미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토 콘 드리 아에는 필수적인 세포 식물, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH), 플 라빈 아데닌 등 감소 화합물의 산화에서 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 가장 주목할 만한 생산에서에서 수많은 대사 경로에 관여 디뉴클레오티드 (FADH2)입니다. 애기 thaliana 게놈의 완전 한 주석으로 가장 널리 사용 되는 식물 모델 시스템, 따라서 필요 기관 (잎, 뿌리, 또는 꽃)의 다양 한에서 미토 콘 드리 아를 정화 도구를 활용 하는 데 필요한 그것을 설립 했다 그 지금 애기 미토 콘 드 리아 생물학을 공부 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다음 일련의 차등 원심 분리 단계 연속 콜 로이드 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 정화 하 고 더는 원유 미토 콘 드리 아 펠 릿 생산 방식의 다양 한을 사용 하 여 조직의 균질 하 여 미토 콘 드리 아 격리 원심 분리입니다. 콜 로이드 밀도 자료 이후 여러 원심 분리 단계에서 제거 됩니다. 100g의 신선한 잎 조직에서 시작, 미토 콘 드리 아의 2-3 mg 얻어질 수 있다 정기적으로. 이 미토 콘 드리이 아 호흡 실험 다양 한 기판 및 억제제를 사용 하 여 결정 수를 100-250 nmol O2 분-1 mg 총 미토 콘 드리 아 단백질-1 (NADH 의존 율)의 전형적인 속도 표시 기판에 산화 되는 대안 및 시 토 크롬 터미널 oxidases의 용량. 이 프로토콜 연속 콜 로이드 밀도 기울기 및 정화 식물 미토 콘 드리 아의 효율적인 호흡 측정을 사용 하 여 애기 thaliana 잎에서 미토 콘 드리 아의 격리 방법을 설명 합니다.
서론
식물 미토 콘 드리 아 연구의 역사는 100 년1다시 갑니다. 그대로 미토 콘 드리 아 처음 1950 년대 초에 고립 되었다 차등 원심 분리를 사용 하 여. 1980 년대에 콜 로이드 밀도 기울기의 출현 삼투성 조정 고통 없이 정화를 미토 콘 드리 아 수 있습니다. 그라데이션 순화 된 미토 콘 드리 아 질량 분석의 감도 때문에, 대부분의 목적을 위해 적당 한 동안 심지어 상대적으로 경미한 오염 물질 검출 될 수 있다 하 고 부적절 하 게 미토 콘 드리 아 위치2를 할당 될 수 있습니다. 둘 다 plastidic 제거 무료 흐름 전기 이동 법의 사용과 peroxisome 오염3, 하지만 무료 흐름 전기 이동 법은 고도로 전문화 된 기술 및 연구의 대부분에 대 한 필요 하지 않습니다. 또한, 그 듀얼 또는 단백질의 여러 대상으로 기억 필요 단백질의 위치를 확인할 때 셀에 발생 합니다. 100 개 이상의 듀얼 타겟된 단백질 엽록체/plastids 그리고 미토 콘 드리 아4, 미토 콘 드리 아를 표적으로 하는 단백질의 숫자에 대 한 설명 그리고 peroxisomes5알려져도 있습니다. 또한, 특정 자극, 예를 들면 산화 긴장에서 단백질의 재 위치 세포 생물학6신흥 테마입니다. 따라서, 단백질의 위치, 공부 하는 생물학의 문맥에서 고려 될 필요가 고 다양 한 접근법을 결정 하 고 위치2확인 사용 됩니다.
미토 콘 드리 아는 일반적으로 균질 하 여 식물 조직에서 분리, 균형 열 출시 미토 콘 드리 아, 세포 벽을 깨는 사이 미토 콘 드리 아를 손상 되지 필요 합니다. 전통적으로, 감자와 콜리플라워, 균질 액체 추출 버퍼 활동을 유지 하기 위해 다양 한 구성 요소를 만들기 위해 가정용 믹서 기/과즙 짜는 기구를 사용 됩니다. 완두콩 잎에서 미토 콘 드리 아의 격리 (젊은 묘 (~ 10 일)를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 인기 있는 소재 잎 소재는 부드러운 세포를 lyse를 믹서 기를 이용 한다. 애기 thaliana T-DNA insertional 노크 아웃 라인의 가용성, 미토 콘 드리 아 기능 연구를 수행을 정화 수 필요 잎, 뿌리 또는 꽃에서 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 개발을 필요한가 조직입니다. 전반적으로 다른 식물에 대 한 개발 방법을 잘7, 최적화 하는 데 필요한 재료의 연 삭 임시 수입으로 일했다. 애기가 다양 한 방법 (아래 참조)에 달성 될 수 있다 및 조직 유형 (촬영 대 루트) 사이 다릅니다. 연속 그라디언트를 사용 하 여 또한 다른 장기에서 미토 콘 드리 아의 밀도로 최적화 될 수 있습니다 또는 발달 단계 의미 그들은 다르게 마이그레이션할 수 있습니다. 따라서, 최대 분리에 대 한 그라데이션 밀도 최고의 분리를 달성 하기 위해 정제 된 수 있습니다.
