방법 논문

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

DOI:

10.3791/56617

⸱

2017년 11월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

이 논문에서

요약

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이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

초록

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DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 심각한 DNA 병 변. 형성 및 DSB의 수리 분석은 게놈 무결성, genotoxicity, 방사선 생물학, 노화, 암, 및 신약 개발 등 연구 분야의 넓은 스펙트럼에 관련. 응답에서 DSB, 히스톤 H2AX 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 개별 핵 foci 감지를 형성 하는 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에 phosphorylated은. 또한, 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1)은 또 다른 중요 한 DSB 반응 단백질 nonhomologous 끝 동종 재결합 하면서 가입 하 여 DSB의 복구를 추진. ΓH2AX와 53BP1의 특정 기능에 따라 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 결합 된 분석 DSB의 상세한 분석에 대 한 합리적인 접근 있을 수 있습니다. 이 원고는 단계별 프로토콜을 기술을 수행 하기 위한 조직적 노트와 보충을 제공 한다. 특히, γH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 셀 라인 NHDF의 정상적인 fibroblasts에 시연입니다. 또한, biomarker는으로 γH2AX foci의 값은 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포에 그려져 있습니다. 마지막으로, 유전자 불안정성의 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 조사.

서론

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DNA는 지속적으로 내 생에 의해 손상 (예를 들어, 복제 스트레스, 반응성 산소 종, DNA의 본질적인 불안정성) 및 외 인 (예, 화학 기, 방사선) 소스 (그림 1)1,2 ,,34. DNA 손상, 중 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 특히 심각한 병 변 그리고 세포 죽음 또는 발암을 일으킬 수 있습니다. 약 50 DSB는 세포와 세포 주기5당 발생할 수 있습니다. 포유류 세포, 동종 재결합 (HR) 및 nonhomologous 끝-결합 (NHEJ) 개발 DSB (그림 2)의 복구에 대 한 주요 경로. 인사 늦게 S/g 2 단계에서 발생 하 고 그대로 동생을 사용 하 여 잠재적으로 오류 없이 복구에 대 한 템플릿으로 chromatid. 비교에서는, NHEJ 기본적인 쌍을 추가 또는 깨진된 끝의 결 찰 하기 전에 절제 수 있습니다 및 잠재적으로 돌연변이 세포 주기입니다. 또한, 대체 최종 합류 NHEJ 결핍6,7시 느린 돌연변이 백업 복구 메커니즘으로 약혼 수 있습니다.

DSB 각 DSB 주위 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에서 히스톤 H2AX의 인 산화를 유도. 형성 핵 foci γH2AX foci 이름이 되며 면역 형광 검사 현미경 검사 법8감지. ΓH2AX 추가 DSB 반응 단백질의 신규 모집을 촉진 하 고 개장 하는 chromatin, DNA 수리, 및 신호 변환9에 관여. 각 γH2AX 초점을 나타내는 단일 DSB 간주 됩니다, 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DSB의 정량화는 가능,이 암 세포 선 및 환자 표본10,11, 에서 입증 되었습니다. 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1) DSB 수리 중재에 또 다른 주요 단백질 이다. 그것은 DSB 반응 단백질, 검사점 신호, 그리고 DSB 끝15synapsis의 채용에 관여. 또한, 53BP1 DSB 복구 경로 선택에서 중요 한 역할을 하고있다. 그것은 시간 동안 방해16NHEJ 향해 DSB의 수리를 트리거합니다. ΓH2AX 및 DSB 수리에 53BP1의 진정한 기능을 고려 하면 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해의 동시 분석 형성 및 DSB의 복구의 정확한 분석을 위한 유용한 방법 있을 수 있습니다.

이 원고는 세포 핵에 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 수행 하기 위한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 특히, 기술은 셀 라인 NHDF, 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포와 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서의 정상적인 fibroblasts에 적용 됩니다. 방법의 세부 정보는 제시 결과의 맥락에서 지적 했다.

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프로토콜

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여기에서 설명한 모든 방법을 의료 학부 임 하이델베르크 대학 윤리 위원회 II에 의해 승인 되었습니다. 모든 개인에서 동의 얻어 작성.

