유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
방법 논문
자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정
이 논문에서
요약
초록
세포 유전자 발현의 기자 luciferase 기반 둘 다 경도 대 한 광범위 한 사용에 있고 끝점 생물 학적 활동의 분석 실험. Circadian 리듬 연구, 예를 들어 반딧불 luciferase와 시계 유전자 융해 일으키 강력한 리듬에 많은 일 동안 유지 세포 생물 발광. 광 전 증폭 관 관 (PMT)와 관련 된 기술 제한 또는 생물 발광 정량화에 대 한 기존의 현미경-기반 방법 일반적으로 세포와 조직 중 아주 비 생리 적 조건 하에서 유지 될 요구 했다 녹음, 감도 처리량 사이 교환. 여기, 우리 수 있도록 장기적인 생물 발광 영상 높은 감도와 처리량을 문화 조건, 습도 제어, 가변 가스 등의 광범위 한 범위를 지원 하 고 많은 종류를 원하는 다른 이전 방법의 상세 보고 조직 문화 접시 그리고 요리입니다. 또한 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징이 자동화 경도 luciferase 셀 단층 또는 전통에 의해 쉽게 관찰 될 수 없습니다. 있는 조직, luciferase 식 공간 변이의 관측 수 방법입니다. 우리는 악어 기존의 방법에 비해 luciferase 활동의 탐지에 대 한 대폭 증가 유연성을 제공 하는 방법을 강조 표시 합니다.
서론
유전자 발현 및 단백질 활동의 기자로 luciferases 사용 하 여 분자 및 세포 생물학 연구에서 인기 있는 기술 되고있다. 이것은 사실이 circadian 필드, 반딧불 luciferase 합성 및 촉매 비활성화의 속도 약 24 h circadian 주기 동안 발생 하는 유전자 발현의 경도 변화를 보고 하는 데 특히 적합. 이와 같이, luciferase 생물, 균 류, 식물, 파리, 그리고 포유류1,2,,34를 포함 하 여의 넓은 범위에 걸쳐 circadian 기자로 채택 된다.
Circadian 유전자 식에 체 외에서측정 될 때 광 전 증폭 관 관 (PMT) 발광 신호를 기록 하는 데 주로 사용 됩니다. 그러나 PMT 기반 측정 제한 유연성, 일반적으로 미리 정해진된 접시 또는 접시 크기에 제한 되 고. 그것은 불가능도 luciferase 식에서 공간 변화를 보여 주는 샘플을 이미징 하는 경우 정보의 손실에 지도할 수 있는 PMT를 사용 하 여 모니터링 샘플에서 공간 정보를 수집 합니다. 또한, PMT와 관련된 전자는 표준 셀 문화 인큐베이터의 습도 환경에 노출 되 면 오작동 하는 경향이, Pmt를 사용 하 여 경도 luciferase 녹음은 항상 비 습도 인큐베이터에서 수행 됩니다. 결과, 셀 문화 요리 공기 증발을 통해 수 분 손실을 방지 하기 위해 꽉 밀봉 해야 합니다 및 3-따라서 문화 미디어를 버퍼링 해야 합니다 (N-morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 또는 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), vivo 기능 그리고 포유류 조직 문화에서 일상적으로 사용 하는 시스템을 버퍼링 CO2/bicarbonate 보다는.
이러한 제한의 결과로 Pmt에 의해 생물 발광의 측정은 일반적으로 세포 실험 동안 유지 되는 조건에 꽉 제한을 장소. 이러한 문제를 극복 하 고 또한 가능한 실험 조건의 범위를 증가, 우리는 표준 공동2/N2 170 L 조직 문화 인큐베이터는 물 냉장 전자-멀티의 추가 의해 적응 되었습니다 사용 하 여 전 하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 anti-mist 광학 및 디지털 제어 온도 가스 레벨의. 이 가스 이미징 Luciferase 자동 경도 및 Temperature-Optimized 레코더, 또는 악어 별명은. 악어 발광 이미징, 모두 표준 조직 배양 플레이트의 높은 처리량 이미징의 유연성을 크게 증가 수 있습니다 (동시에 최대 6 x 96-또는 384-잘 접시)와 또한 비표준 조직 문화 시스템에 대 한 이러한 끼얹는다 셀으로 미세 장치에서 성장. 이 악기는 또한 가변 제어 모두 CO2 와 O2 부분 압력으로 온도 습도 조건 하에서 발생 하는 화상 진 찰에 대 한 수 있습니다.
