인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

요약

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

초록

인간의 두뇌 개발 초기 단계 확산, 마이그레이션 및 neurite 결과; 고유와 정확 하 게 조율 된 프로세스의 시리즈를 통해 진행 그리고 후기 축 삭/모 수석 파생물 및 시 냅 스 형성에 의해 특징. neurodevelopmental 장애, 종종 이러한 프로세스 중 하나 이상을 교란, 두뇌 형성과 기능에 이상이 선도. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술의 출현, 연구원은 지금 뉴런을 포함 한 거의 모든 세포 유형으로 분화 될 수 있다 인간 세포의 풍부한 공급이 있다. 이 세포는 정상적인 두뇌 개발 및 질병의 병 인 연구에 사용할 수 있습니다. HiPSCs 말기 정신병 질환 사용 모델을 사용 하 여 프로토콜 수 분화 신경 또는 3D 문화 시스템을 사용 되 나 organoids. 이러한 방법은 인간의 질병 병 인 공부에 귀중 한 입증 했다, 몇 가지 단점이 있습니다. HiPSCs 신경 세포로의 분화 및 organoids의 생성 하는 실험 및 평가 될 수 있는 변수의 수에 영향을 미칠 수 있는 긴 하 고 비용이 많이 드는 프로세스. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids 질병 관련 프로세스, 모 수석 파생물, synaptogenesis, 등의 연구를 허용 하는 동안 그들은 확산 및 마이그레이션 같은 이전 프로세스의 연구를 배제. Neurodevelopmental 장애, 자폐증, 등에서 풍부한 유전과 사후 증거는 초기 발달 과정에서 결함을 나타냅니다. 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식 세포 인구 ontogenetic 프로세스 및 질병 개시에 대 한 질문에 적합 한 모델을 수 있습니다. 우리는 지금 인간 Npc에 마우스와 쥐 대뇌 피 질의 문화에서 개발 공부에서 배운 방법론을 확장 합니다. NPCs의 사용 우리가 질병 관련 고기를 조사 하 고 어떻게 다른 변수 (예를 들어, 성장 요인, 마약) 충격 발달 과정 등 확산, 마이그레이션, 차별화 몇 일만에 정의할 수 있습니다. 궁극적으로,이 도구 집합 질병 특정 메커니즘 및 neurodevelopmental 장애에 고기 식별 하 재현성 및 높은 처리량 방식으로 사용할 수 있습니다.

서론

간단한 유기 체와 마우스 모델을 사용 하 여 기본 두뇌 개발 질병 pathogenesis의 메커니즘을 해명 했습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 많은 정신병 무질서의 병 인 간단한 유기 체에 있는 모든 발견은 인간 질병의 복잡 한 측면에 직접 관련이 있기 때문에 애매 남아 있습니다. 또한, 인간의 두뇌의 더 복잡 종종 모델 인간 개발을 어렵게 하 고 동물에 장애. 진화와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 기술의 진보와 함께 체세포 줄기 세포로 재설정 고 인간의 질병을 연구 하는 신경 세포로 분화 될 수 있습니다. (유전체학, transcriptomics, proteomics, metabolomics) hiPSCs 및 "omic" 기술의 발전 인간 두뇌 개발의 이해에 혁명을 약속 드립니다. 이러한 기술은 지금 가능 하 게 "정밀 의학" 접근에 사건-의해-사건을 기준으로 정신병 질환의 특성에.

HiPSC 질병-모델링 분야에서 현재 주식은 특정 신경 하위는 단층으로 세포 분화 하거나 두뇌 개발^1,2,^{의 측면을 정리 하는 organoid 라는 3D 문화 시스템을 사용 하 3}. 이러한 시스템은 엄청나게 공부 하 고 인간의 개발 및 질병^4,5,,67의 독특한 측면을 잠복 근무에 귀중 한 되었습니다. 그러나, 신경 문화와 organoids 종종 필요 어디서 나 주에서 문화에서 개월 공부 준비가 되기 전에. 이러한 프로토콜의 이러한 문화 시스템 자주 수행 될 수 있는 실험의 수 및 테스트할 수 있는 성장 요인 또는 (마약) 처럼 변수 수 제한 유지 하는 데 필요한 리소스의 양을 소모 자연. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids를 이용 하 여 많은 연구 개발에서 나중에 발생 하는 모 수석 파생물 또는 시 냅 스 형성, 등의 프로세스에 집중 했다. 이러한 프로세스 발달 장애 자폐증과 정신 분열 증 등의 병 리에 연루 되어, 이전 확실 한 신경 분화 하기 전에 발생 하는 개발 이벤트는 질병 병 인^{8에 대 한 중요 한 ,,910,11,,1213}. 실제로, 최근 게놈 연구 보여줍니다 확산, 프로세스 파생물 및 마이그레이션 구성 되어, 중반에 태아 기간 자폐증 pathogenesis^11,14에서 특히 중요 하다. 따라서, 신경 줄기와 조상 세포 인구 이러한 이전 프로세스를 보다 잘 이해 하려면 공부 하는 것이 중요 하다. Organoid 시스템을 더 나은 간주 정리 인간의 두뇌 개발 3D 자연 조직된 구조 때문에, 이러한 이전 이벤트의 일부 연구 활용 되어 조상 수영장을 포함지 않습니다. 그러나, organoids에 조상 인구 종종 스파스 이며 신경 줄기 또는 조상 세포^5,15보다 광선 glial 세포 처럼. 따라서, 그것은 neurodevelopment 적극적으로 증식 세포 인구에서의 초기 단계를 공부 하는 높은 처리량 방법을 도움이 될 것 이다.