일단 정화는 미토 콘 드리 아 연구, 단백질 및 tRNA 통풍 관 실험, 효소 활동 분석 실험, 호흡 수 측정 서쪽 오 점 분석 등의 다양 한 사용할 수 있습니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 단백질 풍부의 질량 분석 분석에 사용할 수 있습니다. 타겟 단백질, 정의 하지만 중요 한 분석 결과 개발 필요 여러 반응 감시 (MRM) 분석의 정량화에 대 한 수 있습니다. 반면, 디 메 틸 또는 다른 동위 원소 라벨8, 부 량 차이 식별 하는 전체 프로테옴 소설을 생물 학적 통찰력을 발견 하는 데 사용할 수 있습니다 걸쳐 발견 접근법을 제공 합니다.
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프로토콜
이 프로토콜은 애기 thaliana 장기 지속적인 콜 로이드 밀도 그라디언트를 사용 하 여 토양에 성장에서 그대로 미토 콘 드리 아의 절연에 사용 됩니다. 자료의 수집에 따라 모든 절차는 4 ° c.에 실시
1. 매체, 워시 버퍼, 그리고 그라데이션 솔루션을 연 삭의 준비
- 300 mL (마이너스 하는데와 시스테인) 중간과 표 1 당 2 x 워시 버퍼의 200 mL는 격리 이전 1 일 연 삭의 준비, 4 ° c.에서 그들을 차가운 유지
참고: 추가 나트륨 하는데 및 L-시스테인 (무료 자료) 17.84 m m와 20.36 m m의 최종 농도를 각각, 고립의 아침에 연 삭 매체. 미토 콘 드리 아 사용 하는 경우 서쪽 오 점 또는 블루 아메리카 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 분석, BSA 없이 워시 버퍼 x 2. - (그림 1 및 표 1) 미토 콘 드 리아 격리의 아침에 그라디언트를 준비 합니다.
- 두 비 커; 무 겁 고 가벼운 그라데이션 솔루션 만들기 각 35 mL 두 그라데이션 튜브에 대 한 충분 하다.
- 그라데이션 pourer 이온된 수와 PVC 연동 튜브의 챔버를 세척 하 고 모든 배관에서 배관 통해도 흐름을 보장.
- 장소 2 원심 분리기 튜브 (50 mL) PVC 연동 튜빙 콘센트와 얼음에 약간의 각도에서 튜브의 측면 아래로 그라데이션 솔루션 실행 되도록 튜브의 내부에 녹화.
- 내부 및 외부 챔버 (검은 레버 아래로) 사이의 연결을 닫습니다. 내부 챔버에 작은 파문 바 자력에 그라데이션 pourer를 놓습니다.
- 내부 챔버 (튜빙 콘센트와 챔버)에 35 mL 무거운 그라데이션 솔루션을 부 어. 절반 (300 mL/h)를 빨리 준비가 연동 펌프 속도와 남아 때까지 얼음에 배치 하는 두 개의 원심 분리기 튜브에 무거운 그라데이션 솔루션을 분배.
- 외부 챔버 (튜빙 콘센트 없이 챔버)에 35 mL 빛 그라데이션 솔루션을 부 어. 챔버 (중간을 밀어 검은 레버) 사이의 연결을 열고 부드럽게 혼합 솔루션을 허용 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 솔루션을 믹스.
- 느리게 실행 솔루션을 허용 (60 mL/h)까지 모든 그라데이션 믹스 2 인 실에서 적절는 0-4.4% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) 그라데이션 채워진 튜브. 단계 2.12에서 사용 하 여 준비까지 얼음에 그라디언트를 유지.