프로토콜 아래 포유류 세포와 악어 (이제부터 '생물 발광 인큐베이터' 라고도 함)를 사용 하 여 조직 문화 시스템의 발광 녹음 하는 방법을 설명 합니다. 그러나 그것은,, 시스템 발광 영상 하 고 또한, 일부 수정, 형광 이미징, 다른 생물 학적 시스템 및 컨텍스트 수에 적합 될 것 이라고 주목 한다.
프로토콜
1. 시드 및 셀의 온도 유입
참고:이 프로토콜은 엄격 하 게 테스트 되었습니다 PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) 융합 단백질4를 표현 하는 기본 및 불멸 하 게 마우스 fibroblasts을 사용 하 여. 실험 다른 셀 라인을 사용 하 여 만들 수 조정 해야 합니다.
- 세포 배양을 시작 하기 전에 따뜻한 37 ° C 물 목욕으로 다음 장소: 0.68 m m ethylenediaminetetraacetic 산, pH 7.2 (PBS + EDTA), 적절 한 세포 배양, 예를 들면, 보충 식 염 수 (PBS) (pH 7.4), PBS 인산 염 버퍼 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 µ g/mL 스와 0.25 %trypsin 용액 보충.
- 트립 신 1:3 미리 데워 공영 + EDTA 솔루션을 희석 하 고 물 목욕을 반환 합니다.
- 70-90%는 luciferase 표현 셀의 125 cm2 플라스 크 confluent 가져가 라. 미디어 발음 10 mL 미리 데워 공영을 추가 합니다.
- PBS 발음 2.5 mL 미리 따뜻하게 트립 신-EDTA를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 반환 합니다.
- 인큐베이터와 현미경 아래 보기에서 셀을 제거 합니다. 대부분 세포의 플라스 크 바닥에서 분리 했으면, 다음 단계를 계속. 대부분의 세포는 플라스 크의 하단에 연결 된 남아, 반환 그것 인큐베이터에 대부분의 세포에에서까지.
- 플라스 크를 표준 세포 배양 매체의 더 7.5 mL를 추가 합니다. 필요한 경우, 추가 필요에 따라 셀의 통과 위해 이것의 1 mL를 제거 합니다.
- Hemocytometer 고 trypan blue를 사용 하 여 나머지 셀의 밀도 계산. 또한, 셀 라인에 대 한 적절 한 셀을 희석.
참고: 아래 실험에 대 한 PERIOD2::LUC fibroblasts 6 x 103 셀/c m2 와 1 x 104 셀/cm2 96 잘 접시, 35mm 요리, 또는 채널 슬라이드 사이 시드 했다. - 씨 셀 조직 문화 요리 또는 기록을 위해 사용 될 판에.
참고: 블랙 양면, 분명 바닥 플레이트의 사용은 권장이 녹음 하는 동안 우물 사이 방해를 감소 하는 동안 녹음 시작 전에 평가 문화 건강 수 있습니다. 생물 발광 수준은 매우 낮은, 흰색 접시/접시 인광 이어질 수는 몇 시간 동안 지속 되는 배경 신호를 증가 하는 하십시오 빛 검출을 극대화 하기 위해 사용 되어야 한다. - 인큐베이터에 접시를 반환 하 고 100% 합류 (약 7 일)에 도달 하는 monolayers를 허용 합니다.