연구실에서 우리 hiPSC 파생 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식, 확산, 세포 이동 등 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하는 신경 줄기와 조상 세포의 혼합된 인구를 사용 하는 프로토콜을 만들었습니다 그리고 초기 프로세스 (neurite) 확장입니다. 이 분석 실험은 성공적으로 쥐와 쥐 대뇌 피 질의 문화^{16,17,,1819,20, neurodevelopment 공부를 수십 년 동안 우리가 실험실에서 사용 되는 기술에서 개발 되었다 21,,2223}. 중요 한 것은, 그것은 또한 고기 및 쥐 및 마우스 문화 시스템에 정의 된 규정 신호는 매우 활성 vivo에서, 이러한 기술을^16, 의 값을 나타내는 메커니즘의 예측 표시 했다 ^17,18,,1924. NPCs에 hiPSCs의 초기 분화 후 이러한 방법을 수 일의 문제에 중요 한 발달 과정을 연구. 이러한 방법에는 많은 이점이 있다: (1) 그들은 약간 정교한 장비가 필요 하 고 구현 하기 쉬운, (2) 수많은 실험적인 복제 시간, 결과, 그리고 (3)의 재현성의 빠른 확인을 위해 수 있도록 짧은 기간에 지휘 될 수 있다 신속 하 고 비용 효율적으로 코팅 행렬, 성장 요인의 효과 약물의 활동 문화 변수를 테스트할 수 있습니다. 또한, 우리 확고 역할 extracellular 성장 요인의 다양 한 개발 프로세스의 중요 한 레 귤 레이 터의 활용. NPCs는 직접 확산, neurite 결과, 및 셀 마이그레이션 같은 이벤트를 자극 하 고 그들은 제어 조건¹⁹ 에 명백한 되지 않은 결함을 식별 하는 기능을 강화 하는 것을 발견 했다 발달 신호 선택에 노출 됐다 ^{, 25 , 26 , 27 , 28}. 마찬가지로, 약물 평가의 용이성 제공 다양 한 치료 적 개입의 효율성을 테스트할 정밀 의학 기술을 채택 하는 강력한 애비뉴. 따라서,이 프로토콜은 재현성, 높은 처리량 및 초기 두뇌 발달, 질병의 병 인, neurodevelopmental 고기에 성장 요인 및 약물의 잠재적인 유익한 효과 공부 하 고 간단한 방법론을 촉진 한다.

프로토콜

1. 안전 절차 및 Biosafety 내각 유지 보수

1. Biosafety 수준 2 (BSL-2) 안전 절차
   1. BSL-2 재료 작업에 기관의 지침에 따라. 기관의 관행에 따라 BSL-2 자료는 삭제 합니다. 객실과 BSL-2 재료에 사용 되는 장비를 나타냅니다. 모든 개인 보호 장비 (PPE), 실험실 코트와 장갑 등을 착용 합니다.
2. Biosafety 내각 유지 보수
   1. Biosafety 내각 BSL-2 레벨 재료의 사용에 대 한 인증을 사용 합니다.
   2. 표면 10% 표 백제 솔루션 다음 스프레이 적어도 15 분 동안 캐비닛는 biosafety에 UV 빛을 켜고. 허용 15 분 동안 앉아, 캐비닛, 아래로 닦 고 사용 하기 전에 공기를 켭니다 하 표 백제 솔루션.
3. 방사성 Tritiated [³H]-티 미 딘 (트리 티 움) 안전 절차
   참고: 트리 티 움은 카테고리 5 방사성 소스, '가장 가능성이 위험' 카테고리. 방사능 작업에 대 한 기관의 지침에 따라. 일부 기관 인증 해야 하거나 움 처리를 허용 합니다.
   1. 제대로 처리 하 고 트리 티 움의 처분 방법에 교육 기관에서 교육을 받을 수 있습니다. 기관의 정책에 따라 적절 한 그릇에 방사성 폐기물의 처분. 트리 티 움 작업할 때 보호구를 착용 하십시오.

2. 신경 유도 Ipsc에서

참고: Npc 수 있도록, 상업적으로 이용 가능한 신경 유도 키트를 함께 제공 하는 프로토콜의 약간 수정된 된 버전 뒤를 이었다. Neurobasal (NB) 미디어와 신경 유도 보충 (NIS), 신경 유도 매체 (님) x 1을 확인 하는 데 사용 되는 x 50 키트에 의하여 이루어져 있다. NIS는 또한 100% 확인 하는 데 사용 됩니다 확장 매체 (섹션 3.1 참조). 프로토콜에 대 한 링크 자료와 장비 및 참조 섹션⁴³에서 발견 된다.