1. 재료의 준비

  1. 응고 제 재고 솔루션: 0.9% 염화 나트륨에에서 mL 당 200 I.U. 덤플링의 항 응 혈 약 재고 솔루션을 준비. 컬렉션 튜브의 각 채우기 (볼륨 그릴 9 mL) 혈액 또는 골 수 샘플의 철수 하기 전에 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와.
  2. 적혈구 세포 솔루션: 레드 셀 염화 암모늄 82.91 g, 7.91 g 염화 중 탄산염, 그리고 pH 8.0에서 에이전트를 용 해 하 여 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 성 해결책의 2 mL에 lysis 솔루션 x 10 준비 1의 전체 볼륨에 대 한 이중 증 류 물 L.
  3. 고정 솔루션: 추가 8.3 µ L 360 mg paraformaldehyde (PFA) 결정 튜브에서에 1 M 수산화 칼륨 해결책의. 튜브 및 열 36 %PFA 솔루션의 1 mL를 95 ° C에가 열 블록에 튜브의 1 mL 마크를 버퍼링 하는 인산 염 분 (PBS)로 튜브를 채우십시오. 15 mL의 용량을 가진 튜브를 1 mL 36 %PFA 솔루션을 전송 합니다. 8 mL PBS 1 mL 36 %PFA 솔루션 4 %PFA 재고 솔루션의 9 mL를 추가 합니다. 셀의 고정을 위한 4 %PFA 재고 솔루션 및 저장소까지-18 ° C에서 사용 하는 약 수.
    주의: 1) 수산화 칼륨 해결책은 부식성 이다. 눈과 피부 보호를 알고 있어야 합니다. 2) PFA 발암 성 이다입니다. 피부 접촉 및 흡입 하지 마십시오. 준비는 후드 아래 고정 솔루션.
  4. Permeabilization 솔루션: 추가 50 µ L Octoxinol 9 ~ 50 mL PBS 약 0.1%의 솔루션을 Octoxinol 9.
  5. 차단 솔루션: 5%와 2 %6에서 PBS와 저장소 단백질 블로킹 제를 혼합 하 여 차단 하는 솔루션 준비 – 8 ° c.