참고: 일단 confluent, 접촉을 억제 하는 세포 선 유지 될 수 최대 3 주 전에 실험에 대 한 미디어 정기적으로 새로 고치는 (매 5-7 일). - 일단 confluent, 동기화 실험5,6 직전 72 h의 최소 적용된 온도 사이클 (12 h 12 h 37 ° C에서 32 ° C에서)를 사용 하 여 셀룰러 리듬 (미리 프로그램 된 자전거 인큐베이터를 사용 하 여 의해 제어 되는 컴퓨터에 연결 되어 직렬 rs-232 포트를 통해 인큐베이터).
참고: 셀룰러 리듬의 동기화에 필요한 온도 사이클 수 셀 라인 사이 다를 수 있습니다 그리고 그러므로 다른 셀 라인에 대 한 최적화를 할 수 있습니다. 급성 약물 자극 산림 또는 dexamethasone을 사용 하 여 또한 사용 되었습니다 이전 동기화 셀룰러 리듬7,8.
2. NS21 준비
참고: NS21 신경 및 기타 세포 배양의 유지 보수에 대 한 혈 청 무료 보충 이다. B27 상용 이며 circadian 생물 발광 녹음9동안 혈 청 교체로 사용할 수 있습니다로 알려진 비슷한 보충의 상세입니다. 어느 보충 교재를 번갈아 기록 매체에서 아래 설명 된 실험 프로토콜에 대 한 사용할 수 있습니다. 그것은 확실히 가능 하 고 비용 효율적인 NS21 첸 외. 마찬가지로 사내 수 있도록 10, 그리고 여기에 설명 된 대로.
- 시작 하기 전에 1 시간 실 온에서 표 1 에 설명 된 모든 구성 요소 equilibrate
- 얼음에 324 mL 기저 매체 (예, neurobasal)에서 50 g 소 알 부 민을 디졸브. 가능 한 한 작은 혼합물을 저 어.
- 다른 모든 구성 요소, 각 구성 요소 후 최소한 감동 하지만 여전히 철저 하 게 혼합을 추가 합니다. 시작의 90 분 이내에 모든 구성 요소를 분해 하는 것을 목표로.
- 약 최종 혼합물 수 고가 필요할 때까지-20 ° C에서. 반복적인된 동결-해 동 주기를 하지 마십시오.
참고: 혼합물이 너무 점성이 단계에서 필터링 하지만 살 균 필터링 됩니다 때 셀에 추가 하기 전에 미디어로 희석.
3. 기록 미디어 준비
참고: 경도 bioluminescence를 기록 하기 위한 다른 장비를 통해 생물 발광 인큐베이터의 주요 장점은 그것이, 인큐베이터 축이다 O2 와 CO2의 부분 압력을 변화 있게 되 고, 덕 녹음 생물 발광에 대 한 미디어 조건의 넓은 범위를 사용 하 여- vivo에서유형 더 밀접 하 게 다른 세포에 의해 점유 하는 생리 적 틈새를 대략적인 조건을 포함 한. 아래 기록 매체에서 헤이스팅스 외. 적응의 공식 설명 9, 우리가 일상적으로 배양된 섬유 아 세포와 다른 세포 유형 사용. 첫 번째는 (가스 교환) 없이 봉인된 문화 조건 그리고 두 번째 순수 관련 조건에 대 한 5% CO2습도 조건 하에서 사용 해야 합니다.다른 많은 변이 모두 가능한 어플리케이션 및 셀 형식에 따라 권장 합니다.
- 높은 포도 당 MOPS 버퍼 미디어 준비
참고: 재고 솔루션 (1 L): DMEM 분말 (8.3 g/L) 0.35 mg/mL 탄산, 5 mg/mL 포도 당, 0.02 M MOPS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스.- 8.3 g DMEM 파우더 1000 mL 측정 실린더에 초순 물 900 mL에에서 녹이 고 모든 입자는 해산 될 때까지 30 분 동안 저 어.
- 포도 당 솔루션 (100 g/L), MOPS (1 M, pH 7.6)의 20 mL 50 mL 펜/strep 솔루션, x 100의 10 mL을 추가 하 고 추가로 10 분 동안 저 어.