1. 70-80% 합칠 때에 Ipsc를 통과
2. 플레이트 300000 Ipsc hESC 자격의 1 세포 외 매트릭스-모방 젤 (ECM 모방 젤) 코팅 6 잘 플레이트 락 억제제의 5 μ M와 iPSC 공급기 무료 매체의 2 개 mL를 포함 하. ECM 모방 젤 코팅 우물에 섹션 3.2 참조 하십시오.
3. 언젠가 나중에, iPSC 매체 + 1 x PBS와 한 번 록 제와 워시 Ipsc 제거 합니다. Ipsc를 님의 2 개 mL를 추가 합니다.
   참고: 님의 50 mL NB 미디어의 49 mL를 국정원과 페니실린/스 (P/S)의 250 µ L (단위/50ml, 5 μ/mL) x 50의 1 mL을 추가 하 여 이루어집니다.
4. 신경 유도 발음 하 여 매 2 일 변경 미디어 매체와 님의 2 mL와 함께 교체 셀 confluent 된다 (약 4-5 일)까지 보냈다. 일단 셀 confluent 미디어를 매일, 변경 합니다.
5. 님에 ECM 모방 젤으로 접시 7 일 후 통과 셀 100% 확장 미디어, 5 μ M 바위 억제제의 2 개 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트 코팅. 셀 통로 0 (P0) 여겨진다 NPCs이 시점에서. 100% 확장 미디어를 만들기 위해 지침에 대 한 아래 섹션 3.1을 참조 하십시오.
6. 통로 셀 부분에 설명 된 방법을 사용 하 여. 셀 P2에 도달 되며 confluent NPC 마커 및 도금 실험 (그림 1)에 대 한 얼룩을 해리 하기 전에 때까지 기다립니다.

3. 문화 미디어, 코팅, 및 Npc의 유지 보수

1. Npc (100% 확대 미디어)의 유지 보수에 대 한 미디어 준비:
   1. NB.의 24.5 mL과 DMEM/F12의 24.5 mL을 결합 하 여 100% 확장 미디어의 50 mL를 만들기
   2. DMEM/F12 + NB 솔루션 50 x NIS의 1 mL를 추가 합니다. 미디어를 250 μ P/S 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 미디어 냉장된 (4 ° C) 수 있으며 최대 2 주 동안 사용. DMEM의 볼륨을 조정 하 여 미디어의 작은 볼륨을 만들 수 있습니다 / F12 + NB + 국정원 50 mL 볼륨에 관해서는 동일한 비율을 사용 하 여.
2. ECM 모방 젤의 준비 NPC 유지 보수에 대 한 문화 플레이트 코팅
   1. 작업 솔루션의 6 mL를 만드는 데 필요한 볼륨에서 aliquot ECM 모방 젤. ECM 모방 젤 희석 요인 때문에, 인증서 분석 시트를 보면 aliquot 볼륨 일괄 처리에서 일괄와 많은 많은 변화를 계산 합니다.
   2. 얼음에는 ECM 모방 젤 약 수를 해 동 하 고 찬 DMEM/F12 미디어의 6 mL로.
   3. 6 잘 플레이트의 각 음에 ECM 모방 젤/DMEM/F12 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 6 잘 플레이트 솔루션과 ECM 모방 젤-37 ° c.에 30 분 동안 품 어
   4. 외피의 30 분 후 ECM 모방 젤 솔루션을 발음 하 고 100% 확장 미디어 대체 하거나 접시를 냉장 보관 (4 ° C, 최대 1 주) ECM 모방 젤-솔루션을 발음 하지 않고.
3. NPCs의 유지 보수
   1. 플레이트 NPCs 젤 코팅 잘 100% 확장 미디어의 2 개 mL를 포함 하는 ECM 모방으로 1.5 백만 셀의 밀도.
   2. 5% CO₂와 습 한 환경에서 37 ° C에서 Npc를 품 어.
   3. NPCs P3 또는 낮은, 또는 과도 한 세포 죽음을 방지 하기 위해 해 동된 NPCs 미디어 락 억제제의 5 μ M를 추가 합니다. 바위 억제제를 제거를 24 h 후 미디어를 변경 합니다.
   4. 통로 셀 confluent 될 때에 따라 4-9 일 마다. 밀도가 포장된 단층 접시 표면 전체 바닥을 커버 될 때 셀 confluent 간주 됩니다.
   5. 6 잘 플레이트 한 우물 당 1 1.5 백만 셀의 밀도에서 Npc를 접시 (부분 참조). 지출된 미디어 모든 48 h를 제거 하 고 100% 확장 미디어의 2 개 mL를 바꿉니다.
4. 리프트, 해리, 및 실험 조건에 대 한 유지 보수 및 도금 NPCs를 펠 렛
   1. 중간, 세척 셀 한번 1 x PBS와 발음 PBS를 발음 하 고 confluent NPCs. 품 37 ° c.에서 10 분의 1로 500 μ 1 x 셀 분리 솔루션의 추가
   2. 실 온 (RT) PBS의 500 μ를 추가 하 고 잘 사용 P-1000 피펫으로 세포의 제거를 위해 세척. 15 mL 원뿔 튜브로 셀 + PBS 솔루션을 수집 합니다. 1 mL의 PBS로 다시 접시를 세척 하 고 튜브에 액체를 추가 합니다.
   3. 펠 렛을 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
   4. 셀 펠 릿에서 상쾌한을 제거 하 고 다시 미리 따뜻하게 DMEM/F12 미디어의 1-5 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 세포 미디어의 1 4 백만 셀/mL의 조밀도를 희석. 계량 한 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
   5. 플레이트의 NPC 유지 보수 (섹션 3.3) 또는 (대 한 자세한 내용은 다음 섹션을 참조) 실시 되 고 개별 분석 결과 대 한 특정 셀의 필요한 수.
   6. 15 ~ 100 μ 셀의 사이 각 잘/요리 사용 됩니다 셀 서 스 펜 션 볼륨 미디어를 조정 합니다. 이 작은 도금 볼륨도 셀 배포는 성장 요인, 약물, 또는 매체에 기판 하지 희석 하면 됩니다.
   7. 37 ° c.에 세포를 품 어 미디어 NPC 유지 보수에 대 한 모든 48 h를 변경 하거나 개별 분석 실험에 대 한 특정 세부 정보를 참조 하십시오.
5. 실험 조건 (30% 확장 미디어)에 대 한 미디어 준비
   1. 70%로 100% 확장 미디어를 희석 (30% 되 나 확장) 1:1 DMEM/F12 + NB 솔루션 실험 조건에 대 한 미디어를 추가 하 여.
   2. 6 mL 100% 확장 미디어의 추가 및 7 mL NB의과 DMEM/F12 미디어의 7 mL로 희석 하 여 20 mL의 30% 확장 미디어를 확인 합니다. P/S 솔루션의 5 µ L/mL를 추가 합니다.
      참고: 100% 미디어 P/S 이미 있으면 추가 결합 DMEM 대 5 μ/mL / F12 + NB (14 mL) = (5 μ/mL) x 100µL 대신 P/s 70 μ =.
   3. 원하는 농도 30% 확장 미디어에서 코팅 기판 및 성장 요소를 추가 합니다.

