍼는 (20 m m NaAc, 30% 소 프로 파 놀)을 추가 하 여 솔루션을 equilibrate. 버퍼 A 해당 하는 솔루션의 30% 볼륨의 볼륨을 추가 합니다. 4700 x g 15 분에서 솔루션 원심
    17. 이온 교환 버퍼 A. 부하 equilibrated 열에 단백질 해결책의 150 mL와 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템15 에 대 한 열 equilibrate (20 m m NaAc, 30% 소 프로 파 놀, 2 M NaCl) 버퍼 B의 선형 그라디언트를 사용 하 여 분수 elute 버퍼 B. 수집 2 mL 분수의 100 mL를 사용 하 여.
      참고: 총 열 량에 따라 열에 로드 하기 전에 단백질을 집중 한다. 최종 단백질 볼륨 이어야 한다 < 총 열 량의 5%.
    18. SDS Polyacrylamide 젤 (12%) 전기 영동 (SDS-PAGE) 16 및 Coomassie 화려한 블루 얼룩17 ( 재료의 표참조)에 의해 각 분수의 20 µ L를 분석 합니다.
      참고: SDS 페이지 젤 쇼 분수 이합체 (26 kDa)와 포함 하는 단위체 (13 kDa) 분수를 포함 하는 Coomassie 화려한 블루 스테인드.
    19. 포함 하는 이합체 분수 풀. 1mm HCl (5 리터 볼륨)에 대 한 4 ° C에서 하룻밤 분수를 포함 하는 이합체의 풀 dialyze 10 kDa 원심 필터 단위 집중을 사용 하 여 최종 제품을 집중 ( 재료의 표참조). (12%) SDS Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 Coomassie 화려한 블루 얼룩에 의해 최종 제품을 분석.
      참고: Coomassie 화려한 블루에 밴드 스테인드 SDS 페이지 젤 26 kDa에 하나의 밴드를 표시 해야 합니다. 이것은 최종 BMP2-K3Plk 제품입니다.

2. 구리 (I)의 최적화-촉매 Alkyne-아 지 드 Cycloaddition (CuAAC) 조건

  1. 나트륨 하는데 (NaAsc) 및 구리 (II) 황산 염 (CuSO 4 )의 효과 야생 타입 BMP2에 (BMP2-WT)
    1. 20 µ M를 품 어 BMP2-WT CuSO4NaAsc의 다른 비율. 50 µ L 볼륨에 0.5 m NaAsc m와 0.5 m m CuSO4 (시작 농도)를 사용 합니다. NaAsc의 다음 비율 CuSO4진행: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), 0.5 m m에 지속적인 CuSO4 농도 유지 하 고 NaAsc의 농도 적절 하 게 조정. 실시간에서 H2O (20 rpm) 회전 믹서에 반응을 밤새 수행 하는 방법
    2. 5 %2-mercaptoethanol을 포함 하는 로드 버퍼를 추가 하 여 감소 샘플을 준비 하 고 6 분 분석 감소 및 SDS Polyacrylamide 여 비 감소 샘플 (12%) 전기 영동 (SDS-PAGE)와 화려한 Coomassie 파란 얼룩이 지 젤 95 ° C에서 샘플을 품 어. SDS 페이지 젤 스테인드 Coomasie 13 kDa (감소 이용) 26 kDa와 높은 분자량 (비 감소 조건)의 범위에서 밴드를 표시 합니다.
  2. 효과 Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) CuAAC 반응에 아민 (THPTA)
    1. 20 µ M를 품 어 BMP2-K3Plk CuSO4THPTA의 다른 비율. 사용 하 여 5 mM NaAsc, 그리고 200 µ M 3-Azido-7-hydroxycoumarin (일정 하 게 유지 NaAsc와 3-Azido-7-hydroxycoumarin). 50 µ M THPTA와 CuSO4 의 0.5 m m를 사용 하 여 농도 시작으로. CuSO4THPTA의 다른 비율을 사용 하 여: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). 회전 믹서 (20 rpm)에 실시간에 24 h에 대 한 반응에서 H2O (50 µ L 총 볼륨)를 수행.
    2. 커플링, 시 3-Azido-7-hydroxycoumarin 형광 염색 된다. 감소 및 감소 비 조건에서 샘플을 준비 하 고 SDS 페이지 분석. 3-Azido-7-hydroxycoumarin에 대 한 특정 파장 여기 채널에서 젤 시각화 (λabs 404 = nm; λem 477 = nm).