- 4.7 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션을 추가 하 고 추가 5 분 저 어.
- 미디어 pH 7.6 (경우 실내 온도에) 또는 HCl/NaOH와 7.4 (37 ° C)를 조정 합니다.
- 1000 mL의 최종 볼륨을 생산 초순 물을 추가 합니다.
- 0.22 μ m 필터 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소를 통해 여과 하 여 소독.
- 실험, 이전 10% 혈 청, 2 mM L-alanyl-L-글루타민, NS21, 2% 및 1mm 소 일 주식을 재고 솔루션의 적절 한 볼륨을 보충 한다. 이 주식 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 전달 합니다.
- osmometer을 사용 하 여 미디어의 osmolality를 측정 합니다.
- osmometer을 켭니다.
- Osmometer 초순 물으로 먼저 보정. 50 µ L 물 측정 그릇의 바닥에 추가 합니다. 액체에 있는 아무 거품을 확인 합니다. 조사를 통해 배를 클립. '0'을 눌러 및 신중 하 게 가장 낮은 지점에 osmometer 팔. 읽기 완료 되 고 팔을 제기 하 고 배를 제거 하기 전에 녹색 '결과' 빛이 켜질 때까지 기다립니다.
- 50 µ L 교정 표준을 사용 하 여 300 mOsmol/kg osmometer 보정을 반복 합니다. 팔을 낮추기 전에 '칼'을 누릅니다.
- 샘플 osmolality 측정 용기와 위와 같이 측정의 하단에 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 측정 합니다. Osmometer 팔을 낮추기 전에 ' 샘플'을 누릅니다.
- 5 M NaCl을 사용 하 여 350 mOsmol osmolality를 조정 합니다.
- HCO3-버퍼링 낮은 포도 당 미디어 (매체 관류) 준비
참고: 재고 솔루션 (1 L): DMEM 분말 (8.3 g/L), 3.7 mg/mL 나트륨 중 탄산염, 1 mg/mL 포도 당, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스.- 8.3 g DMEM 파우더 1000 mL 측정 실린더에 초순 물 900 mL에에서 녹이 고 모든 입자는 해산 될 때까지 30 분 동안 저 어.
- 포도 당 솔루션 (100 g/L), 100 x 펜/strep 솔루션의 10 mL 50 mL를 추가 하 고 추가로 10 분 동안 저 어.
- 49.4 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션을 추가 하 고 추가 5 분 저 어.
- (실 온)에서 7.6 또는 HCl/NaOH와 7.4 (37 ° C) 미디어 pH를 조정 합니다.
- 1000 mL의 최종 볼륨을 주고 초순 물을 추가 합니다.
- 사용까지 0.22 μ m 살 균 필터와 4 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.
- 실험, 이전 2% 혈 청, 2 m m L-alanyl-L-글루타민, 2 %NS21 및 작업 주식을 1 mM 소 재고 솔루션의 적절 한 볼륨을 보충 한다. 이 주식 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 전달 합니다.
- 측정 하 고 osmolality MOPS 버퍼 미디어에 관해서는 5 M NaCl을 사용 하 여 350 mOsmol 조정 합니다.
참고: 소 농도 각 세포 유형 및 상황에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. 자세한 내용은 참조 피 니 외. 11 혈 청 및 NS21 (또는 사용 하는 경우에, B27) 농도 응용 프로그램에 따라 다양 한 수 있습니다. 그러나, 우리 조언 한다, 그렇지 않으면 표시를 경험적으로 테스트 하지 않는 한 혈 청 및 NS21 (또는 다른 혈 청 자유로운 보충) 사용으로 이러한 홍보 세포 생존 및 첨부 파일. 연락 하지 않는 셀 라인에서 잘 억제, 그것은 또한 혈 청에 의해 추진 확산의 혼란 효과 방지 하기 위해 기록 미디어에서 혈 청 농도 낮출 필요가 있을 수 있습니다.