4. 평가 DNA 합성, S 단계 항목 및 Npc의 핸드폰 번호

1. DNA 합성, S 단계, 및 셀 번호 시험 준비
   1. DH₂O에서에서 폴 리-D-리 (PDL)의 1 mg/mL 재고 솔루션을 만들고 필터를 소독. DH₂O 0.1 mg/mL PDL 솔루션으로 만들기를 하 고 300 μ 35 mm 접시에 1 mL 또는 24 잘 플레이트의 각 음에에서 1시 10분 희석. 실시간에서 20 분 동안 품 어
   2. PDL 웰 스 dH₂O. Aspirate dH₂O 5 분 동안 3 번 세척 하 고 300 μ/잘 또는 1 mL/접시 laminin (5 μ g/mL) 1 x PBS에 희석의 추가. Parafilm으로 접시를 커버 하 고 RT (12 ~ 24 h)에서 하룻밤 캐비닛 살 균, biosafety에 유지.
   3. 12 ~ 24 h. 추가 차량, 성장 인자, 또는 볼륨을 30%에서 NIS를 diluting 피하기 위해 총 솔루션의 10% 미만에서 원하는 농도에 대 한 관심의 약 30% 확장 미디어 (섹션 3.5 참조)를 준비 확장 매체.
   4. 각 씻어 24 잘 플레이트 1 x PBS (각 5 분)와 두 번의 잘. 1 x PBS를 발음 하 고 미디어 (없이 또는 약/성장 인자)의 450 μ를 추가 합니다. 셀을 도금 하기 전에 적어도 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
   5. 각 실험에 대 한 2-3 웰 스 또는 요리 당 상태를 설정 합니다.
   6. 플레이트 NPCs (부분 참조):
   7. 24 잘 플레이트에 셀/잘 NPC DNA 종합 분석 결과: 100000
   8. S 단계 항목: 500, 000 셀/35 m m 접시
   9. 셀/잘 24-잘 접시에에서 셀 번호 분석 결과: 50000
2. 신경 선구자 세포 DNA 종합 분석 결과
   1. 100000 셀/24-잘 접시에 잘 접시 및 3 중/상태에서 평가.
   2. 추가 방사성, tritiated [³H]-46 h 문화에 후 각 잘에서 배양 (1.5 μCi/mL)에 티 미 딘. 셀 h 2에 대 한 37 ° C에서 품 어.
      참고: 때 방사성 물질을 사용 하 여, 기관, 따라 방사능 안전 프로토콜, 그리고 적절 하 게 지정된 폐기물 저장소에서 방사성 물질의 dispose에서 교육을 받을.
   3. 제거 제대로 각 우물에 방사성 미디어의 2 h. 추가 300 μ는 0.25 %trypsin-EDTA (0.5 m m)에 미리 예 열 후 처분 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어
   4. 셀 수확기에 설정 (재료 및 장비 참조 섹션)와 펌프 펌프 압력이 200 PSI 아래 인지 확인 하 고. 셀 수확기에 공간을 통해 필터 종이 놓고 용지 방향 표시 하려면 오른쪽 모서리에서 눈물.
   5. 빈 "빈" 트레이 셀 수확기의 수집 튜브를 삽입 하 고 필터 종이 축 축 하 게 prewash를 누릅니다. 샘플 우물에 수집 튜브를 놓고 (시작)을 실행 합니다.
   6. 셀 수확기 샘플 수집 완료 되 면, 모든 샘플 집합에 대 한 반복을 클램프 및 사전 필터 종이 들어올립니다. 항상 빈, "빈" 접시에 prewash.
   7. 광원에서 필터 종이 건조 하 고 쟁반에 해당 튜브를 설정 합니다. 종이 투표용지 튜브로 밖으로 펀치 하 고 각 유리병에 액체 섬광 칵테일의 2 개 mL를 추가 합니다. 캡 및 레이블 튜브입니다.
   8. 액체 섬광 섬광 기계에 (CPMs) 분당 수 읽기 전에 적어도 1 시간에 대 한 칵테일에 튜브를 품 어.
3. NPC S 단계 항목 분석 결과
   1. 참고 섹션 단계 리프트, 해리, 작은, 및 다시 셀을 일시 중단.
   2. 섹션 4.1,이 단계에 대 한 단 1 접시/조건에에서는 35mm 요리에 접시 당 500000 세포를 플레이트.
   3. 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 모든 방향에서 이리저리 요리를 교 반 하십시오. 셀 46 h 37 ° C에서 품 어.
   4. 준비 후 24 h 조건 당 PDL/Laminin 코팅 3 35 mm 판. 예를 들어 30% 확장 미디어의 한 35mm 접시와 30% 확장 미디어 + FGF의 1 35 mm 접시 (10 ng/mL) 다음 다음 날에 사용 하기 위해 6 PDL/Laminin 플레이트 코트.
   5. 2 h 46 헤 품 후 문화를 5mm 듀의 2 μ/mL를 추가 합니다.
   6. 해리 그리고 작은 셀 (부분 참조). 다시 3 mL의 30% 확장 미디어 또는 30% 확장 미디어 + 원하는 성장 인자/약 3 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