3. 공유 결합 기술 BMP2-아 지 드를 K3Plk의 공업화 Agarose 구슬

  1. 2 h RT에는 rotati에 대 한 반응 버퍼 (0.1 m M HEPES pH 7.0, 3.9 M 요소, 50 µ M CuSO4, 250 µ M THPTA, 5mm 나트륨 하는데)에 500 µ L의 전체 볼륨에 아 지 드 활성화 agarose 구슬의 20 µ L로 BMP2 K3Plk 또는 BMP2 WT (부정적인 제어 사용) 20 µ M를 품 어 ng 믹서 (20 rpm)입니다. 5 mM EDTA (최종 농도)를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
  2. RT에 회전 믹서 (20 rpm)에 15 분 동안 품 어. 실시간 수집에 1 분 동안 20000 x g에서 샘플은 supernatants 원심.
  3. 4 M MgCl2, 1000 µ L와 함께 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1000 µ L 세 번의 HBS500 버퍼 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), 1000 µ L와 구슬 포함 된 펠 릿 세 번 씻어. 모든 세척 단계에서 RT에 1 분 동안 20000 x g에서 원심과 supernatants를 수집 합니다. 4 ° c.에 PBS의 1000 µ L에 결합 된 구슬 저장
    주의: 제거는 상쾌한 하는 동안 비드 펠 렛을 방해 하지 마십시오.

4. BMP 수용 체를 분류 존재와 고정된 BMP2-K3Plk를 사용 하 여 텍사스 레드의 생물 학적 활동의 유효성 검사 나 Ectodomain BMPR IA ( EC )

  1. 50을 품 어 텍사스 레드의 1 µ M와 기능성된 BMP2 K3Plk 구슬의 µ L 회전 믹서 (20 rpm)에 1 시간에 대 한 실시간에 HBS500 버퍼 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl)의 150 µ L 함께 BMPR IAEC 를 분류.
  2. 20000 x g 실시간 삭제는 상쾌한에 1 분 동안에 구슬 원심 워시 1000 µ L의 HBS500 버퍼와 구슬. 세척 단계는 추가 3 회 반복 한다. 각 후 RT에 1 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 세척 단계.
  3. PBS의 500 µ L에 구슬 resuspend 고 유리 커버 슬라이드에 50 µ L 플라스틱. 561 또는 594 nm 사이 현미경 필터를 설정 합니다. 텍사스 레드-BMPR-IAEC검색-BMP2-K3Plk 기능성 형광 현미경 검사 법 및 사진을 사용 하 여 구슬.

5. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 측정 전에 BMP2 K3Plk 생산 고는 결합 후 반응의 생체 외에서 Bioactivity를 증명 하는 식.