4입니다. 기록
- 녹음 하기, 따뜻한 37 ° C 물 목욕에 (단계 3.1 또는 3.2 실험에 따라)에서 적절 한 작업 미디어 주식을 배치 합니다.
- 동안 미디어 온난화, 생물 발광 인큐베이터에서 카메라 초점.
- 물 불 침투성, 온수 중립 밀도 필터를 나사 하 고 따로 설정 합니다.
- 높은 수집 속도와 비디오 기록 소프트웨어를 설정 합니다. 클릭 "수집 | 수집 설정 "입니다. 0.2 s와 운동 시간 0.3 초를 '노출 시간'을 설정 합니다. 그들 이득 꺼져 있는지 확인 합니다.
- ' 수집 설정 ' 창을 닫고 "비디오 걸릴" 아이콘을 클릭 합니다.
- 항목 기록 높이에서 선반에는 비디오에 초점에 명확 하 게 때까지 초점 실린더를 사용 하 여 카메라 렌즈를 회전 합니다.
- '비디오 중지' 아이콘을 클릭 하 여 비디오를 중지 합니다.
- 나사 온수 중립 밀도 필터 위치로 다시; 이렇게 하지 않으면 EM-CCD 카메라 / 결로 인해 목표의 안개 손상 될 것 이다.
- 생물 발광 인큐베이터의 전면에 컨트롤 패널을 사용 하 여 원하는 실험 조건에 O2, CO2, 그리고 온도 설정 합니다.
참고: perfused 수행 하는 경우 세포 배양 진행 섹션 5에 직접이 단계에서. - 조직 문화 인큐베이터 및 미디어에서 aspirate에서 셀을 제거 합니다. 미디어를 미리 데워 작동 주식 바꿉니다.
- 생물 발광 인큐베이터 실험 기간 동안 습도 하지 않습니다, 경우 다음 봉인 요리와 플레이트 가스 불 침투성 물개와 함께.
참고: 습기 인큐베이터의 기지에서 물 트레이 작성 하 여 이루어집니다.
- 클릭 "수집 | 수집 설정 "입니다.
- ' 카메라 설치 ' 패널에서 설정: '수집 모드' '운동'; '노출 시간'을 원하는 노출 시간에서 초 (아래 참고 참조); ' 축적 ' 1; '운동 시리즈 길이' 취득 주기의 수를 원하는; '운동 주기 시간'을 원하는 이미지 간격 (이것은 노출 시간 보다 큰 수 있도록); ' 이동 속도 ' 4.33 µsecs; 1. ' 이득 ' 그리고 그들 이득 '을 원하는 레벨 (아래 참고 참조)
- '자동 저장' 패널에서.sif 또는.tif 파일 타입을 설정 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 저장 위치 적절 한.
- '스풀링' 패널에서 티파니에 파일 형식을 설정 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 저장 위치 적절 한. 인수 설정 창을 닫습니다.
참고: 생물 발광 인큐베이터는 다른 세포와 조직 유형, 모두는 생물 발광의 다른 수준을 것입니다의 많은 수를 위해 사용할 수 있는 적절 한 발광 신호를 수집 하는 데 필요한 노출 시간 달라 집니다 사이 실험입니다. 그것은 또한 신호 수집의 크기를 늘리기 위해 이미징의 전자 멀티 (EM) 이득 다 수 있습니다. 알 수 없는 밝기의 새로운 애플 리 케이 션에 대 한 것이 좋습니다 먼저 EM 이득 없이 비교적 짧은 노출 시간 (약 10 분)와 함께 하나의 이미지를 복용 하 고 이후 노출 시간 및 그들을 조정 얻을 원하는 녹음 조건 되었습니다 때까지 에 도달 했습니다. 대부분의 경우, 카메라에 대 한 최대 가능한 화소 강렬의 10-20%의 평균 신호를 목표로 좋은 수준입니다. 위에서 설명한 대로 녹음 매개 변수 집합에 도달 하면 일단 이미지의 경도 수집을 시작 합니다.