   7. 플레이트 미리 코팅된 PDL/Laminin 요리에 접시 당 1 mL. 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 모든 방향에서 이리저리 요리를 교 반 하십시오. 접시에 셀 수 있도록 2 h 37 ° C에서 품 어. 단순화 된 타임 라인에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오.
4. S 단계 항목 분석
   1. 얼음 4% 요리 해결 Paraformaldehyde (1 x PBS에 PFA) 20 분. 다음, 3 번 1 x PBS 가진 5 분 동안 요리를 씻어.
   2. 0.05 %1 x PBS의 1 mL을 추가 세균 및 곰 팡이 성장을 방지 하기 위해 나트륨 아 지 드. 셀 경우 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 6 개월 (parafilm으로 밀봉) 요리 PBS + 나트륨에 지켜진다 아 지 드 솔루션, 비록 모든 면역 항은 잘 보존 된 분석에 있는 긴 지연 후.
   3. 상업적인 듀 반응을 사용 하 여 셀 시험 키트 (제조 업체의 프로토콜 참조). DAPI 또는 다른 핵 마커를 사용 하 여 셀을 얼룩 그리고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지.
   4. 10 체계적으로 임의의 필드 (10 배)의 총 라이브 셀 (전체 휴대폰 번호) 맹인에 듀 긍정적인 세포의 비율을 평가 합니다. 분석에서 죽은 세포를 포함 하지 마십시오.
   5. 단계 대조 이미지 및 형광 이미지 긍정적인 듀 얼룩을 확인 하 고 확인 셀은 죽은 또는 살아 (그림 3)를 사용 합니다.
   6. 수 있는 모든 셀 모두 부드러운도 위상 대비 설정에서 세포 막 그리고 형광 DAPI 핵에 의해 큰 조각난된 핵 얼룩, 이러한 셀 (3A 그림-B) 살고 있다.
   7. 밝은 단계 모든 셀 제외 부러진된 고르지 세포 막 있고 DAPI 형광 이미징,이 세포는 죽은 (그림 3A-B)에 의해 시각으로 작은, 압축 된 핵을가지고. 밝은 형광 듀 취재 전체 핵 또는 핵 (그림 3C)에 얼룩 덜 룩 한 형광 얼룩 얼룩 있는 셀을 식별 하 여 듀의 표현에 대 한 라이브 셀을 평가 합니다.
5. NPC 셀 번호 분석 결과
   1. 2 일 후에 문화, 라벨 그리고 microcentrifuge 튜브 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 0.5 mL를 준비. 각 0.5 mL 튜브에 Trypan 파랑의 5 μ를 추가 합니다.
   2. 24 잘 플레이트의 각 잘 제거 매체를 10 ~ 15 분 동안 인큐베이터에서 셀 분리 솔루션 및 장소 x 1의 200 μ를 추가 합니다.
   3. 할당 된 시간 후 세포가 해제 되 면 각 음을 1 x PBS의 원하는 금액을 추가 합니다.
      참고: 일반적으로, 하루에 2, 추가 300 μ 1 x PBS의 잘 포함 셀 플러스 500 μ의 전체 볼륨에 대 한 분리 솔루션의 200 μ. 추가 문화 보육 시간, 셀 더 confluent 되, 필요에 따라 희석 볼륨 증가. 예를 들어 하루 4, 500 μ 주 6에 PBS, x 1의 추가, 800 μ 1 x PBS의 추가. 총 볼륨 700 μ 및 1 mL, 각각 될 것입니다.
   4. P-1000 피 펫을 사용 하 여, 위쪽 및 아래쪽 셀을 제거 하 5 번에 잘 각 4에서 플라스틱. 모든 세포가 분리 되도록 현미경 접시를 검사 합니다. 1.5 mL 튜브에 세포를 전송.
   5. 2 ~ 3 배 희석 셀 1.5 mL 튜브 반전. 그렇다면 50 μ 튜브의 중간에서 셀의 aliquot 고 Trypan 파랑 0.5 mL 튜브에 추가 (4.5.1 참조).
   6. 2-3 번 왔다 갔다 피 펫 셀 솔루션. hemocytometer에 셀을 추가 하 고 즉시 분석. 이상 10 분 세포 죽음 또는 Trypan 파랑 찍은 셀의 존재 증가 시킬 수 있습니다에 대 한 기다리고 있습니다.
   7. 신중 하 게 복제 계산을 수행 하기 위해 hemocytometer의 각 측에 10 µ L 셀 + Trypan 블루 혼합물을 추가 합니다. 단계 대조 현미경을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 죽은 세포 또는 Trypan 파랑 찍은 어두운 파란색 세포를 포함 하지 않습니다.
   8. 평균 총 셀 번호, 사용을 얻기 위해 휴대폰 번호는 hemocytometer의 4 구석에 서 계산 하 고 다음 방정식을 적용:
      미디어 볼륨 (mL) x 10,000 x 셀 번호 의미 = 총 셀 수/잘
   9. 발음 하 고 나머지 우물에서 절차를 반복 합니다. 미디어 계산 되지 않습니다 되 고, 모든 48 h. 반복 분석 결과 일 4 & 6 셀을 변경 합니다.