참고: 그라디언트, 준비 되 면 희석 세척 매체 prechilled-이온된 수와 4 ° c.에 계속 감기 1 x x 2
2. 균질 및 미토 콘 드리 아 절연
- 가 위로 토양에서 자란 4 주 된 애기 식물에서 전체 장미 티슈를 잘라, 적어도 80 식물 1 준비에 필요한 것입니다.
참고: 10-14 일 이전 물 문화, 최소 5 냄비/준비, 또는 2 주 오래 된 묘 목 4 판의 최소 重 & Skoog 기저 소금 혼합물 (MS) 한 천 배지에서 자란도 사용할 수 있습니다. - 사전 냉각된 4 ° C 대형 박격포와 유 봉 75 mL 분쇄 매체 (표 1)의에 작은 조각으로 절단 된 공장 설비 재료의 절반을 배치 하 고 조직의 더 큰 조각 남아 때까지 몇 분 동안 광범위 하 게 갈기.
- 미리 분쇄 매체와 여과 재료 (22-25 µ m 기 공 크기)의 4 층을 습식 및 500 mL 원뿔 플라스 크에 여과 소재의 플라스틱 퍼 널을 통해 4 층을 통해 homogenate를 필터링.
- 분쇄 매체의 또 다른 75 mL와 조직의 절반 남은 갈기.
- Homogenates 여과 재료에서를 결합 하 고 필터링을 통해 가능한 homogenate 만큼.
- 매체, 500 mL 원뿔 플라스 크에 다시 필터를 연 삭의 나머지 150 mL와 함께 다시 여과 재료에 남아 있는 나머지 조직 갈기.
- 5 분 동안 고정된 각도 터에 4 ° C에서 2500 x g에 8 미리 냉장된 50ml 플라스틱 원심 분리기 튜브에 필터링 된 homogenate 원심
- 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 붓고 (50ml; 녹색 펠 렛을 방해 하지 않도록) 및 고정된 각도 터에서 20 분에 17500 x g 4 ° C에서 원심 분리기.
- 삭제 모든 하지만 < 열망 하 여 상쾌한의 3 mL (또는 부드럽게 부 어는 펠 렛을 방해 하지 않고). 부드럽게 작은 좋은 붓을 사용 하 여 잔여 상쾌한에 펠 릿을 resuspend.
- 각 튜브를 워시 버퍼 x 1의 10 mL를 추가 하 고 4 튜브 1 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 결합 하 여 (즉, 2 관 인 함).
- 이러한 튜브 50 mL에 1 x 워시 버퍼를 반복 단계 2.7-2.9.
- 수영장 1 원유 미토 콘 드리 아 펠 릿 dropper를 사용 하 여 튜브와 좋은 붓으로 균등 하 게 분산 (작은 양의 워시 버퍼를 사용할 수 있습니다 그러나 마지막 볼륨 있어야 그라데이션 위에 맞게 3 mL 미만). 부드럽게 2 연속 0-4.4% (w/v) PVP 그라디언트에 스포이드와 함께 미토 콘 드리 아 서 스 펜 션 레이어.
- 무게 (워시 버퍼 x 1를 사용 하 여) 튜브를 균형 하 고 40 분 휴식 꺼져 확인 4 ° C에서 40000 x g에서 원심. 미토 콘 드리 아, 튜브의 아래쪽 밴드에 마이그레이션됩니다 또는 (흐림, 노란 밴드;으로 식별 하는 튜브의 하단에 무거운 솔루션에 있을 수 있습니다. 그림 2)입니다.
- 조심 스럽게 포부에 의해 미토 콘 드 리아 밴드 위에 솔루션의 상위 5 cm를 제거.
- 나머지 솔루션 2 깨끗 한 튜브에는 미토 콘 드리 아를 포함 하 고 워시 버퍼 x 1을 채우십시오. 플라스틱 파라핀 영화와 튜브의 입 및 여러 번 반전 하 여 콜 로이드 밀도 그라데이션 및 미토 콘 드리 아 균등 하 게 배포 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 31000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기.
참고: 원심, 전에 미토 콘 드리 아 및 나머지 콜 로이드 밀도 그라데이션 고르게 배포 됩니다 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 콜 로이드 밀도 그라데이션 튜브의 하단에 집중 하 고는 미토 콘 드리 아의 산을 방지 수 있습니다. - 포부, 채우기 1 x 세척과 튜브 버퍼링 하는 최대 50 mL와 혼합 되도록 다시 반전 하 여는 상쾌한을 제거 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 31000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기.
