Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.
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방법 논문
인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
인간의 두뇌 개발 초기 단계 확산, 마이그레이션 및 neurite 결과; 고유와 정확 하 게 조율 된 프로세스의 시리즈를 통해 진행 그리고 후기 축 삭/모 수석 파생물 및 시 냅 스 형성에 의해 특징. neurodevelopmental 장애, 종종 이러한 프로세스 중 하나 이상을 교란, 두뇌 형성과 기능에 이상이 선도. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술의 출현, 연구원은 지금 뉴런을 포함 한 거의 모든 세포 유형으로 분화 될 수 있다 인간 세포의 풍부한 공급이 있다. 이 세포는 정상적인 두뇌 개발 및 질병의 병 인 연구에 사용할 수 있습니다. HiPSCs 말기 정신병 질환 사용 모델을 사용 하 여 프로토콜 수 분화 신경 또는 3D 문화 시스템을 사용 되 나 organoids. 이러한 방법은 인간의 질병 병 인 공부에 귀중 한 입증 했다, 몇 가지 단점이 있습니다. HiPSCs 신경 세포로의 분화 및 organoids의 생성 하는 실험 및 평가 될 수 있는 변수의 수에 영향을 미칠 수 있는 긴 하 고 비용이 많이 드는 프로세스. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids 질병 관련 프로세스, 모 수석 파생물, synaptogenesis, 등의 연구를 허용 하는 동안 그들은 확산 및 마이그레이션 같은 이전 프로세스의 연구를 배제. Neurodevelopmental 장애, 자폐증, 등에서 풍부한 유전과 사후 증거는 초기 발달 과정에서 결함을 나타냅니다. 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식 세포 인구 ontogenetic 프로세스 및 질병 개시에 대 한 질문에 적합 한 모델을 수 있습니다. 우리는 지금 인간 Npc에 마우스와 쥐 대뇌 피 질의 문화에서 개발 공부에서 배운 방법론을 확장 합니다. NPCs의 사용 우리가 질병 관련 고기를 조사 하 고 어떻게 다른 변수 (예를 들어, 성장 요인, 마약) 충격 발달 과정 등 확산, 마이그레이션, 차별화 몇 일만에 정의할 수 있습니다. 궁극적으로,이 도구 집합 질병 특정 메커니즘 및 neurodevelopmental 장애에 고기 식별 하 재현성 및 높은 처리량 방식으로 사용할 수 있습니다.
서론
간단한 유기 체와 마우스 모델을 사용 하 여 기본 두뇌 개발 질병 pathogenesis의 메커니즘을 해명 했습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 많은 정신병 무질서의 병 인 간단한 유기 체에 있는 모든 발견은 인간 질병의 복잡 한 측면에 직접 관련이 있기 때문에 애매 남아 있습니다. 또한, 인간의 두뇌의 더 복잡 종종 모델 인간 개발을 어렵게 하 고 동물에 장애. 진화와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 기술의 진보와 함께 체세포 줄기 세포로 재설정 고 인간의 질병을 연구 하는 신경 세포로 분화 될 수 있습니다. (유전체학, transcriptomics, proteomics, metabolomics) hiPSCs 및 "omic" 기술의 발전 인간 두뇌 개발의 이해에 혁명을 약속 드립니다. 이러한 기술은 지금 가능 하 게 "정밀 의학" 접근에 사건-의해-사건을 기준으로 정신병 질환의 특성에.
HiPSC 질병-모델링 분야에서 현재 주식은 특정 신경 하위는 단층으로 세포 분화 하거나 두뇌 개발1,2,의 측면을 정리 하는 organoid 라는 3D 문화 시스템을 사용 하 3
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프로토콜
1. 안전 절차 및 Biosafety 내각 유지 보수
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Biosafety 수준 2 (BSL-2) 안전 절차
- BSL-2 재료 작업에 기관의 지침에 따라. 기관의 관행에 따라 BSL-2 자료는 삭제 합니다. 객실과 BSL-2 재료에 사용 되는 장비를 나타냅니다. 모든 개인 보호 장비 (PPE), 실험실 코트와 장갑 등을 착용 합니다.
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Biosafety 내각 유지 보수
- Biosafety 내각 BSL-2 레벨 재료의 사용에 대 한 인증을 사용 합니다.
- 표면 10% 표 백제 솔루션 다음 스프레이 적어도 15 분 동안 캐비닛는 biosafety에 UV 빛을 켜고. 허용 15 분 동안 앉아, 캐비닛, 아래로 닦 고 사용 하기 전에 공기를 켭니다 하 표 백제 솔루션.
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방사성 Tritiated [3H]-티 미 딘 (트리 티 움) 안전 절차
참고: 트리 티 움은 카테고리 5 방사성 소스, '가장 가능성이 위험' 카테고리. 방사능 작업에 대 한 기관의 지침에 따라. 일부 기관 인증 해야 하거나 움 처리를 허용 합니다.- 제대로 ....