5. 끼얹는다 조직 문화 (선택 사항)
참고: 소개에 설명 된 대로 생물 발광 인큐베이터 비표준 조직 문화 시스템의 이미징에 적합 하다. 이것은 끼얹는다 세포 배양에 대 한 시스템의 개발에서 궁 행.
결과
이 문서는 악어 (생물 발광 인큐베이터)를 사용 하 여 포유류 세포의 발광 영상에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 발광 시스템 이미징 extracellular 조건과 실제 설치의 유연성에 대 한 수 있습니다. 간단한 정적 조직 문화 (그림 1, 보조 비디오 1) 및 (그림 2, 보조 비디오 2) 끼얹는다 세포 배양 방법을 설명 하지만 다른 많은 설정을이 시스템을 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 모든 데이터 섹션 7에 설명 된 방법을 사용 하 여 정량 했다.
그림 1A PER2::LUC fibroblasts4를 포함 하는 6 x 96 잘 접시에서 녹음 하는 생물 발광의 비디오는 예를 보여 줍니다. 이들은이 실험에 필요한으로 바깥쪽 웰 스 셀을 포함 하지 않습니다. 녹음에 대 한 지속적인 37 ° C에서 개최 되 고 전에 셀 차동 온도 유입, 그것에 의하여 그들은 32 ° C 12 h 72 h 또는 대화 (12 h, 12 h 72 h에 32 ° C에 뒤 37 ° C에서), 37 ° C에 의해 다음에 12 h의 어느 온도 사이클을 받게 받은 합니다. 60 분 노출 매 시간을 촬영 했다. 이러한 조건 중 두 개는 그림 1B에서 정량.
그림 2A 끼얹는다 조직 문화에 대 한 시스템의 설치의 회로도 보여준다. 배관으로 연결 하는 두 개의 채널 슬라이드 이것에 의하여 이루어져 있다. 미디어 셀에 걸쳐 주사기 펌프에 의해 구동 됩니다. 이 슬라이드의 첫 번째 가스 투과성 거품 트랩 (버퍼 슬라이드) 역할을 하며, 두 번째 셀 포함 생물 발광은 기록 하는 셀을 포함 하. 이 시스템에서 비디오를 녹화 하는 대표는 그림 2B에 표시 됩니다. 15 분 노출 매 15 분을 촬영 했다. 표준 관류 조건 또는 카 세 인 키 니 아 제 억제 물 PF670462, 이전 circadian 기간을 길게 하 고 경작에 시계 유전자 식 리듬의 진폭을 감소를 보여왔다 존재 셀의 유지 관리 하는 자, 포유류 세포14. PER2::LUC 식에 미치는 영향의 정량화와 그림 2C (하단 패널)에 표시 된 표준 정적 셀 문화 조건 하에서 약물의 동일한 농도로 처리 하는 셀에 대 한 그림 2C (상단 패널)에 표시 됩니다. 그림 2D에 나와 있습니다. 그것은 이것에서 PF670462 치료 조건의 두 세트에서 PER2::LUC 식 영향입니다. 그러나, 동안 셀 끼얹는다 조건 표시 기간 길어 약 3 h (3 ±0.9 h)에서 PF670462로 치료, 약물으로 치료 하는 정적 조건에서 셀 표시의 기간에 실질적으로 더 큰 기간 길이 > 48 h. 이 섹션 7에 설명 된 대로 감쇠 코사인으로 들어갈 수 있는 (사각형의 여분 합계 F 대 직선 p 테스트 < 0.0001). 흥미롭게도, 관류에서 기간 연장의 진도 훨씬 vivo에서14관찰에 가까운 이다.