- 상쾌한 발음 하 고 가능한 수정 200 µ L 팁 (오픈 증가를 그것의 끝 위에 끝을 조금 잘라)는 피 펫을 사용 하 여 볼륨 (~ 500 µ L)는 미토 콘 드리 아 펠 릿에 작은 수집. 1.5 mL 튜브에는 미토 콘 드리 아를 놓고 즉시 사용 하거나-80 ° c.에 게 얼음에 계속
참고: 미토 콘 드리 아 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 사용 될 것입니다, BN-페이지, 또는 immunoblot 분석을 사용 하 여 BSA 없이 워시 버퍼 x 1 최종 세척 (즉, 단계 2.15, 2.16)에 대 한. - 브래드 퍼 드 메서드를 사용 하 여 미토 콘 드리 아의 단백질 농도 결정 합니다.
참고: BN 페이지 원심 분리기 aliquots 4 ° C, 및 사용까지-80 ° C에 게 펠 릿에 대 한. 산소 소비량 측정을 위해 유일한 갓 고립 된 미토 콘 드리 아를 사용할 수 있습니다.
3. 산소 소비 측정
참고: 산소 소비는 갓 식물 미토 콘 드리 아 클락 형 산소 전극, 미토 콘 드리 아 intactness, 시 토 크롬 c 통로 활동, 및 대체 경로 활동 활성화와 함께 분석할 수 있습니다 고립.
- 소프트웨어 설치
- 라이센스 산소 모니터링 산소 소비 측정을 위해 사용 하는 컴퓨터에 소프트웨어를 설치 합니다.
- 호흡 매체, 기판, 화학 소재 솔루션, 그리고 클락 형 산소 전극의 준비
- 호흡 매체 (300 m m 자당, 10 mM NaCl, 5mm KH2포4, 2 mM MgSO4, 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 10mm TES (pH 7.2)) 산소 소비 분석 실험에 대 한 사용을 준비 합니다.
- 기질, 억제제, 그리고 미토 콘 드리 아 호흡 (표 2)를 측정 하는 데 사용 하는 이펙터를 준비 합니다. 이러한 이전 준비 하 고 수-20 ° c.에 저장
참고: 중화 pH 7.0에 유기 산 같은 산 성 솔루션의 pH NaOH를 사용 하 여 사용 하기 전에. - 호흡 매체 분석 결과 챔버 (25 ° C)으로 동일한 온도를 따뜻하게.
- 클락-타입 산소 전극 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로 조립 한다.
- 1 공기 포화 물 (공기 포화 물 적극적으로 큰 원뿔 플라스 크에 작은 양의 이온된 수를 흔드는 여 취득) 측정 챔버에 배치 합니다. 활동가에 전환 "교 반기 속도" 버튼을 클릭 합니다. "On" 버튼을 클릭 하 고 65 rpm 교 반기 속도 설정 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다. 25 ° c.에 물을 지속적으로 저 어
- 산소 전극의 보정
- 따뜻한 물 분석 결과 챔버 (25 ° C)으로 동일한 온도 보정에 사용 됩니다.
- 안정화 하 고 보정 산소 전극 전류를 기다립니다.
- 산소 전극의 보정을 시작 하려면 "보정" 버튼을 클릭, 선택 "액체 단계 보정," 그리고 "공기 포화 물."
- 새 창 (산소 교정 (액체 단계)-5 중 1 단계)을 열 것 이다. (전극 제어 상자에 연결 되어 채널)을 보정 및 변수 (25 ° C에 "챔버 온도"와 "대기압" 101.32 kPa 설정) 입력 채널을 선택 합니다. 클릭 "OK"를 계속 합니다.
- 다음 단계 (2 단계 5) 설치 교 반기 속도 (65 rpm) 하 고 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 5 3 단계에서 고원에 도달 하는 신호를 기다립니다. 용어는 "고원 도달, 계속 하려면 확인을 눌러" 상자에 표시 됩니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 5의 4 단계에서 5 mg 나트륨 dithionite 추가 하 여 챔버에 제로 산소를 설정 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
참고: 산소 농도 감소 추적에 표시 되어야 하 고 0를 도달 한다. - 교정 (5/5 단계)의 마지막 단계에서 고원에 도달 하는 신호를 기다립니다. 용어는 "고원 도달, 계속 하려면 확인을 눌러" 상자에 표시 됩니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 보정 하기 "교정 저장"을 클릭 합니다. 새 창이 열립니다. "확인" 산소 제어 상자에 대 한 새로운 보정을 저장 하려면 확인을 클릭 합니다.