  1. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 분석 결과
    1. Promyoblastic C2C12 세포 (ATCC CRL-172)에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 U/mL 페니실린 G, 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스와 문화.
    2. 96-잘 microplate에 3 × 104 셀/잘의 밀도에 씨앗 C2C12 세포. 셀 하룻밤을 연결 하자. 매체를 제거 하 고 품 어 0.5-200의 C2C12 세포에 100 µ L/잘 DMEM (2% FCS 100 U/mL 페니실린 G, 100 µ g/mL 스)의 5% CO2 72 h 습도 분위기에서 37 ° C에서의 BMP2 WT 또는 BMP2 K3Plk nM.
    3. 매체를 제거 하 고 잘 당 PBS의 100 µ L로 세포 세척. 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L/잘 1 h에 대 한 실시간에 세포를 lyse (1 %NP-40, 0.1 m M 글리신, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) 흔들어에 접시 (220 rpm).
    4. 세포 lysate를 100 µ L/ALP 버퍼 (0.1 m M 글리신, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2)의 우물 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (갓 추가) 추가.
    5. 405에서 흡수 측정 여러 리더 알프 버퍼 및 모든 5 분을 추가 하는 색상의 개발 완료 될 때까지 후에 nm. 복용량 응답 곡선 및 로지스틱 모델을 사용 하 여 EC50 값 생성 y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/0x)p).
  2. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 얼룩
    1. Promyoblastic C2C12 세포 (ATCC CRL-172)에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 U/mL 페니실린 G, 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스와 문화.
    2. 씨앗의 3 × 104 셀/96-잘 microplate에 밀도에 세포를 C2C12. 셀 하룻밤을 연결 하자. 매체를 제거 하 고 20 µ L/잘 BMP2 K3Plk 결합 된 구슬의 추가. BMP2 K3Plk 결합 구슬 1000 µ L의 PBS 정지에 있습니다.
    3. DMEM에 0.4% 낮은 녹는 점 agarose의 솔루션을 준비 합니다. 그리고 전자 렌지 (600 W 3 분)에서 녹여 사용까지 37 ° C에서 물 욕조에 진정 하자.
    4. 각 잘 (취재 구슬과 셀)에서 0.4% 낮은 녹는 점 agarose의 20 µ L를 추가 합니다. 20 ° c.에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심 분리기 80 µ L DMEM (2% FCS 100 U/mL 페니실린 G, 100 µ g/mL 스)를 추가 하 고 5% CO2 72 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.
    5. 매체, 응고 0.4 %agarose 분리 하지 않도록 주의 하 고 제거 합니다. 추가 100 µ L/우물 1 단계 NBT/BCIP (니트로 블루 tetrazolium 염화 물, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-톨루이 소금) 기판 솔루션.
    6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소는 명백 하 게 되는 보라색 얼룩 직후 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 분석. 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 고 사진을 찍고.

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결과

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이 문서에서 우리는 covalently 상용 아 지 드 기능성된 agarose 구슬 (그림 1)을 새로운 BMP2 변종, BMP2-K3Plk 하는 방법을 설명 합니다. 생산된 BMP2 K3Plk variant의 bioactivity C2C12 세포에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 유전자 발현의 유도 의해 확인 되었다. 생체 외에서 시험 야생 타입 BMP2에 의해 유도 된 유사한 ALP 식 레벨 표시 (BMP2-WT) 및 BMP2-K3Plk (그림 2).

구리 (II) 황산 염 (CuSO4)과 나트륨 하는데 (NaAsc) 사이 redox 반응 구조적 무결성에 영향을 하 고 따라서 BMP2 K3Plk의 bioact...

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토론

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유전자 codon 확장 태그 단백질 이체를 생성 주로 기본 단백질 시퀀스의 어떤 위치 든 지에서 다양 한 비 천연 아미노산 아날로그의 도입을 허용 한다. BMP2 같은 Bmp, 경우 공통 태그 6 히스티딘 (그의) 태그 수와 같은 N-말기, 이후 protein´s C 터미널 끝 차 단백질 구조 내에서 매장 된다 고 따라서 액세스할 수 없는 외부에서 도입. 다른 위치에서 소개 태그의 크기는 결과적으로 BMP´s bioactivity를 없애다 구조 변경 가능성이 매우 발생할 수 있습니다. 또한, 돌연변이 소개 BMP2 시퀀스로 refolding 효능에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 또한 수정 된 단백질의 전자 포인트 같은 다른 단백질 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 따라서, 설립된 단백질 생산 프로토콜에서 모든 단일 단계 변경된 단백질 variant´s 특성에 따라 적응 해야 합니다. BMP2-K3Plk의 생산은 실제로 야생 타입 BMP2의 표현에 대 한 설립된 방법의 수정이 필요합니다. 다른 문화 시간 또는 propargyl-...