그림 1: 데이터 예제. (A) 예를 들어 6 x 96에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷 잘 생물 발광 인큐베이터에 접시. 웰 스를 측정할 수 있다 보조 비디오 1에서 노란색으로 강조 되었다. A.에서 생물 발광의 부 량 (B) 두 셀의 3 판 서로 반대 PER2 단백질 식의 단계 생산을 반대로 phasic 했다 온도 사이클 (32 ° c h 12; 12 h, 37 ° C에서)를 사용 하 여 개입 했다 (n = 6, ± SEM을 의미). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: CK1δ 억제제와 관류. 관류 시스템의 (A) 회로도 (B) 예를 들어 PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 비디오 스냅샷 관류에서 세포. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. PER2::LUC 섬유 아 세포 관류에서 고 3 µ M CK1 억제제 PF670462 없이 정적 조건에서의 생물 발광의 (C) 정량화 (n = 3, ± SEM을 의미). 생물 발광은 최소 및 최대 값을 정규화 되었습니다. (D) 분석 기간 (양방향 ANOVA, Holm Sidak 여러 비교 테스트).이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 최종 중간 농도 (μ M) | 주식 (mg/mL) | 400 mL NS21에 대 한 |
| 소 민 | 37 | - | 50 g |
| 카 탈 라 제 | 0.01 | - | 50 mg |
| 티 | 3.2 | - | 20 mg |
| 인슐린 | 0.6 | 10 | 8 mL |
| Superoxide dismutase | 0.077 | - | 50 mg |
| 홀로 처리가 | 0.062 | - | 100 mg |
| T3 (triiodo-L-thyronine) | 0.0026 | 2 | 20 Μ L |
| L-카 르 니 틴 | 12 | - | 40 mg |
| 방법 | 16 | 액체 (1 g/ml) | 20 Μ L |
| D (+)-갈 락 토스 | 83 | - | 300 밀리 그램 |
| Putrescine | 183 | - | 322 밀리 그램 |
| 나트륨 Selenite | 0.083 | 1 | 280 Μ L |
| Corticosterone | 0.058 | 2 | 0.2 mL |
| 리 놀 레 산 | 3.5 | 100 | 0.2 mL |
| 리 놀 렌 산 | 3.5 | 100 | 0.2 mL |
| 리 포 산 | 0.2 | 4.7 | 0.2 mL |
| 황 체 호르몬 | 0.02 | 3.2 | 0.04 mL |
| 레 티 놀 아세테이트 | 0.2 | 20 | 0.1 mL |
| Retinol, 모든 트랜스 | 0.3 | 10 | 0.2 mL |
| D, L-알파-토 코 페 롤 | 2.3 | 100 | 0. 2 mL |
| D, L-알파-토 코 페 롤 아세테이트 | 2.1 | 100 | 0.2 mL |
표 1: NS21 준비입니다.
보충 비디오 1: 예제 비디오 잘 플레이트에서 생물 발광의. 예를 들어 생물 발광 인큐베이터에서 6 x 96 잘 접시에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷. 웰 스 측정할 수를 노란색으로 강조 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 비디오 2: PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 예제 비디오 스냅샷 세포 관류에서. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
토론
여기에 설명 된 프로토콜 끼얹는다 고 정적 조건 모두 포유류 세포 배양입니다. 그러나, 악어 쉽게 다른 모델 시스템에 적용할 수 있습니다. 실제로, 그것은 이미 표시 되었습니다 동시 운동, 수 면, 그리고 주변 유전자 초파리 melanogaster 상수 어둠15. 유지에 식 리듬의 모니터링을 위한 뛰어난 플랫폼을 제공 하 그것은 또한 응용 프로그램에 따라 여기에 언급 된 그 외 카메라 유형을 적절 한 있을 수 있습니다, 지적 했다. 우리는 적절 한 필터와 함께 현재 설치의 수정된 된 버전 보안 주체에 사용 될 수 형광 정량화 정시.
악어 적절 한 않을 수 있습니다 유일한 응용 프로그램은 특히 높은 공간 해상도 필요할는 포유류의 organotypic 조각에 PER2::LUC 식의 spatiotemporal 조직의 이미징 suprachiasmatic 핵, 또는 다른 작은 조직 조각입니다.