5. NPC Neurite 분석 결과

1. Neurite 분석 결과 대 한 요리와 미디어 준비
   1. DH₂O에서에서 폴 리-d-리 (PDL)의 1 mg/mL 재고 솔루션을 만들고 필터를 소독. DH₂O 0.1 mg/mL PDL 솔루션을 만들고 각 35 mm 접시에 1 mL을 추가 하기 1시 10분 희석. 실시간에서 20 분 동안 품 어
   2. 한편, 30% 확장 미디어 (섹션 3.5 참조)를 준비 하 고 미디어 Fibronectin 솔루션 (재고 1 mg/mL)의 5 μ g/mL (5 µ L/mL)를 추가 합니다.
   3. 미디어가 준비 되 면 원하는 농도에서 차량, 성장 인자, 또는 관심의 약물을 추가 합니다.
      참고: 최고의 차량, 성장 인자, 또는 마약, 볼륨에 추가 하는 <는 fibronectin 및 30% 확장 매체의 다른 구성 요소를 diluting 하지 않으려면 솔루션의 10%.
   4. 20 분 후 3 번 dH₂O 초과 PDL를 제거 하려면 5 분 동안 PDL 요리 세척. 요리는 미디어를 추가 하기 전에 건조를 확인 합니다.
   5. 각 PDL 코팅된 접시에 미디어 (또는 약/성장 인자 없이) + Fibronectin 솔루션의 1 mL를 놓습니다.
   6. PDL에는 Fibronectin의 적절 한 첨부 되도록 셀을 도금 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 요리를 품 어.
   7. 각 실험에 대 한 조건 (예를 들어, 3 차량 포함 된 요리, 3 약물 포함 된 요리) 당 2-3 접시를 설정 합니다.
2. NPCs Neurite 분석 결과 대 한 도금
   1. 참고 섹션 단계 리프트, 해리, 작은, 및 셀을 resuspend.
   2. 섹션 5.1에서 준비 하는 요리에 접시 당 50000 세포를 플레이트. 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 모든 방향에서 이리저리 요리를 교 반 하십시오.
   3. 48 h에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어.
3. Neurites의 분석
   1. 48 h에 대 한 셀을 잠복기 후 매체, 발음 및 해결 요리 얼음 찬 4% PFA 20 분.
   2. 20 분 후 씻어 요리 1 x PBS 가진 5 분을 위한 3 시간. 최종 세척 후 0.05 %1 x PBS의 1 mL을 추가 나트륨 아 지 드.
   3. 32 X 단계 대조 현미경에 맹목적으로 요리를 분석 합니다. 총 셀과 neurites 하지만 재현할 수 위치에서 무작위로 선택한 3, 1 cm 행에 있는 셀을 계산 합니다. 적절 한 샘플링을 보장 하기 위해 요리 당 150 셀의 최소를 계산 합니다.
      참고:는 neurite은 세포 체에서 확장 (프로세스)로 정의 됩니다 > 2 셀 바디 직경 길이에서. 여러 프로세스가 있는 셀에 대 한 가장 긴 프로세스는 기준에 대 한 간주 됩니다. 프로세스와 셀 < 2 셀 바디 길이 직경 되지 않습니다 (그림 4) 포함.
   4. 함께 셀의 총 수와 neurites 셀의 총 개수에에서 추가 각 접시. Neurites 셀의 %를 계산 합니다. 평균 neurites 복제 요리에서 포함 된 셀의 비율. 때 각 접시 내 모든 행 비슷합니다, 그리고 요리 중 평균 표준 오차 (SEM) 의미의와 매우 유사한 실험의 재현성에 대 한 신뢰 설정 < 10%.
   5. 또는, neurites 베타-III-tubulin (TUJ1) 같은 표식에 대 한 immunocytochemistry를 실시 하 여 분석 또는 MAP2. 관심의 마커 얼룩 후 10 X 10 체계적으로 무작위 이미지 형광 현미경에 걸릴. 적어도 200 셀 이미지. 이 경우에 접시의 가장자리에 너무 가까이 하지 이미지 획득. TUJ1 또는 MAP2 + neurites (예를 들어 그림 10 참조)에 포함 된 셀의 비율을 분석 합니다.