2. 샘플의 준비

  1. 섬유 아 세포 세포 배양에서: 셀 라인 NHDF 습도 5%에서의 인간의 섬유 아 세포를 배양 10% 태아 종 아리 혈 청, 4mm 보충 RPMI 1640 매체에서 37 ° C에서 CO 2 분위기 글루타민, 그리고 1% 페니실린/스입니다.
    1. 준비는 현미경 슬라이드의 점착 섬유 아 세포
      1. 플라스 크 (75 cm 2 성장 지역) 기 하 급수적으로 성장 하는 NHDF 섬유 아 세포에서에서 매체를 제거 합니다. 플라스 크에 10 mL PBS를 추가 합니다. 수동으로 1 분에 대 한 플라스 크를 흔들어 부착 섬유 아 세포를 부드럽게 씻어
      2. 는 PBS를 제거 하 고 플라스 크에 트립 신 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 모든 부착 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 있도록 플라스 크를 흔들어. 플라스 크에서는 트립 신을 제거 합니다. 37 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 넣어 ° c.
      3. 는 인큐베이터에서 플라스 크 고 플라스 크에 10 mL RPMI 1640 매체를 추가. 매체는 섬유 아 세포를 분산 여러 번 위아래 플라스틱.
      4. 각 현미경 슬라이드의 두 필드에 분산 된 섬유 아 세포의 0.3 mL를 플라스틱 하 고 슬라이드 하는 섬유 아 세포 준수 24 h에 대 한 인큐베이터에 슬라이드를 넣어. ΓH2AX 및 섬유 아 세포의 핵에서 53BP1의 immunostaining에 대 한 이동 단계 3.1.
  2. 환자 샘플
    1. 혈액 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 혈액을 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 분리 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 단 세포 휴식 G0/G1 단계.
    2. 골 수 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션 (단계 1.1)의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 골 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 단 세포 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 휴식 G0/G1 단계 분리. CD34 microbeads를 사용 하 고 셀 CD34 + 세포의 고립에 대 한 분리 열.
    3. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 단 세포의 고립
      참고: 단 세포 밀도 그라데이션 원심 17 , , 18 19에 의해 혈액과 골 수 샘플에서 격리 됩니다.
    4. Dilute PBS와 1: 1의 비율로 heparinized 혈액 샘플 및 PBS와 1: 3의 비율로 heparinized 골 수 샘플
        . 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 중단.
      1. 신선한 튜브를 밀도 그라데이션 매체의 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 희석된 혈액 또는 골 수 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어. 두 레이어 혼합에 아닙니다 돌.
      2. 원심 관 실 온에서 30 분 동안 하 고 400 x g. 피펫으로와 위 플라즈마 레이어를 그립니다. 다음 신중 하 게 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어 단 셀 수확. 단 세포 신선한 튜브로 전송.
      3. 튜브에 단 세포를 PBS의 적어도 3 개의 볼륨을 추가합니다. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 부드럽게 세포를 일시 중단 합니다. 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심
      4. 스핀 후는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C, 적혈구 세포 솔루션 x 1의 10 mL을 추가. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 resuspend 고 5 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 다음 4 ° C에서 30 mL PBS를 추가 하 고 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심
    5. 준비는 cytospins의
      1. (즉, γH2AX 면역 형광 염색 법에 대 한 하나의 cytospin 및 γH2AX 및 53BP1에 대 한 하나의 cytospin 환자 샘플의 단 세포와 두 cytospins 준비 면역 형광 염색 결합) 원심 분리 (300 x g, 10 분) ( 그림 3 및 4) 각 준비에 대 한 10 5 셀 x 1.0의 의해.

3. γH2AX 및 53BP1 면역 형광 염색

  1. 고정 및 permeabilization: 4%의 200 µ L 셀 해결 PFA 10 분. 고정, 후 30 mL PBS의 각 실험실 통에 5 분을 세 번 셀을 부드럽게 씻어. 다음 세포를 permeabilize 0.1%의 200 µ L을 10 분에 대 한 Octoxinol 9 씻어 셀 부드럽게 각 실험실 통에 5 분 30 mL 5% 차단 솔루션의와 세 번. 1 헤에 대 한 솔루션을 차단 하는 신선한 5%의 30 mL에서 세포를 차단
  2. 항 체를 가진 외피
    1. 품 어 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 한 준비와 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 다른 준비를 하 고 4에서 하룻밤 polyclonal 토끼 안티-53BP1 항 체 (1: 500) ° c.
    2. 인큐베이션 세척 세포 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 2% 차단 솔루션의 30 mL로 3 시간 후.
    3. 차단 솔루션을 제거 하 고 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 2 차 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 첫 번째 준비와 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 이차 항 체 (셀의 두 번째 준비 품 어 1: 500)와 Alexa555 활용 된 당나귀 안티 토끼 2 차 항 체 (1: 500) 실 온에서 1 h.
  3. 장착 매체: 셀으로 슬라이드를 그릇에 넣고 셀 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 30 mL의 PBS로 3 회 세척. PBS를 제거 하 고 장착 매체 4, 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 셀을 탑재. 조심 스럽게 넣어 장착 매체 위에 coverslip 없음 기포는 포함 된. 형광 현미경으로 세포를 분석 하기 전에 장착 매체의 강화에 대 한 적어도 3 h 기다립니다.

4. ΓH2AX 및 53BP1의 분석 Foci

  1. 형광 현미경 검사 법: 100 X 목표에 이미징 동안 DAPI, 알 렉 사 488, Cy3 필터를 갖춘 형광 현미경으로 세포 핵에서 γH2AX 및 53BP1 foci 분석 확대입니다. 카메라와 함께 이미지를 기록 하 고 적절 한 이미징 소프트웨어로 이미지 처리.