참고: 성공적인 교정 후 라벨 "산소 (nmol/mL)"는 y 축에 표시 됩니다. - 교정, 후 적절 한 청소를 보장 하기 위해 물으로 챔버 (5-10 배 이상)을 rinsing 하 여 측정 챔버를 청소. 호흡 측정으로 매체의 장소 1 mL 챔버 고 산소 소비 추적 선형 될 때까지 몇 분 동안 equilibrate를 막.
- 좋은 슬로프 뷰를 산소 소비 추적의 규모를 적응. "확대 XY"를 클릭 하 고 입력 변수 (0-"산소"를 설정 300 및 "시간 축" 0-45 분).
- 미토 콘 드 리아 무결성의 결정
- 플런저 오픈, 970 µ L 공기 포화 호흡 매체 반응 챔버를 추가할.
- 미토 콘 드리 아 절연 (총 단백질 나중 계산에 포함 될 필요가) 후 결정으로 30 µ L 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 총 미토 콘 드리 아 단백질의 150 µ g을 추가 컷 팁을 피 펫을 사용 하 여 반응 챔버를.
- 지속적으로 사용 하 여 자력 (65 rpm) 바 25 ° C에서 공기 포화 솔루션 미토 콘 드리 아 현 탁 액을 저 어.
- 플런저와 챔버 인감, 산소 소비, 기록 "녹화 시작"을 클릭 하 고 산소 소비 추적 안정 (1-2 분)을 허용.
- 10mm 하는데와 "하기 전에 세제" 속도를 5 분 동안 25 µ M 시 토 크롬 c 를 추가한 후 수동으로 산소 소비 속도 결정 합니다.
참고: 기질, 억제제, 그리고 직접 추적에에서 이펙터의 추가를, "이벤트 마크 추가" 버튼을 클릭 하 고 해당 레이블 지정을 입력 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다. - "세제" 후 속도 게 0.05% (v/v) 세제를 추가한 후 수동으로 3 분 동안 산소 소비 속도 결정 합니다. "녹음 중지"를 클릭
- "변경 테이블 요금" 버튼을 클릭 합니다. 2 커서 그래프 화면에서 세로 선으로 표시 됩니다. 클릭 하 고 끌어 속도 커서의 쌍 속도 간격을 정의 하는 추적에 필요한 위치. 왼쪽된 속도 커서를 사용 하 여 추적 따라 속도 간격을 이동 합니다. 바로 속도 커서를 사용 하 여 자체 속도 간격을 설정 합니다. 자동으로 소프트웨어를 모니터링 하는 산소 추적 따라 속도 간격 커서를 이동 하는 동안 두 개의 커서 사이 적합의 라인을 그립니다.
- 일단 원하는 속도 간격 및 위치, 정의 1 2 커서의 오른쪽 클릭으로 테이블에 속도 입력 하 고 "속도 테이블에 추가 합니다." 선택 주요 비용 테이블에는 속도 표시를 확인 하려면 "추가" 버튼을 클릭 합니다.
- 미토 콘 드 리아 무결성을 백분율로 표시 "세제" 후 속도 의해 속도 "세제" 전에 나누어 계산 하 고 100에서 빼기.
- 미토 콘 드리 아 호흡의 결정
- 플런저 오픈, 함께 반응 챔버를 공기 포화 호흡 매체의 970 µ L를 추가 합니다. 500 µ M ATP와 30 µ L 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 반응 챔버에 호흡 매체 컷 팁는 피 펫을 사용 하 여 총 미토 콘 드리 아 단백질의 150 µ g을 추가 합니다.
- 25 ° c.에 바 (65 rpm) 자력을 사용 하 여 지속적으로 미토 콘 드리 아 현 탁 액을 저 어
- 플런저를 닫습니다, 그리고 산소 소비를 기록 하 고 (때 산소 소비 추적 선형) 안정 산소 소비 속도 대 한 1-2 분 기다립니다 "녹화 시작"을 클릭 합니다. 5mm 호박을 추가 합니다. 약 2 분에 대 한 산소 소비량의 속도 기록 합니다.