6. NPC Neurosphere 마이그레이션 분석 결과

1. Neurosphere 형성
   1. 없는 코팅 기판으로 35 mm 접시에 100% 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다. 전에 셀 마이그레이션 분석 결과 대 한 충분 한 neurospheres 될 것입니다 도금 NPCs 준비 되도록 거기 2-3 접시 37 ° C에 적어도 15 분 동안 요리를 품 어.
      참고: 코팅 기판의 부재 NPCs neurosphere 형성을 위해 필수적 이다 미디어 정지 남아 보장 합니다. 코팅 요리 neurosphere 형성이 되지 것입니다.
   2. 리프트, 해리, 작은 셀 하는 단계에 부분을 참조 하십시오. 미리 데워 진된 100 %2-5 mL에 셀 펠 릿 resuspend 확장 미디어. 6.1.1 단원에 각 35 mm 접시에 1 백만 NPCs 플레이트.
   3. 집계 및 양식 neurospheres Npc 수 48-96 시간 37 ° C에서 Npc를 품 어. 단계 대조 현미경에 라이브 눈금자를 사용 하 여 영역 크기를 평가 합니다. 100 µ m (± 20 μ m)의 대략적인 직경에 도달 대부분 분야까지 기다립니다 (그림 5). 작은 분야 완전히 분산 하 고 마이그레이션 분석 결과 중 분리.
2. 접시의 Neurosphere 마이그레이션 분석 결과 대 한 준비
   1. 30% 확장 미디어의 6 mL에 ECM 모방 젤 aliquots (섹션 3.2 참조)을 분해. ECM 모방 gel/30% 확장 미디어 솔루션 준비 되 면 원하는 농도에서 차량, 성장 인자, 또는 관심사의 약물을 추가 합니다.
      참고: 차량, 마약, 그리고 성장 인자 농도 섹션 6.3에 neurospheres의 200 µ L의 추가 대 한 계정에 증가 해야 합니다.
   2. 플레이트 ECM-모방의 1 mL 6 잘 플레이트의 한 잘에 30% 확장 미디어 솔루션 (± 차량, 성장 인자, 또는 약물)를 젤. 실험 조건 당 2-3 웰 스를 확인 합니다. 또한, 35 mm 요리를 사용할 수 있습니다. 37 ° C^. 에서 적어도 30 분에 대 한 번호판을 품 어
      참고:이 분석 결과 대 한 확장 미디어 솔루션의 ECM 모방 gel/30%를 발음 하지 마십시오. 도금 분야 aspirated ECM 모방 젤에 신속 하 고 초과 마이그레이션 이어질 것입니다.
3. Neurospheres 도금
   1. 6.1 단원에서에서 형성 하는 neurospheres를 수집 하 고 원뿔 튜브에 넣어. 워시 모든 neurospheres를 위해 1 x PBS의 1 mL와 함께 요리를 수집 35 m m. 5 분 x 100g에서 수집 된 neurospheres 아래로 회전 합니다.
   2. 미리 데워 진된 30 %1-3 mL에는 neurospheres를 다시 중단 확장 미디어. Neurospheres의 1 접시, 수집 매체의 1 mL resuspend 분야에 사용 됩니다. 2 요리를 수집 하는 경우 미디어의 2 mL 분야를 resuspend에 추가 됩니다, 그리고 등 부드럽게 플라스틱만 P-1000 분야 깨진 되지 않습니다을 사용 하 여.
   3. ECM 모방 gel/30% 6.2 단원에서에서 만든 확장 솔루션으로 resuspended neurospheres의 200 μ 플레이트. 모든 방향으로 균일 하 게 배포 neurospheres 락 접시. 37^{° C에서} 48 h에 대 한 번호판을 품 어
   4. ECM 모방 gel/30% 확장 미디어 솔루션을 제거 하 고 4 %PFA, 세척, 및 계속 셀 PBS + 0.05% x 1에 있는 셀을 수정 나트륨 아 지 드.
4. Neurospheres의 분석
   1. 10 X에서 위상 대비 설정을 사용 하 여 전체 neurospheres의 이미지를 취득 합니다. 분야는 서로 감동 하지는 확인 하십시오. 평균 마이그레이션 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 측정 합니다.
   2. 자유형 선 도구를 사용 하 여 neurosphere의 외부 컨투어를 추적 합니다. 자유형 선 "직선" 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 액세스할 수 있습니다. 수동으로 추적 마우스를 사용 하 여입니다.
   3. 측정 함수를 사용 하 여 추적의 면적을 계산. "지역" 분석 탭 아래 "측정 설정" 창에서 읽기로 선택 되어 있는지 확인 합니다. 파란색으로 외부 컨투어 추적 그림 6 을 참조 하십시오.
   4. 추적 영역 및 측정 영역의 내부 세포 질량. 빨간색으로 내부 윤곽선의 추적 그림 6 을 참조 하십시오. 평균 마이그레이션 총 neurosphere 영역에서 안 세포 질량을 빼서 계량.
   5. 연속 카펫 (그림 6)로 마이그레이션 하는 세포 밀도가 포장된 안 세포 질량을 측정 neurospheres
   6. 양탄자 또는 측정 neurosphere에서 분리 된 세포를 포함 하지 마십시오. 예를 들어 외부 카펫 측정에서 제외 됩니다 (흰색에서 동그라미) 셀의 그림 6 을 참조 하십시오. 각 조건에 대해 20 neurospheres의 최소를 분석 합니다.