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공개 사항

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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 글

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저자는 pyrrolysyl-tRNA를 인코딩 하는 플라스 미드를 제공 하 고 제공 하는 pRSFduet pyrtRNAsynth 인코딩 해당 aminoacyl-tRNA 합성 박사 M. Rubini (Konstanz, 독일) 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Material
1-Step NBT/BCIPThermo Fisher34042세포에 용액 추가
3-Azido-7-hydroxycoumarinBaseClickBCFA-047-1클릭 반응에 사용되는 화학물질
Agarose 저융점Biozym840101ALP 분석을 위한 Agarose 
Azide 아가로스 비즈Jena BioscienceCLK-1038-2반응에 사용되는 비즈
BamHI (Fast Digest enzyme)Thermo Fisher ScientificFD0054제한 효소
BMP 수용체 IA (BMPR-IAEC)---우리 실험실에서 생산
Coomassie Brilliant Blue G-250 DyeThermo Fisher Scientific20279Coomassie에 사용되는 화학물질 SDS PAGE
구리 (II) 황산염 무수 (CuSO4)Alfa AesarA13986클릭 반응에 사용되는
화학물질 DNA 중합효소 및 반응 완충액 KapabiosystemsKK2102KAPA HiFi PCR 키트
Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 배지 (DMEM) GlutaMAXGibco61965-026세포 배양 배지
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)Sigma Aldrich GmbHE5134-1kg클릭 반응을 멈추는 데 사용되는 화학물질
이소프로필 ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Carl Roth GmbH2316.5박테리아 유도 (1mM 최종 농도) 
ThermoFisher ScientificER0581제한 효소
NHS-활성화 텍사스 레드라이프 테크놀로지T6134수용체
P-니트로페닐 포스페이시그마 알드리치 GmbHN4645-1G알칼리 인산가수분해효소
p25N-hmBMP2 --플라스미드는 Walter Sebald가 J. Nickel
pET11a-pyrtRNA----뷔르츠부르크 대학교 약학 및 생물약학 의
--르츠부르크 대학교
pSRFduet-pyrtRNAsynth--Wuerzburg 대학의 제약 및 생물약학 의장이 제공하는
Qiagen 젤 추출 키트Qiagen28704젤 정제
Qiagen PCR 정제 키트Qiagen28104PCR 정제 
나트륨 L-아스코르브산염시그마 알드리치 GmbHA7631-100G클릭 반응에 사용되는 화학물질
T4 DNA 리가제ThermoScientificEL0011Ligation 
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)BaseClickBCMI-006-100클릭 반응에 사용되는 화학물질
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-폴리에틸렌 글리콜Sigma Aldrich GmbHX100-1LTriton X 100 
NameCompany카탈로그 번호Comments
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Rotor JA-10Beckman Coulter --Avanti J-26XP 원심분리기
로터 JLA 8.1Beckman Coulter용 로터 --Avanti J-26XP 원심분리기
로터 JA 25.50Beckman Coulter--Avanti J-26XP 원심분리기
Tecan infinite M200 멀티플레이트 리더Tecan Deutschland GmbH--ALP 분석
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TxRed - 형현미경 필터 Keyence필터 
한외여과 재생 셀룰로오스 디스크 3 kDaMerck KGaAPLBC04310amicon 농축 셀 400ml와 함께 사용
외여과 재생 셀룰로오스 디스크 10 kDaMerck KGaAPLGC04310amicon 농축 셀 400ml와 함께 사용
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참고문헌

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BMP2CuAAC

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