참고: 기질, 억제제, 그리고 직접 추적에에서 이펙터의 추가를, "이벤트 마크 추가" 버튼을 클릭 하 고 해당 레이블 지정을 입력 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다. - 1mm 아데노신 diphosphate (ADP)를 추가 합니다. 계속 2 분에 대 한 산소 소비량의 속도 기록.
- 1mm NADH를 추가 합니다. 4-8 분에 대 한 산소 소비량의 속도 기록 합니다. 이 속도 시 토 크롬 산화 효소를 통해 호흡의 용량입니다.
- 1mm 칼륨 청산가 리 (KCN) 또는 2.5 µ M myxothiazol (5 µ M antimycin A) 시 토 크롬 c 통로 억제 하기 위해 추가 하 고 약 2 분 대체 산화 효소를 통해 산소 소비를 관찰 기록 하는 계속 해 서.
- 5 m m dithiothreitol (DTT)와 10 mM pyruvate 완전히 대체 산화 효소를 활성화를 추가 합니다. 5-7 분 대 기록에 계속: 대체 산화 효소의 용량입니다.
- 500 µ M n-틸 gallate (nPG), 추가 하 고 2 분에 대 한 기록. 이 화학적 저해 될 수 없는 잔여 산소 소비 속도 평가 합니다. 미토 콘 드리 아 기원에 될 것입니다 기록, 다른 가격에서이 속도를 뺍니다. 산소 소비 여전히 발생 하는 시 토 크롬 c 와 (KCN, nPG)에 의해 AOX 통로의 억제 후 매우 고립 된 미토 콘 드리 아9오염으로 현재 peroxidases에서 온 것입니다.
- "녹음 중지"를 클릭
- "요금 변경 테이블" 단추를 클릭 하 고 두 개의 커서 중 하나에 오른쪽 클릭으로 테이블에 속도 입력 하 고 "속도를 테이블 추가"를 선택. 주요 비용 테이블에는 속도 표시를 확인 하려면 "추가" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 때 유기 용 매에 녹아 이펙터를 추가 (예., antimycin A, nPG, myxothiazol), 약 실 및 플런저 에탄올으로 씻어 해야 합니다 및 다음 적절 한 청소를 보장 하기 위해 물.
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결과
이 프로토콜을 사용 하 여, SDS 페이지와 immunoblotting 다른 미토 콘 드리 아 단백질을 감지할 수 있었습니다. 그림 3A에서 같이, 물 문화 조직에서 분리 된 단백질은 희미 한 밴드 (2 µ g) 검출 충분 합니다. 신호 강도 로드 금액에 비례하여 증가 합니다. 절연 판 (그림 3B), 높은 가벼운 스트레스에 대 한 응답에 성장 하는 조직에서 미토 콘 드리 아에 대 한 대체 산화 효소 항 체와 immunodetection에 의해 다른 genotypes 치료를 분석할 수 있습니다.
미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 통로 활동, 대체 통로의 intactness 갓 고립 된 미토 콘 드리 아 샘플을 사용 하 여 측정할 수 있습니다....
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토론
일반적으로, 애기에서 미토 콘 드리 아의 분리 5 밀리 그램 보다 큰 수익률 자주 철저 한 연 삭으로 얻을 수 있지만 약 80-100 3-4 주 오래 된 식물에서에서 미토 콘 드리 아의 3 mg을 수익률 나뭇잎. 수확량은 성장 조건에 따라 달라진 다 고 미토 콘 드리 아 구조 노화9동안 잘 유지 될 것으로 보인다 비록 senesce, 나뭇잎으로 극적으로 감소. 좋은 수확량을 얻기 위해 가장 중요 한 기능 중 하나는 미토 콘 드리 아를 풀어 놓는 세포를 lyse 연 삭 하는 방법입니다. 다양 한 기계 연 삭 장치 구입을 위해 사용할 수 있지만, 애기에 대 한 박격포와 유 봉에서 연 삭 달성 한다 수확량, 측면에서 지속적으로 좋은 결과를으로 세포에 약간 손상 된 세포 lyses. 기계 그 라인 더 빠른 동안, 그들은 최적화를 요구 하 고 필요한 연 삭의 금액은 조직에 따라 다를 수 있습니다. 박격포와 유 봉, 그것은 종종 편리 하 고 보다 효율적인 조직 슬라이스 경우 또는 연 삭 전에 칼 ...