결과

이러한 연구의 한 목표 Npc, 즉, 셀 숫자 증가의 증식 활동을 정의 하는. 이것은 전체 세포 인구 세포 추출 물에 방사성 추적 tritiated 티 미 딘의 설립이 고 그들이 인지 S 단계에 종사 하는 모든 셀을 반영 하는 높은 처리량 접근 방식의 DNA 합성을 평가 함으로써 얻을 수 5 분 또는 전체 2 시간에 대 한 합성. 또한, 이러한 분석 실험 S-위상 및 총 세포 숫자, 단일 셀의 더 노동 집약적인 분석 결과 입력 하는 셀의 비율의 결정을 수 있습니다. 세포는 유사 분열 및 세포 분열, 세포 수를 증가 하기 위하여 발생 한다 앞 단계 S 단계에서 DNA 음성 합성. 이러한 프로세스에는 시간이 좀 걸릴, 이후 48 시간에서 평가 하는 DNA 합성에 변화 변화이 시간 포인트에서 핸드폰 번호에 연결 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 48 시간에서 DNA 합성에 변화 안정적으로 4-6 일에 세포 수의 증가 예측 발견 되었다.

토론

여기에 제시 된 프로토콜 기본 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하 고 성장 인자와 약물 hiPSC 파생 신경 선구자 세포를 사용 하 여 테스트를 신속 하 고 간단한 방법을 설명 합니다. hiPSC 기술 사는 영향을 받는 개인에서 인간의 신경 세포를 전례 없는 접근 제공 하 여 neurodevelopmental 질병의 병 인 연구를 혁명을 했다. 실제로, 레트 증후군, 티 모 증후군, 연약한 X 증후군을 포함 한 neurodevelopmental 장애의 수많은 hiPSC 연구 되었습니다 및 정신 분열 증, 질병 특정 차 모 수석에서 출토 있다, synapses, 그리고 신경 기능^{4,33,,3435,36}. 이러한 연구의 대부분...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PSC 신경 유도 매체 : 프로토콜 링크 : https://goo.gl/euub7a	ThermoFischer Scientific	A1647801	이 키트는 NB(Neurobasal) 배지와 50x NIS(Neural Induction Supplement)로 구성되어 있습니다. NIS는 1X 신경 유도 매체 및 100% 확장 매체
고급 DMEM/F12 매체	ThermoFischer Scientific	12634-010	구성 요소 100% 확장 매체
Neurobasal Medium	ThermoFischer Scientific	21103049	NIM 및 100% 확장 매체 구성 요소를
hESC 인증 Matrigel	Corning 354277		hESC 인증 세포외 기질-모방 겔 (ECM-mimic gel)
Y-27632 (2HCl), 1 mg	줄기세포 기술	72302	ROCK 억제제
6 웰 플레이트	Corning	COR-3506	폴리스티렌 플레이트는 NPC 유지 보수 및 신경구 이동 분석에 사용됩니다
24웰 플레이트	ThermoFischer Scientific	2021-05	폴리스티렌 플레이트: NPC DNA 합성 분석에 사용
35mm 접시	ThermoFischer Scientific	2021-01	폴리스티렌 플레이트: NPC S-상 진입 및 신경석염 분석에 사용
Natural Mouse Laminin	Invitrogen	23017-015	코팅 플레이트용 기질: NPC DNA 합성, S-상 진입 및 세포 수 분석
에 사용코팅 플레이트용 Fibronectin		Sigma F1141	기판: Neurite Assay에 사용
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899	코팅 플레이트용 기판
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFischer Scientific	15140122	항생제, NIM 구성 요소, 100% 확장 및 30% 확장 미디어
StemPro Accutase	Gibco	A11105-01	1X 세포 분리 솔루션
2.5% 트립신(10X)	Gibco	15090-046	10X 효소 용액
0.5 M EDTA	ThermoFischer Scientific	AM9261	DNA 합성 분석을 위한 세포 리프팅용 트립신 용액에 사용
트리티화 [3H]-티미딘	PerkinElmer	NET027E001	방사성 삼중수소, 티미딘
Fisherbrand 7mL HDPE 섬광 바이알	Fisherbrand	03-337-1	액체 섬광 계수용 바이알
EcoLite(+)	MP Biomedicals	0188247501	리퀴드 신틸레이션 칵테일
LS 6500 다목적 액체 섬광 카운터	Beckman Coulter	8043-30-1194	액체 섬광 카운터
Skatron 반자동 세포 수확기 유형 11019	분자 장치 및 스카트론 인스트루먼트, Inc.		반자동 세포 수확기
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 이미징 키트	ThermoFisher Scientific	C10337	EdU 및 S-Phase Entry Assay
용 염색 키트 Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061	세포의 생존력 평가
Grade GF/C 여과지	GE Healthcare Life Sciences, Whatman	1822-849	유리 섬유 여과지
인간 기본 FGF-2	Peprotech	100-18B	성장 인자
뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP-38)	BACHEM	H-8430	뉴로펩티드