악어는 지금 까지는 되지 않은 기존의 레코딩 기술에 의해 쉽게 달성 많은 실험을을 수행할 수 있습니다. 생물 발광의 측정을 위한 현재 방법과 비교해, 악어 셀 문화 접시 또는 사용할 수 있는 슬라이드, 외부 미디어 조건, 감도, 및 processivity 두 유형의 증가 유연성을 제공 합니다.
이것은 특히 적합 한 번에 3D organoid 문화 시스템이 향해 문화 모델은 표준 2D 셀에서 이동이 있을 때. 이와 같이, 악어는 생물 발광은 많은 일 및 광범위 한 조건 아래 주에 측정 될 수 있다 적응 방법을 제공할 것입니다 예상 된다.
공개 사항
아니 이해 충돌 존재 한다.
감사의 글
우리는 케 른 연구 특히 마크 헨 슨, 제레미 그레이엄과 호 코 레이 아에서에서이 시스템을 개발 하기 위해 우리와 함께 작업 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 감사 데이비드 웨일스어 및 Akhilesh 레디 (하 마)의 이전 피터 Laskey 뿐 아니라 설계 단계 동안 귀중 한 토론에 대 한 원고를 그의 중요 한 입력에 대 한 데모 카메라와 데이비드 웡의 대출을 정리.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal |
| medium 소 혈청 알부민 | Sigma | A4919 | |
| 카탈라아제 | 시그마 | C40 | |
| 글루타티온 | 시그마 | G6013 | |
| 인슐린 | 시그마 | I1882 | |
| 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 | 시그마 | S5395 | |
| 홀로트랜스페린 | 칼바이오켐 | 616424 | |
| T3 (트리요오도-L-티로닌 | 시그마 | T6397 | |
| L-카르니틴 | 시그마 | C7518 | |
| 에탄올아민 | 시그마 | E9508 | |
| D (+) - 갈락토스 | 시그마 | G0625 | |
| Putrescine | 시그마 | P5780 | |
| 나트륨 셀레 나이트 | 시그마 | S9133 | |
| 코르티코 스테론 | 시그마 | C2505 | |
| 리놀레산 | 시그마 | L1012 | |
| 리놀렌산 | 시그마 | L2376 | |
| 리포산 | 시그마 | T1395 | |
| 프로게스테론 | 시그마 | P8783 | |
| 레티놀 아세테이 | 시그마 | R7882 | |
| 레티놀, 모든 트랜스 | 시그마 | 95144 | |
| D, L-알파-토코페롤 | 시그마 | 95240 | |
| D,L-알파-토코페롤 아세테이트 | 시그마 | T3001 | |
| 중탄산나트륨 용액 | 시그마 | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 | P4333 | |
| 갤럭시 170R 인큐베이터 | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-글루코스 용액 | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM 파우더 | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. 실리콘 튜빙 | GE 헬스케어 | 19-4692-01 | |
| 엘보우 루어 커넥터 | Ibidi | 10802 | |
| 남성 루어 피팅 | Ibidi | 10826 | |
| 여성 루어 피팅 | Ibidi | 10825 | |
| µ-슬라이드 루어 I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml 주사기 | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE 튜빙 | GE 헬스케어 | 18-1142-38 | |
| PF670462 | 시그마 | SML0795 | |
| B27 보충제 (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD 카메라 | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase 등온 패드 | Braintree Scientific | 39DP | |
| 가열 중성 밀도 필터 | 케언 리서치 | 커스텀 아이템 | |
| Osmomat 030 | Gonotech | 단종 | |
| 300 mOsmol/kg 교정 표준 | 고노테크 | 30.9.0020 | |
| 측정 용기 | Gonotech | 30.9.0010 | |
| 포커싱 실린더 | 케언 리서치 | 커스텀 아이템 | |
| NE-1600 프로그래머블 실린지 펌프 | 펌프 시스템 Inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis 소프트웨어 | 및 | 해당 없음 |
참고문헌
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
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