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공개 사항
저자는 관심의 충돌을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 오스트레일리아 연구 위원회 센터의 우수 공장 에너지 생물학 CE140100008는 호주 연구 협의회 미래 친교 (FT130100112) Feodor Lynen 연구 친교 (알렉산더 폰 훔볼트 MWM, 하에 의해 지원 되었다 재단, 독일) js.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | : 시그마 - 알드리치 | A26209 | 화학 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | : Bovogen | BSAS 1.0 | 화학적 |
| 선명도 : 서부 ECL 기판 | : Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion : stain-free 프리 캐스트 겔 : 8-16 % 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | 화학 |
| 시안화물 | : Sigma-Aldrich | 60178 | 화학 |
| 사이토크롬 c | 시그마-알드리치 | C3131 | 화학 |
| Difco 한천, 과립 | BD Biosciences | 214530 | 화학 |
| 디티오트레이톨 | 시그마-알드리치 | D0632 | 화학 |
| EDTA 이나트륨 염 | 시그마-알드리치 | E5134 | 화학 |
| Gamborg B-5 기초 매체 | 오스트라텍 | G398-100L | 화학 |
| Gamborg 비타민 용액 (1000x) | Austratec | G219-100ML | 화학 |
| 염소 안티 마우스 IgG (H + L) -HRP 접합 | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | 화학 |
| 염소 안티 토끼 IgG (H + L) -HRP 접합 | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | 화학 |
| L- 시스테인 | 시그마 | C7352-100G | 화학 |
| 황산 마그네슘 | 시그마-알드리치 | 230391 | 케미컬 |
| 무라시게 & Skoog 기초 염 혼합물 (MS) | Austratec | M524-100L | 화학 |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | 화학, 에탄올에 용해 |
| NADH Sigma-Aldrich | N8129 | 화학 | |
| Ndufs4 항체 | Etienne Meyer Meyer | et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, 에탄올에 용해 |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 화학, 콜로이드 밀도 구배 |
| 폴리비닐피롤리돈(PVP40) | 시그마-알드리치 | PVP40 | 화학 |
| 시안화칼륨 | 시그마-알드리치 | 60178 | 화학 |
| 인산칼륨 일염기성(KH2PO4) | 시그마-알드리치 | P5655 | 화학 |
| 피루브산 | 시그마-알드리치 | P2256 | 화학 |
| 염화나트륨 | Chem-Supply | SA046 | 화학 |
| 나트륨 디티오나이트 | 시그마-알드리치 | 157953 | 화학 |
| 나트륨 L-아스코르브산 | 염 시그마 | A4034-100G | 화학 |
| 숙시네이 | 시그마-알드리치 | S2378 | 화학 |
| 자당 | 화학 | SA030 | 화학 |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 화학 |
| 테트라나트륨 피로인산염(Na4P2O7 ·, 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi 니트로셀룰로오스 전사 키트 | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | 화학, 세제 |
| Western Blocking 시약 | Sigma | 11921681001 | 화학 |
| 저울 | Mettler Toledo | XS204 | 장비 |
| 비커 | Isolab | 50 mL | |
| 원심 분리기 | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | 장비 |
| 원심 분리기 튜브 | Nalgene | 3117-9500 | 장비 |
| 순환기 | Julabo | 1124971 | 부착 산소 전극 챔버 |
| 원뿔형 플라스크 | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| 고정각 로터 | Beckman Coulter | JA25.5 | 장비 |
| 깔때기 | Per Alimenti | 14 cm | 필터링 용 |
| 그라디언트 주입기 | Bio-Rad | 165-4120 | 그라디언트 준비 |
| 용 Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | 장비 |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | 여과 재료 |
| 모르타르 및 절구공 | Jamie Oliver | 화강암, 6인치 | 장비 |
| O2view | Hansatech Instruments | 산소 모니터링 소프트웨어 | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type 산소 전극 |
| 페인트 브러시 | 아티스트 첫 번째 선택 | 1008R-12 | |
| 파라 필름 | Bemis | PM-996 | 플라스틱 파라핀 필름 |
| 연동 펌프 | Gilson | F155001 | 그라디언트 준비 용 |
| PVC 연동 튜빙 | Gilson | F117930 | 그라디언트 준비 용 |
| 수조 | VELP Scientifica | OCB | 장비 |
참고문헌
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
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