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결과

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셀에 γH2AX foci의 분석 G0/G1 단계 그리고 G2 단계 γH2AX foci (그림 5A) 고유한 형광 점으로 표시 하는 때에 가장 정확 하다. 반면, S 단계 세포에 γH2AX foci의 분석 복제 프로세스 (그림 5B)에 의해 발생 하는 분산된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 의해 복잡 합니다.

셀의 고정 4% 수행한 PFA (10 분) 및 0.1% permeabilization Octoxinol 9 (10 분). 메탄올은 고정 및 permeabilization, 사용할 수 있습니다 그러나, 메탄올 수 있습니다 세포 핵을 꽤 심각 휴식과 γH2AX 포커스 4 %PFA 0.1% 처리 하 여 얻은 γH2AX foci에 비해 뚜렷한 나타나지 않을 수 있습니다...

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토론

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면역 형광 검사 현미경 검사 법의 γH2AX와 53BP1 형성 및 연구 분야의 넓은 스펙트럼에서 DSB의 수리 분석을 위한 유용한 방법입니다. 실험의 결과 좌우 하는 중요 한 매개 변수는 세포 주기, 고정 및 permeabilization 세포, 항 체, 그리고 하드웨어의 선택과 형광 현미경의 소프트웨어 사용 하는 에이전트의 단계.

ΓH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 정상 섬유 아 세포 세포 라인 NHDF의 기 하 급수적으로 성장 하 여 시연 했다. ΓH2AX foci G0/G1에 고유한 형광 점으로 등장 및 S 단계 (그림 5)에서 분산 된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 비해 g 2 단계. G0/G1에 뚜렷한 γH2AX foci 단계 그리고 G2 단계 표시 과도 그리고/또한 제정 DNA 손상 반복적인 세포 주기 통로; 중 획득 수 있습니다. 반대로, S 단계에서 분산된 얼룩만 정도 발생 하 고 아마도 ...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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프로젝트는 독일 호세 카레라스 백혈병 재단 (DJCLS 14 R/2017)에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 매체Sigma-AldrichR0883세포 배양을 위한 매체
Heparin sodiumratiopharmPZN 3029843  Heparin 5,000 IU / mL
염화나트륨 용액 0.9 %B. BraunPZN 1957154항응고제 원액
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02단핵 세포 분리를위한 배지
트립신 용액 10XSigma-Aldrich59427C세포 배양에서 섬유 아세포의 해리를위한 효소
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702CD34+ 골수성 전구 세포의 분리
진단 현미경 슬라이드Thermo ScientificER-203B-CE24현미경 슬라이드
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060  탁상용 원심분리기 
Cytospin 장치
뚜껑Heraeus76003422마이크로 튜브 없이 작업하기 위한 뚜껑
사이토 용기헤레우스750034162개의 원뿔형 구멍이 있는 사이토 용기
클립 캐리어헤레우스75003414사이토 용기와 슬라이드를 고정하기 위한 캐리어
지지 인서트헤레우스75003417지지 인서트 클립 캐리어 트리
톤 X-100 (옥톡시놀 9)을 들고 Thermo Scientific85112세포막의 투과화를 위한 세제
수산화칼륨 용액 1MMerck Millipore109107파라포름알데히드 용액 준비에 필요
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148고정제
인산염 완충 식염수시그마-알드리치D8537균형 잡힌 염 용액
화학 차단제Merck Millipore2170차단제
마우스 단클론 항-&감마; H2AX 항체 (JBW301)Merck Millipore05-6361차 항체 γ H2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 항체 (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-30453BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse 항체InvitrogenA-110012차 항체
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit 항체InvitrogenA-315722차 항체
Vectashield mounting mediumVector LaboratoriesH-1200DNA 염색을위한 DAPI 포함
Axio Scope.A1Zeiss490035형광 현미경
쿨 큐브 1 CCD 카메라메타 시스템H-0310-010-MS디지털 기록을위한 카메라 시스템
Isis 소프트웨어메타 시스템해당현미경 소프트웨어
의 구성 요소 검출을 위한 1차 항체

참고문헌

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