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결과
이러한 연구의 한 목표 Npc, 즉, 셀 숫자 증가의 증식 활동을 정의 하는. 이것은 전체 세포 인구 세포 추출 물에 방사성 추적 tritiated 티 미 딘의 설립이 고 그들이 인지 S 단계에 종사 하는 모든 셀을 반영 하는 높은 처리량 접근 방식의 DNA 합성을 평가 함으로써 얻을 수 5 분 또는 전체 2 시간에 대 한 합성. 또한, 이러한 분석 실험 S-위상 및 총 세포 숫자, 단일 셀의 더 노동 집약적인 분석 결과 입력 하는 셀의 비율의 결정을 수 있습니다. 세포는 유사 분열 및 세포 분열, 세포 수를 증가 하기 위하여 발생 한다 앞 단계 S 단계에서 DNA 음성 합성. 이러한 프로세스에는 시간이 좀 걸릴, 이후 48 시간에서 평가 하는 DNA 합성에 변화 변화이 시간 포인트에서 핸드폰 번호에 연결 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 48 시간에서 DNA 합성에 변화 안정적으로 4-6 일에 세포 수의 증가 예측 발견 되었다.
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토론
여기에 제시 된 프로토콜 기본 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하 고 성장 인자와 약물 hiPSC 파생 신경 선구자 세포를 사용 하 여 테스트를 신속 하 고 간단한 방법을 설명 합니다. hiPSC 기술 사는 영향을 받는 개인에서 인간의 신경 세포를 전례 없는 접근 제공 하 여 neurodevelopmental 질병의 병 인 연구를 혁명을 했다. 실제로, 레트 증후군, 티 모 증후군, 연약한 X 증후군을 포함 한 neurodevelopmental 장애의 수많은 hiPSC 연구 되었습니다 및 정신 분열 증, 질병 특정 차 모 수석에서 출토 있다, synapses, 그리고 신경 기능4,33,,3435,36. 이러한 연구의 대부분.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 의료 연구 및 치료의 자폐증 (CAUT13APS010;에 대 한 뉴저지 주지사의 위원회에 의해 지원 되었다 CAUT14APL031; CAUT15APL041), 낸시 Lurie 표시 Mindworks 자선 리드 신뢰, 가족 재단과 큰 보스턴과 뉴저지의 유태인 공동체 기초.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PSC 신경 유도 매체 : 프로토콜 링크 : https://goo.gl/euub7a | ThermoFischer Scientific | A1647801 | 이 키트는 NB(Neurobasal) 배지와 50x NIS(Neural Induction Supplement)로 구성되어 있습니다. NIS는 1X 신경 유도 매체 및 100% 확장 매체 |
| 고급 DMEM/F12 매체 | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | 구성 요소 100% 확장 매체 |
| Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | NIM 및 100% 확장 매체 구성 요소를 |
| hESC 인증 Matrigel | Corning 354277 | hESC 인증 세포외 기질-모방 겔 (ECM-mimic gel) | |
| Y-27632 (2HCl), 1 mg | 줄기세포 기술 | 72302 | ROCK 억제제 |
| 6 웰 플레이트 | Corning | COR-3506 | 폴리스티렌 플레이트는 NPC 유지 보수 및 신경구 이동 분석에 사용됩니다 |
| 24웰 플레이트 | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | 폴리스티렌 플레이트: NPC DNA 합성 분석에 사용 |
| 35mm 접시 | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | 폴리스티렌 플레이트: NPC S-상 진입 및 신경석염 분석에 사용 |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | 코팅 플레이트용 기질: NPC DNA 합성, S-상 진입 및 세포 수 분석 |
| 에 사용코팅 플레이트용 Fibronectin | Sigma F1141 | 기판: Neurite Assay에 사용 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | 코팅 플레이트용 기판 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | ThermoFischer Scientific | 15140122 | 항생제, NIM 구성 요소, 100% 확장 및 30% 확장 미디어 |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X 세포 분리 솔루션 |
| 2.5% 트립신(10X) | Gibco | 15090-046 | 10X 효소 용액 |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | DNA 합성 분석을 위한 세포 리프팅용 트립신 용액에 사용 |
| 트리티화 [3H]-티미딘 | PerkinElmer | NET027E001 | 방사성 삼중수소, 티미딘 |
| Fisherbrand 7mL HDPE 섬광 바이알 | Fisherbrand | 03-337-1 | 액체 섬광 계수용 바이알 |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | 리퀴드 신틸레이션 칵테일 |
| LS 6500 다목적 액체 섬광 카운터 | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | 액체 섬광 카운터 |
| Skatron 반자동 세포 수확기 유형 11019 | 분자 장치 및 스카트론 인스트루먼트, Inc. | 반자동 세포 수확기 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 이미징 키트 | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU 및 S-Phase Entry Assay |
| 용 염색 키트 Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | 세포의 생존력 평가 |
| Grade GF/C 여과지 | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | 유리 섬유 여과지 |
| 인간 기본 FGF-2 | Peprotech | 100-18B | 성장 인자 |
| 뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | 뉴로펩티드 |
참고문헌
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).<....
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재인쇄 및 허가
